Name: Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse In Situ Utilizzo del metodo TUNEL (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Scopri il rilevamento del danno al DNA nel muscolo scheletrico del topo con la tecnica TUNEL. Questo metodo permette di quantificare le rotture del DNA e la morte cellulare in modo rapido e specifico.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH-NINDS RO1-NS065895 e dalla sovvenzione NIH-NINDS 5-F31-NS076250-02. 
Ringraziamo JHU SOM Microscope Facility per l'uso del criostato.

NOTA: Tutte le procedure sugli animali descritti in questo protocollo sono state effettuate in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health 26. Il protocollo (MO13M391) è stato approvato dall&#39;Università Animal Care and Use Committee Johns Hopkins. Sacrificio 1. neonatale mouse, Dissection, e fissazione <ol><li> Sacrifica un mouse neonatale da CO 2 inalazione. </li><li> Immediatamente tagliare il arti posteriori sopra il ginocchio. Fino al giorno di circa 7 postnatale, le ossa delle gambe sono abbastanza morbido per tagliare con forbici grandi laboratorio o lama affilata e alla successiva sezione un criostato. </li><li> Posizionare il hindlimb in 10 ml di ghiaccio freddo 4% paraformaldeide in tampone fosfato salino (PBS) in una provetta da 15 ml. </li><li> Immersion fissare il arti posteriori in paraformaldeide per 4-24 ore a 4 ° C. Tessuti embrionali richiede solo alcune ores di fissazione. <ol><li> Evitare di fissaggio più di 24 ore, in quanto ciò potrebbe ridurre l&#39;efficienza TUNEL assay. </li></ol></li><li> Cryoprotect il arti posteriori immergendolo in una soluzione di saccarosio. <ol><li> Cambiare paraformaldeide al 10% di saccarosio in PBS nello stesso tubo 15 ml, incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Variazione al 30% di saccarosio in PBS, incubare una notte a 4 ° C o fino ai lavandini hindlimb al fondo della provetta. Tissue può essere lasciato nel 30% di saccarosio per un periodo più lungo, a condizione che il saccarosio è stata filtrata sterile. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Embedding <ol><li> Riempire uno stampo embedding metà marcato con mezzo di inclusione. </li><li> Inserire hindlimb sopra il mezzo di inclusione, con la parte tagliata il più vicino possibile ad una parete dello stampo. Contrassegnare l&#39;orientamento della arti posteriori sulla parte esterna dello stampo. <ol><li> Incorpora diverse arti posteriori e tagliare nello stesso blocco. Tuttavia, è importante assicurare che tutte hindlimbs nel blocco sono orientate parallelamente tra loro per ottenere sezioni in corrispondenza livelli lungo l&#39;asse dell&#39;arto. </li></ol></li><li> Coprire arti posteriori con mezzo di inclusione. Se zampe posteriori spostano durante il versamento del mezzo, ri-orientare con una pinza a punta smussata o uno stuzzicadenti. </li><li> Lasciare mezzo di inclusione per infiltrarsi tessuto a temperatura ambiente per almeno 15 min. </li><li> Mettere gli stampi direttamente in ghiaccio secco o in isopentano in ghiaccio secco per congelare mezzo di inclusione. Assicurarsi di mantenere il livello di stampi in ogni momento e di evitare lo spostamento del tessuto incorporato. </li><li> Mantenere stampi congelati a -80 ° C fino al momento di taglio, fino a diversi mesi. </li></ol> 3. criosezionamento incorporato Limbs <ol><li> Impostare temperatura della camera criostato a -20 ° C, la temperatura dell&#39;oggetto a -18 ° C; regolare la temperatura dell&#39;oggetto verso il basso, se necessario. </li><li> Portate il blocco di tessuto all&#39;interno della camera criostato per almeno 30 min. Blocco corretta temperaturaerature è fondamentale per la qualità sezione. </li><li> Tagliare sezioni trasversali ad uno spessore di 10 micron o meno. Sezioni spesse non saranno pienamente penetrati da reagenti TUNEL. Utilizzare la piastra anti-rollio, pale, e l&#39;angolo della lama (tipicamente 5 °), raccomandato per il criostato. </li><li> Raccogliere sezioni su gelatin- o vetrini vectabond rivestite a temperatura ambiente. Mettere subito in una scatola di diapositive in ghiaccio secco. Conservare la scatola diapositiva in un contenitore separato con ghiaccio secco posto in prossimità del criostato a portata di mano. <ol><li> Tagliare sezioni trasversali seriali attraverso l&#39;asse dell&#39;arto, saltare 100-200 micron. Raccogliere almeno 3 sezioni adiacenti a ciascun livello di serie. </li></ol></li></ol> 4. TUNEL test sulle sezioni degli arti posteriori utilizzando un kit in commercio Disponibile (tutte le misure a temperatura ambiente se non indicato) <ol><li> Scongelare vetrini con sezioni a temperatura ambiente e asciugare durante la notte o durante il fine settimana. </li><li> Reidratare sezioni di immersing vetrini in PBS per 2 x 10 min in una vaschetta Coplin. Asciugare con un laboratorio di pulire, rimuovere quanto più liquido intorno alla sezione possibile. </li><li> Sezioni permeabilize <ol><li> Utilizzare un non-proteolitici, reattivo a base di saponina commerciale oppure 0,5% e il 0,05% Tween20 Triton X100 in PBS. </li><li> Posizionare il vetrino in una camera umida. Una semplice camera umida è una scatola vuota puntale con un coperchio a tenuta, con acqua sufficiente a coprire appena aggiunto il fondo della scatola. </li><li> Pipetta abbastanza reattivo sul vetrino per coprire la sezione (50 ml è sufficiente per gli arti neonatali del mouse). Non pipettare direttamente sulla sezione, come agitazione ripetuta può provocare la sezione per sollevare la diapositiva. </li><li> Utilizzando pinze a punta smussata, posizionare un piccolo rettangolo di parafilm sulla parte superiore della sezione di diffondere la goccia di reagente e coprire completamente la sezione. Se le bolle si formano sotto la parafilm, delicatamente sollevarlo, asciutto, e riapplicare. </li><li> Incubare i vetrini con permeabilireattivo zione per 1 ora in una camera umida coperta. Se sezioni iniziano a sollevarsi dalla diapositiva, tempo di permeabilizzazione può essere ridotto a 30 min. </li><li> Lavare i vetrini in PBS in una vaschetta Coplin 2 x 5 min. I rettangoli parafilm dovrebbero fluttuare verso l&#39;alto e può quindi essere rimosso e scartato. </li><li> Utilizzando un laboratorio strofinata, asciugare quanto più liquido intorno sezioni possibili. </li></ol></li><li> DNA etichettatura pausa TdT-mediata <ol><li> Seguire le istruzioni del kit per fare 1x buffer di etichettatura TdT, pipetta abbastanza buffer di etichettatura sul vetrino per coprire la sezione di tessuto (50 ml è sufficiente per gli arti neonatali del mouse). Incubare nella camera umida per 5 min. In alternativa, immergere il vetrino in buffer di etichettatura TdT in una vaschetta Coplin. </li><li> Seguire le istruzioni del kit per fare TdT mix di etichettatura. Il kit comprende cobalto, magnesio, manganese e cationi; il catione manganese funziona bene su una varietà di tessuti, compresi i muscoli scheletrici, tiss sistema nervosoUES, il fegato, la pelle e ossa. </li><li> Per un controllo positivo, aggiungere DNase (etichetta &quot;nuclease&quot; nel kit) per il mix di etichettatura TdT. In alternativa, pre-trattamento di una sezione di controllo positivo con DNasi in tampone nucleasi per 1 ora a 37 ° C, secondo le istruzioni del kit. Tenere soluzione DNasi e sezioni DNasi trattati da altre sezioni sperimentali per evitare la contaminazione incrociata. </li><li> Per un controllo negativo, omettere TdT enzima dalla miscela etichettatura. </li><li> Utilizzare un laboratorio wipe per rimuovere la maggior quantità di buffer etichettatura TdT dalla diapositiva possibile. Pipettare TdT mix etichettatura sul vetrino (50 microlitri per sezione), coprire con un nuovo rettangolo di parafilm e incubare in camera umida a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Seguire le istruzioni del kit per fare tampone arresto 1x. Utilizzare un laboratorio pulire per rimuovere TdT mix etichettatura dalla diapositiva, e aggiungere 200-300 tampone di arresto microlitri per coprire la sezione di tessuto e incubare in camera umida per 5 min. Al<html> ternativa, immergere il vetrino in buffer di arresto in una vaschetta Coplin. </li><li> Lavare il vetrino 2 x 2 min in PBS. Utilizzare un laboratorio strofinata per rimuovere quanto più PBS dal vetrino possibile. </li></ol></li><li> Etichettatura fluorescente <ol><li> Seguire le istruzioni del kit per la preparazione soluzione di etichettatura fluoresceina etichettare dNTP a rotture del DNA. Soluzione Pipettare sul vetrino (50 microlitri per sezione), coprire con un nuovo rettangolo di parafilm e incubare in camera umida per 20 min. </li><li> Lavare il vetrino per 2 minuti in PBS in una vaschetta Coplin. Utilizzare un laboratorio strofinata per rimuovere il più possibile dal PBS diapositiva. </li><li> Diluire Hoechst 33258 colorazione nucleare a 1 mg / ml in PBS e pipetta sul vetrino (100-200 ml è sufficiente a coprire la sezione). Incubare nella camera umida per 5 min. </li><li> Lavare 3x per 5 min in PBS. </li><li> Coverslip con Antifade mezzi di montaggio fluorescenza e sigillare i bordi con smalto. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. Acquisizione Immagine Digitale <ol><li> Acquisire le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale con DAPI, FITC, e filtri Texas rossi (o equivalenti). Utilizzare un obiettivo più alto ingrandimento (20X o 40X) per verificare che l&#39;etichettatura era successo e nuclei (intatti o frammentati) sono stati etichettati. Un obiettivo 10X è sufficiente per la quantificazione di puncta TUNEL-positive. </li><li> Raccogliere immagini della colorazione Hoechst, TUNEL colorazione, e il segnale autofluorescenti come tre canali a falsi colori separati uniti in una sola immagine. Se l&#39;etichetta fluoroforo TUNEL è verde, segnale di immagine autofluorescenti nel filtro rosso, e viceversa. <ol><li> Mantenere tutte le impostazioni di imaging equivalente tra le diapositive per la successiva soglia e quantificazione. Per ogni filtro, i tempi prestabiliti e di esposizione di registrazione, il guadagno, e binning (senza binning è meglio); non utilizzare le impostazioni di esposizione o di guadagno automatico. </li><li> Usa-prove ed errori per trovare esposizione e guadagno impostazioni che meglio catturare la gamma di intenpiazzole in tutti i vetrini colorati. Assicurarsi che non vi siano pixel saturi nelle immagini acquisite, in modo da pregiudizi quantificazione. </li></ol></li><li> Prendere le immagini di tutto il gruppo muscolare di interesse. Questo può richiedere più immagini da &quot;cuciti&quot; insieme. </li></ol> Analisi 6. Immagine <ol><li> Utilizzare i programmi di analisi delle immagini disponibili in commercio per analizzare le immagini digitali di TUNEL colorazione. Analisi con software commerciale qui è mostrato. In alternativa, il software ImageJ esente da NIH può essere utilizzato per analizzare TUNEL colorazione. </li><li> Macchia una sezione adiacente alla sezione TUNEL macchiato con ematossilina eosina (H &amp; E) e prendere un full-sezione di immagine digitale con un microscopio campo chiaro convenzionale. Usa questa immagine H &amp; E in combinazione con un atlante di anatomia 5,18,19 tracciare le strutture anatomiche da quantificare. </li><li> Con il canale TUNEL spento, tracciare manualmente il contorno dell&#39;area da quantificare, utilizzandoHoechst e canali di autofluorescenza di orientamento. Convertire l&#39;area tracciata in una maschera (un insieme di pixel selezionato coordinate da analizzare). </li><li> Attivare il canale TUNEL. Utilizzando la funzione di intensità thresholding nel programma di analisi delle immagini, impostare la soglia inferiore di escludere tutti i segnali autofluorescenza. </li><li> Applicare le stesse impostazioni di soglia a tutte le immagini del set di studio. Convertire le selezioni thresholded in maschere. </li><li> Per ogni immagine, combinare la maschera zona muscolare e la maschera TUNEL. La nuova maschera combinazione rappresenterà segnale TUNEL all&#39;interno solo l&#39;area del muscolo tracciato. </li><li> Eseguire maschera quantificazione sulla maschera combinazione per determinare il numero di oggetti e l&#39;area del segnale TUNEL all&#39;interno dell&#39;area muscolare tracciata oggetto. Eseguire questo utilizzando la funzione Particle Analyzer in ImageJ. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un metodo per rilevare e analizzare quantitativamente DNA danni associata apoptosi nel topo muscoli scheletrici è descritto. La procedura prevede la raccolta dei tessuti, TUNEL colorazione, l&#39;acquisizione di immagini digitali, e l&#39;analisi delle immagini. Sono necessarie forniture istologiche comuni e strumenti, e uno speciale kit di TUNEL commerciale è necessario. Gli elementi essenziali necessari grandi apparecchiature sono un criostato, microscopio epifluorescente con capacità di immagine digitale, e un sistem...

Etichettatura fine nick Terminal deossinucleotidil transferasi (TdT) dUTP (TUNEL) è il processo di utilizzo dell&#39;enzima TdT allegare dUTP al 3 &#39;estremità del doppio e singolo filamento di DNA rompe 12,23. Il metodo TUNEL per il rilevamento di apoptosi e danni al DNA è stato segnalato prima oltre 20 anni fa da Gavrieli et al. 1,12,24. Da allora è stato valutato e ottimizzate in diverse preparazioni di tessuto 7,23,27,40. TUNEL è stato utilizzato per studiare ischemia indotta morte cellulare dei neuroni 6,14,29 e cardiomiociti 43,44, eccitotossico morte neuronale 30,31, e come biomarker nel trattamento dell&#39;artrite 39. E &#39;stato anche utilizzato come fattore prognostico e marker delle cellule tumorali in diversi tumori umani 2,3,15,32,37,38,42. Esistono metodi alternativi per il danno al DNA e la rilevazione morte cellulare, ma hanno sfide tecniche e avvertimenti. Southern blotting può essere utilizzato per quantifdanno al DNA y in tutto lisati tissutali 7,9-11, ma questo metodo non fornisce la risoluzione-livello cellulare ed è difficile da quantificare. Il Comet assay è un metodo a base di cellule alternativa che richiede l&#39;estrazione di nuclei conservati dalle cellule 4,20,28,36. Sebbene il saggio comet funziona bene su cellule isolate coltivate, è molto più difficile preparare nuclei intatti dal tessuto muscolare scheletrico 8,21. Come con la macchia del sud, il test della cometa non fornisce informazioni cell-tipo-specifica da un intero tessuto omogenato muscolare. Un&#39;altra alternativa al metodo TUNEL è immunoistochimica utilizzando anticorpi contro il DNA a singolo filamento 25,33,41 o contro le proteine ​​che partecipano a percorsi di DNA di risposta danno e morte cellulare (ad es p53, H2AX, e caspasi) 13,17,22,40. Tali metodi a base di anticorpi richiedono caratterizzazione completa di anticorpi ed eccellente anticorpo specificità per produrre un elevato rapporto segnale-background. Anche quando specEsistono anticorpi IFIC, possono richiedere la denaturazione delle proteine ​​bersaglio mediante procedure di recupero antigene 34,35. Mentre discutiamo qui, il recupero antigene risultati tessuto muscolare in inaccettabilmente alto autofluorescenza. A differenza dei metodi alternativi, TUNEL raggiunge DNA rilevamento dei danni con un segnale alto e basso fondo, eccellente specificità che può essere testato con semplici controlli positivi e negativi, buona penetrazione tissutale, che non richiedono il recupero dell&#39;antigene, e la risoluzione a livello cellulare. Inoltre, il metodo TUNEL dura circa 4 ore per completare, mentre i metodi alternativi in ​​genere richiedono incubazione durante la notte. Studiamo la morte delle cellule del muscolo scheletrico in un modello murino di atrofia muscolare spinale (SMA) 10 che è stato generato da Hsieh-Li e colleghi 16. Per quantificare cellule apoptotiche nel muscolo, abbiamo sviluppato un metodo di preparazione dei tessuti, la colorazione, e quantificazione che funziona robusto tra i diversi Skelegruppi muscolari Tal in diversi momenti dello sviluppo nei topi. Usiamo un kit TUNEL etichettatura disponibile in commercio e disponibile in commercio software di analisi dell&#39;immagine. Abbiamo anche utilizzato con successo il test TUNEL in combinazione con immunofluorescenza nel midollo spinale 10. I metodi descritti sono utili per gli investigatori che vogliono valutare la patologia dei tessuti, dei meccanismi della malattia, i meccanismi di invecchiamento, e di sviluppo (pre e post-natale) la morte cellulare nel muscolo scheletrico. La tecnica TUNEL è particolarmente utile per gli studi di danno e riparazione del DNA e morte cellulare in sistemi modello in cui solo un sottoinsieme di celle è colpita e risoluzione livello cellulare è necessaria. Questo video descrive la dissezione, processazione dei tessuti, sezionamento, e l&#39;etichettatura TUNEL basato sulla fluorescenza del mouse del muscolo scheletrico. Viene inoltre descritto un metodo di semi-automatico del segnale quantificazione TUNEL.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>19202</td><td>Per le procedure qui descritte, la soluzione al 4% è stata preparata fresca dalla polvere. Può essere utilizzata paraformaldeide di qualsiasi fornitore. La soluzione di formaldeide preparata deve essere conservata a 4 gradi; C e non deve essere utilizzato dopo la data di scadenza (fino a diversi mesi). La paraformaldeide è un agente cancerogeno e una tossina per inalazione e contatto con la pelle. Si prega di seguire le precauzioni specificate nella scheda di sicurezza quando si maneggia la paraformaldeide.</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Utilizzato per la crioprotezione dei tessuti prima del congelamento. Può essere utilizzato saccarosio di qualsiasi fornitore.</td></tr><tr><td>Composto O.C.T.</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Terreno di inclusione per criosezione.</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>Per i preparativi qui descritti è stato utilizzato un criostato Leica CM3050S. Qualsiasi criostato in grado di tagliare 10 &mu; possono essere utilizzate sezioni m.</td></tr><tr><td>Vetrini in vetro, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>È possibile utilizzare vetrini di qualsiasi fornitore.</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>La gelatina viene utilizzata per promuovere l'adesione della sezione di tessuto ai vetrini. Per rivestire i vetrini con gelatina, sciogliere 2,75 g di gelatina e 0,275 g di allume di cromo in 500 ml di acqua distillata, scaldare a 60 gradi; C, immergere i vetrini per alcuni secondi e lasciare asciugare. Può essere utilizzata gelatina di qualsiasi fornitore. In alternativa, è possibile acquistare vetrini prerivestiti con gelatina.</td></tr><tr><td>Il solfato di potassio di cromo (III) dodecaidrato (allume di cromo)</td> <td>Sigma</td><td>243361</td><td>allume di cromo viene aggiunto alla soluzione di gelatina per promuovere l'adesione dei tessuti sui vetrini. È un possibile cancerogeno e una tossina per inalazione e contatto con la pelle. Si prega di seguire le precauzioni specificate nella scheda di sicurezza quando si maneggia l'allume cromato.</td></tr><tr><td>Reagente di adesione tissutale Vectabond</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>Substrato opzionale per una migliore adesione dei tessuti ai vetrini; in alternativa possono essere utilizzati vetrini rivestiti di gelatina.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Un detergente utilizzato per permeabilizzare i tessuti. È possibile utilizzare Tween20 di qualsiasi fornitore.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Un detergente utilizzato per permeabilizzare i tessuti. È possibile utilizzare Triton X100 di qualsiasi fornitore.</td></tr>Kit per il <tr><td>rilevamento dell'apoptosi della fluoresceina TACS 2 TdT in situ</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>Kit commerciale per la marcatura TUNEL basata sulla fluorescenza.</td></tr><tr><td>DNasi/nucleasi</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(incluso nel kit)</td></tr><tr><td>DNasi/tampone nucleasi</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(incluso nel kit)</td></tr><tr><td>10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>Make 1x PBS per lavaggi e diluizioni. È possibile utilizzare PBS di qualsiasi fornitore.</td></tr><tr><td>Acqua priva di DNasi</td><td>Qualità Biologici</td><td>351-029-131</td><td>È possibile utilizzare acqua di qualsiasi fornitore.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>Colorante nucleare. Può essere utilizzato qualsiasi colorante nucleare fluorescente blu. Come colorante legante il DNA, l'Hoechst è un sospetto cancerogeno e deve essere maneggiato con dispositivi di protezione per ridurre al minimo il contatto con la pelle.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>multiplo</td><td>807</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi altra pellicola idrofoba o vetrino coprioggetto. Disponibile da più fornitori.</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza con fotocamera digitale</td><td></td><td></td> <td>può essere utilizzato qualsiasi microscopio a fluorescenza in grado di catturare digitalmente la fluorescenza rossa, verde e blu in canali separati.</td></tr><tr>È possibile utilizzare <td>i supporti antidissolvenza Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Antifade di qualsiasi fornitore.</td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti, spessore n. 1</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>Possono essere utilizzati vetrini coprioggetti di qualsiasi fornitore. La dimensione più piccola di 22 x 22 mm è sufficiente per le sezioni delle zampe del topo neonatale.</td></tr><tr><td>Smalto per unghie</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>Utilizzato per sigillare i vetrini. È possibile utilizzare smalti per unghie di qualsiasi fornitore (compresi i rivenditori regolari). Evitare l'uso di smalti per unghie con coloranti o additivi che possono riflettere la luce durante l'imaging fluorescente.</td></tr></tbody></table>

rilevamento e analisi del danno al dna nel muscolo scheletrico mouse in situ utilizzo del metodo tunel

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidil transferasi (TdT) deossiuridina trifosfato (dUTP) nick end labeling (TUNEL) è il metodo di utilizzo dell'enzima TdT per attaccare covalentemente una forma marcata di dUTP alle estremità 3' di rotture di DNA a doppio e singolo filamento nelle cellule. È un metodo affidabile e utile per rilevare il danno al DNA e la morte cellulare in situ. Questo video descrive la dissezione, l'elaborazione dei tessuti, il sezionamento e la marcatura TUNEL basata sulla fluorescenza del muscolo scheletrico del topo. Descrive anche un metodo di quantificazione semi-automatica del segnale TUNEL. Le normali caratteristiche intrinseche dei tessuti e le condizioni di lavorazione dei tessuti influenzano la capacità dell'enzima TdT di marcare in modo efficiente il DNA. L'elaborazione dei tessuti può anche aggiungere un'autofluorescenza indesiderata che interferirà con il rilevamento del segnale TUNEL. Pertanto, è importante determinare empiricamente i metodi di lavorazione dei tessuti e di marcatura TUNEL che produrranno il rapporto segnale/rumore ottimale per la successiva quantificazione. Il saggio basato sulla fluorescenza qui descritto fornisce un modo per escludere il segnale autofluorescente mediante sottrazione del canale digitale. Il test TUNEL, utilizzato con tecniche e controlli di processamento tissutale appropriati, è un metodo quantitativo relativamente veloce e riproducibile per rilevare l'apoptosi nei tessuti. Può essere utilizzato per confermare il danno al DNA e l'apoptosi come meccanismi patologici, per identificare i tipi di cellule colpite e per valutare l'efficacia dei trattamenti terapeutici in vivo.

Con la colorazione di successo, il segnale TUNEL-positivi dovrebbe essere abbastanza luminoso per isolare da autofluorescenza impostando soglie di intensità. Oggetti TUNEL-positive a basso ingrandimento possono apparire frammenti irregolari come brillanti nel muscolo scheletrico (Figura 1A). Tuttavia, a più alto ingrandimento, si devono osservare alcuni oggetti TUNEL-positivi con la classica morfologia apoptotica, se il tipo di morte cellulare in questione è l'apoptosi (Figura 1B). Il c...

Questo video descrive la dissezione, l'elaborazione dei tessuti, il sezionamento e l'etichettatura TUNEL basata sulla fluorescenza del muscolo scheletrico del topo. Descrive inoltre un metodo per l'analisi semi-automatica dell'etichettatura TUNEL.

Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse In Situ Utilizzo del metodo TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare le rotture del DNA e la morte cellulare nel C due. Ciò si ottiene mediante la prima permeazione delle sezioni di tessuto per consentire ai reagenti del tunnel di entrare nel nucleo cellulare. Successivamente, l'enzima TDT viene utilizzato per legare in modo covalente i DTP a tre estremità primarie delle rotture del DNA in queste cellule.Quindi il DUTP viene etichettato con una sonda fluorescente. In definitiva, il segnale positivo del tunnel viene quantificato in sezioni di tessuto che riflettono la frequenza relativa delle rotture del DNA nelle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il southern blotting o l'immunoistochimica, è che è relativamente veloce, specifica e fornisce un modo per eliminare il rumore e l'autofluorescenza.Inizia fissando gli arti posteriori isolati al 4% di para formaldeide in PBS in un tubo da 15 millilitri e lascia che la fissazione vada da quattro a un massimo di 24 ore a quattro gradi Celsius. Sono necessarie solo due ore se il tessuto è embrionale. Tuttavia, dopo la fissazione, sostituire la soluzione con il 10% di saccarosio per crioproteggere il tessuto e incubarla durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, cambiare la soluzione con saccarosio filtrato sterile al 30% e continuare l'incubazione durante la notte o fino a quando gli arti posteriori non affondano sul fondo della provetta. Durante l'incorporazione, è importante che gli arti posteriori siano completamente immersi nel mezzo di inclusione. Gli stampi per l'inclusione possono essere posizionati direttamente su ghiaccio secco o in isop pentano su ghiaccio secco per congelare il terreno.Durante la criosezione. I blocchi tagliano sezioni di trasferimento spesse 10 micron o più sottili, le sezioni più spesse non saranno penetrate dai reagenti di marcatura del tunnel. Raccogliere queste sezioni sottili su vetrini rivestiti di gelatina o legante vettoriale a temperatura ambiente.Molto rapidamente, trasferire i vetrini sul ghiaccio secco per la conservazione. Per prima cosa scongelare un vetrino di sezione di tessuto congelato a temperatura ambiente e lasciarlo asciugare per 16-64 ore. Una volta che il vetrino è a temperatura ambiente, reidratare la sezione in un barattolo di accoppiamento riempito di PBS per 10 minuti.Ripetere questa fase di reidratazione una volta, quindi asciugare accuratamente il vetrino con una salvietta da laboratorio senza disturbare la sezione di tessuto per permeare la sezione, posizionare il vetrino in una camera di umidità e pipettare 50 microlitri di reagenti commerciali a base di saponina non proteolitica sulla sezione. Non pipettare direttamente sulle sezioni in quanto potrebbe staccarsi o danneggiarsi. Quindi posizionare un piccolo pezzo di parapellicola sulla sezione per stendere il reagente.Se si formano delle bolle, riapplicare la pellicola para. Lasciare incubare il vetrino per un'ora dopo un'ora. Rimuovere i reagenti con due lavaggi di cinque minuti in PBS e asciugarli accuratamente.Accanto all'etichetta DNA si rompe con TDT, utilizzare un kit disponibile in commercio. Innanzitutto, creare un tampone XTDT e pipettarlo sulla sezione. Quindi incubare il vetrino per cinque minuti nella camera di umidificazione.In secondo luogo, preparare una miscela di etichettatura TDT secondo le istruzioni del kit o un vetrino di controllo positivo. Aggiungi il DNA al mix di etichettatura TDT. Per un vetrino di controllo negativo, omettere l'enzima TDT dalla miscela.A questo punto, con una salvietta, rimuovere la maggior quantità possibile di tampone dal vetrino e pipettarlo sulla miscela per etichette. 50 microlitri dovrebbero essere sufficienti. Anche in questo caso, spalmare la soluzione con paraform senza formare bolle.Lasciare incubare il vetrino nella camera per un'ora a 37 gradi Celsius. Terzo, crea il buffer one x stop secondo le istruzioni del kit. Dopo aver rimosso la miscela per l'etichettatura con la salvietta da laboratorio, aggiungere da due a 300 microlitri della miscela di arresto per coprire completamente la sezione.Quindi incubare il vetrino per cinque minuti nella camera. In questa fase non viene utilizzato alcun film para. Per rimuovere il tampone di arresto, utilizzare due lavaggi di due minuti in PBS.Ora pipettare 50 microlitri di soluzione di etichettatura con fluoresceina appena preparata. Sul vetrino, applicare il perfil e incubare per 20 minuti nella camera, ma questa volta al buio. Rimuovere la soluzione di etichettatura con un unico lavaggio di due minuti in PBS mentre il lavaggio diluisce alcuni ganci.3, 3, 2, 5, 8 a un microgrammo per millilitro in PBS. Dopo i lavaggi, coprire le sezioni con uno o 200 microlitri della soluzione di ganci diluiti. Quindi incubare il vetrino per cinque minuti, al riparo dalla luce per rimuovere i ganci da macchiare, utilizzare tre lavaggi da cinque minuti in PBS.Quindi asciugare accuratamente il vetrino con una salvietta da laboratorio e applicare un vetrino coprioggetti per l'imaging. Fotografa la sezione utilizzando i filtri dpi, fitzy e Texas red per separare la macchia dei ganci, la macchia del tunnel e i segnali di autofluorescenza in tre canali di falsi colori in un'unica immagine. Standardizza e mantieni le stesse impostazioni di imaging tra tutti i vetrini in modo che possano essere facilmente confrontati.Non utilizzare alcuna impostazione automatica di esposizione o guadagno per riferimento anatomico. Utilizzare un'immagine luminosa in campo chiaro di una sezione adiacente dell'arto posteriore colorata con h ed e nel software di analisi delle immagini. Chiudere il canale del tunnel.Successivamente tracciare manualmente il contorno dell'area muscolare da quantificare utilizzando gli altri canali. Converti l'area tracciata in una maschera. Quindi riattivare il canale tunnel e regolare la soglia minima di intensità per escludere il segnale autofluorescente.Utilizzare lo stesso limite di soglia su tutte le sezioni analizzate nello studio. Quindi, converti i pixel di soglia in una maschera. In ogni immagine, combina la maschera dell'area muscolare e la maschera del tunnel di soglia.Questo crea una rappresentazione del segnale del tunnel all'interno dell'area muscolare tracciata. Ora quantifica la maschera combinata per determinare il numero di oggetti positivi del tunnel e l'area totale dei pixel del segnale del tunnel all'interno del muscolo. Utilizzare questi valori per l'analisi statistica.Gli oggetti positivi al tunnel che a basso ingrandimento possono apparire come frammenti irregolari luminosi nel muscolo scheletrico. Tuttavia, a un ingrandimento più elevato, alcuni oggetti tunnel positivi con la classica morfologia apoptotica dovrebbero essere osservati se il tipo di morte cellulare coinvolgesse questa apoptosi. Il controllo positivo con l'aggiunta di D DNA dovrebbe mostrare un abbondante segnale positivo del tunnel distribuito uniformemente su tutti i tessuti.Nella sezione. Il controllo negativo senza l'enzima TDT dovrebbe avere un fondo di bassa intensità e mostrare solo autofluorescenza. Con il protocollo descritto, è stato riscontrato che le cellule ossee ed endoteliali dei globuli rossi hanno contribuito al segnale autofluorescente nelle sezioni degli arti superiori preparate.Il vero segnale positivo del tunnel era molto più intenso. Potrebbe essere isolato dal segnale autofluorescente utilizzando una soglia di intensità dei pixel. Un'altra opzione per isolare il segnale del tunnel era quella di sottrarre digitalmente il canale rosso di autofluorescenza dal canale del tunnel.Utilizzando questa tecnica, morte delle cellule muscolari scheletriche. In un modello murino di SMA è stato valutato, la marcatura del tunnel ha rivelato più cellule apoptotiche nei topi SMA di cinque giorni rispetto ai controlli. Quantificando la colorazione del tunnel, questa osservazione ha dimostrato di essere statisticamente significativa per più gruppi muscolari all'interno dell'arto posteriore.Una volta padroneggiata, la tecnica del tunnel può essere eseguita in circa quattro ore per generare risultati quantitativi affidabili.

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Qui descritte sono protocolli utilizzati per visualizzare il processo dinamico della MG53-mediata riparazione membrana cellulare in animali interi ed a livello cellulare. Questi metodi possono essere applicati per studiare la biologia cellulare della medesima membrana plasmatica e la medicina rigenerativa.

Visualizzazione di MG53-mediata di riparazione della membrana cellulare Utilizzando In vivo E In vitro Sistemi

In questo video, il test TUNEL viene eseguito per rilevare la presenza di cellule apoptotiche in un campione. Lo studio prevede l'utilizzo di una speciale DNA polimerasi - deossinucleotidil transferasi terminale - che catalizza l'aggiunta di dUTP marcate all'estremità 3' del DNA frammentato, che può essere osservato e identificato al microscopio a fluorescenza.

Marcatura terminale di dUTP Nick mediata dalla transferasi terminale: saggio TUNEL: un metodo in situ per rilevare la frammentazione del DNA nelle cellule apoptotiche

L'imaging spettroscopico elettronico può visualizzare e distinguere l'acido nucleico dalle proteine con una risoluzione nanometrica. Può essere combinato con il sistema miniSOG, che è in grado di marcare in modo specifico le proteine marcate in campioni di microscopia elettronica a trasmissione. Illustriamo l'uso di queste tecnologie utilizzando come esempio i fuochi di riparazione della rottura a doppio filamento.

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

Consecutivi crio-sezioni sono raccolti per consentire alle applicazioni istologiche e l'arricchimento di RNA per misure di espressione genica utilizzando zone adiacenti da un muscolo scheletrico singolo mouse. RNA di alta qualità si ottiene da 20 - 30 mg di criosezioni e le misure messe in comune sono direttamente confrontato tra le applicazioni.

Criosezionamento di regioni contigue di un muscolo scheletrico mouse unico per l&#39;espressione genica e analisi istologiche

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per rilevare entrambi senescenti e cellule staminali pluripotenti in muscolo scheletrico dopo un danno mentre induce in vivo riprogrammazione. Questo metodo è adatto per valutare il ruolo della senescenza cellulare durante rigenerazione tissutale e riprogrammazione in vivo.

Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico

Descritto qui è un protocollo per l'immunolabelling diretto delle minofibre necrotiche nelle criosezioni muscolari. Le cellule necrotiche sono permeabili alle proteine del siero, tra cui l'immunoglobulina G (IgG). Rivelare l'assorbimento di IgG da miofibre permette l'identificazione e la quantificazione delle miofibre che subiscono necrosi indipendentemente dalla condizione muscolare.

Immunolabelling Degenerazione di mitragliari nelle biopsie muscolari

Qui, proponiamo un metodo per ottenere in modo efficiente le singole fibre muscolari nelle prime fasi dello sviluppo post-natale dal mutante omozygoso lamin modello murino 8, un modello molto severo per la distrofia muscolare Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e cultura della miofibra singola da un modello Murine della distrofia muscolare di Emery-Dreifuss nei primi sviluppi post-Natal

L'elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico è un metodo praticabile per modulare l'espressione genica senza compromettere la contrattilità muscolare nei topi.

Elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo

Mantenere l'integrità del genoma dell'ovocita è necessario per garantire la fedeltà genetica nell'embrione risultante. Qui, presentiamo un protocollo accurato per rilevare le rotture del doppio filamento del DNA nelle cellule germinali femminili dei mammiferi.

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Il protocollo qui presentato consente l'identificazione e l'analisi ad alta dimensionalità delle cellule staminali muscolari e delle cellule progenitrici mediante citometria di massa a singola cellula e la loro purificazione mediante FACS per studi approfonditi della loro funzione. Questo approccio può essere applicato per studiare le dinamiche di rigenerazione in modelli di malattia e testare l'efficacia degli interventi farmacologici.

Identificazione e analisi di progenitori miogenici in vivo durante la lesione acuta del muscolo scheletrico mediante citometria di massa unicellulare ad alta dimensionalità

Iniezioni locali di un colorante mitocondriale con etichetta di dotante terminale di cellula di Schwann in vivo per microscopia confocale. Questo metodo utilizza prove di concetto dimostrate su tessuto muscolare scheletrico di topi con muscoli sani o malati per fornire una visualizzazione mitocondriale ad alta risoluzione.

Metodi per la quantificazione in situ della morfologia mitocondriale nelle cellule muscolari e terminali di Schwann di topi

Scopri il rilevamento del danno al DNA nel muscolo scheletrico del topo con la tecnica TUNEL. Questo metodo permette di quantificare le rotture del DNA e la morte cellulare in modo rapido e specifico.

Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse In Situ Utilizzo del metodo TUNEL

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