Derivazione efficiente di cellule retiniche epitelio pigmentato da cellule staminali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di derivare in modo riproducibile l'epitelio pigmentato retinico di alta qualità, o RPE, dalle cellule staminali. Ciò si ottiene coltivando prima le cellule staminali pluripotenti inducibili alla cofluenza. Nella seconda fase, il terreno viene modificato per dirigere le cellule verso i destini RPE.

Successivamente, le cellule RPE vengono isolate dalle altre cellule differenziate nella piastra, quindi le colture vengono espanse fino ad ottenere un numero sufficiente di cellule. In definitiva, la pigmentazione scura e le morfologie dei ciottoli delle colture possono essere utilizzate per confermare che le cellule RPE stanno raggiungendo la differenziazione terminale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la differenziazione spontanea, è che l'aggiunta di fattori definiti accelera la differenziazione, il tempo e aumenta la resa di RPE.

Ad oggi, migliaia di roditori sono stati curati utilizzando cellule RPE, derivate da una varietà di malattie degenerative della retina IPSA. Tuttavia, se traduciamo in modo efficiente ed efficace questo nel trattamento degli esseri umani nelle cliniche con queste malattie, è assolutamente imperativo sviluppare protocolli riproducibili ben stabiliti, che ci forniranno alta qualità, un alto numero di vendite di RPE e IPS La presentazione visiva di questo metodo è essenziale è che solo una persona può lavorare al microscopio sotto il cofano in un dato momento, rendendo difficile la visualizzazione della fase di isolamento. Mitchell Prince, un tecnico di ricerca del mio laboratorio, dimostrerà ora il protocollo associato agli aspetti della coltura digitale della procedura Per dirigere la differenziazione della coltura di RPE derivata da cellule staminali, la linea di cellule staminali di interesse su uno strato di cellule feeder embrionali di topo a due volte 10 alle sei cellule per pozzetto di una piastra a sei pozzetti, Permettere alle colonie di raggiungere la fluidità del COF e poi passare all'alimentazione quotidiana con differenziazione.

Terreno integrato con nicotinamide. Dopo tre settimane, iniziare ad aggiungere l'attivo in un o IDE alle poppate per migliorare la differenziazione dell'RPE. Due settimane dopo, tornare al mezzo di differenziazione e alla sola nicotinamide interrompendo le poppate quotidiane.

Una volta che gli indicatori di pH nel terreno smettono di ingiallire il giorno dopo l'alimentazione, rimettere la coltura nell'incubatrice fino a quando non compaiono occhielli delle cellule pigmentate abbastanza grandi da poter essere tagliati e rimossi. Per isolare gli occhielli pigmentati ricoprono successivamente, i pozzetti di una piastra a 24 pozzetti con una matrice priva di xeno che imita l'ambiente cellulare naturale. Quindi, riempire tutti i pozzetti della piastra a 24 pozzetti con il terreno di differenziazione necessario.

E in una cappa per colture cellulari, utilizzare un cannocchiale da dissezione e un bisturi per tagliare ogni occhiello pigmentato sul fondo della piastra originale in due o sei pezzi e afferrare le parti pigmentate con una pinza affilata e quindi trasferire uno o due pezzi pigmentati in ciascuno.24. Incubare bene la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre-cinque giorni fino a quando le cellule aderiscono. Quindi inizia a cambiare i media tre volte a settimana.

Espandi le cellule per tre o quattro settimane nel mezzo di differenziazione. Continuando ad alimentare le cellule tre volte alla settimana al passaggio. L'RPE aggiunge 200 microlitri di soluzione di dissociazione cellulare non tripsina preriscaldata a 37 gradi Celsius per staccare le cellule.

Dopo cinque-otto minuti, interrompere la reazione con nuovi mezzi di differenziazione e quindi risospendere le colture in sospensioni di singole cellule con una pipetta da 200 microlitri, raggruppando le colonie con poche cellule. Successivamente, trasferire le colonie dissociate in provette da 15 millilitri e far girare le cellule. I resospenditori dei pellet in tre millilitri di mezzi di differenziazione trasferiscono le colonie in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti codificata a matrice contenente tre millilitri aggiuntivi di mezzi di differenziazione per pozzetto.

Quindi espandere le cellule per una o due settimane fino a quando le cellule sono confluenti per circa il 90% e staccare nuovamente le cellule in un millilitro di soluzione di dissociazione come appena dimostrato. Questa volta. Utilizzando una pipetta da 1000 microlitri per risospendere le cellule, trasferire la soluzione di una singola cellula in una provetta conica da 50 millilitri.

E poi, dopo aver fatto girare di nuovo le celle, sospendere il pellet. In 18 millilitri di differenziazione, i terreni infine repl le cellule in un contenitore di coltura codificato a matrice per ottenere il numero massimo di cellule desiderate nel numero minimo di passaggi per ulteriori analisi a valle, le colonie pigmentate iniziano ad apparire dopo cinque-sette settimane di coltura di linee di cellule staminali pluripotenti inducibili. Queste colonie possono continuare a crescere per settimane man mano che le colture vengono mantenute.

Una volta raggiunta una dimensione sufficiente, possono essere asportati manualmente. Un'attenta escissione per evitare la contaminazione con cellule non RPE facilita notevolmente la generazione di colture di RPE sufficientemente pure. Una volta padroneggiate, è possibile derivare un gran numero di cellule RPE in 8-12 settimane se la tecnica viene eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fare attenzione a non contaminare le colture durante la produzione di terreni e l'alimentazione delle cellule. Dopo aver visto questo video, la nostra speranza è che molti di voi saranno in grado di produrre un gran numero di celle RPE di alta qualità da IPS. Si spera che ciò faciliterà una più rapida traslazione dal banco al letto del paziente e offrirà terapie cellulari ai pazienti affetti da malattie neovascolari degenerative della retina attualmente non curabili.