Imaging intravitale di assonale Interazioni con Microglia e macrofagi in un mouse Dorsale colonna Crush Injury

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare il movimento e l'interazione tra microglia, monociti e altri tipi di cellule nel midollo spinale danneggiato. Ciò si ottiene creando prima topi chimerici del midollo osseo che avranno microglia residenti o macrofagi derivati dal midollo osseo marcati con un marcatore fluorescente. Il secondo passo è produrre una lesione da schiacciamento della colonna dorsale nel midollo spinale.

Quindi gli animali vengono riaperti e il midollo spinale viene stabilizzato Per l'imaging multifotone, il passaggio finale consiste nello scattare immagini singole o filmati time-lapse all'interno della lesione. In definitiva, l'analisi delle immagini mostra il movimento cellulare e l'interazione cellulare con i substrati circostanti. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto alle tecniche tradizionali, come la coltura cellulare e il tessuto fissato, è che le cellule possono essere visualizzate nel loro ambiente complesso naturale nell'animale vivente.

Per questo intervento chirurgico, utilizzare animali chimerici o doppi transgenici. Vedere il protocollo di testo su come etichettare le cellule residenti o derivate dal midollo osseo dopo aver indotto l'anestesia, mantenerlo con fluoro ISO da uno a 2% per una frequenza respiratoria di circa 60-100 respiri al minuto. Ora, applica unguenti per gli occhi e conferma un piano chirurgico di anestesia con un pizzico di dito del piede.

Prepararsi per l'intervento chirurgico radendo prima l'area del midollo spinale mirata, quindi pulendo la pelle con iodio povidone e scrub alcolici al 70%, drappeggiare l'animale e praticare un foro per accedere al sito chirurgico. Quindi stendere gli strumenti dell'autoclave su un telo sterile. Ciò include una pinza numero quattro che è fissata a un millimetro tra i denti e ha segni a un millimetro dalle punte.

Ora potresti aprire la pelle sulla linea mediana usando le forbici dell'iride, esponendo la muscolatura. Procedere con l'intervento chirurgico al microscopio da dissezione. Lungo la linea mediana, taglia i muscoli della schiena dove si attaccano ai processi spinali dorsali con l'obiettivo di esporre la colonna vertebrale.

Ciò comporta il taglio del trapezio e dei legamenti del latisimus dorsi. Successivamente, rimuovere i muscoli rotatori tra i processi trasversali e il processo dorsale per rivelare la lamina della vertebra specifica che si desidera rimuovere. Qui è esposto il T 10.

Procedi inserendo le punte del giurato RO nello spazio sopra e sotto il processo. Quindi sollevare leggermente per assicurarsi che le punte siano saldamente in posizione e non troppo profonde. Quindi chiudere i giurati RO per rimuovere la lamina.

Ora, rimuovi tutte le parti più piccole della vertebra rimanente, allargando così l'apertura. Usando un ago calibro 30, praticare due fori, a un millimetro di distanza l'uno dall'altro, nella dura madre per creare un punto di accesso per la pinza fissa. Quindi inserire le pinze fisse con un angolo di 90 gradi attraverso la dura, mantenendo i segni sui denti sopra la dura.

Ora, pizzica chiudendo la pinza per 10 secondi. Fai la stretta di dieci secondi altre due volte e rimuovi il forcipe. Quindi, immergi un pezzo di gelatina assorbibile, una spugna compressa in soluzione salina e copri con essa il sito della lesione.

Chiudere il muscolo sopra la spugna di gelatina utilizzando le suture sintetiche non in nylon numero quattro. Quindi utilizzare clip per ferite da cinque millimetri per fissare la pelle. Completare la procedura con un'iniezione sottocutanea di 10 microlitri di bupivacaina in 490 microlitri di soluzione fisiologica per un milligrammo per chilogrammo.

Quindi iniettare cinque microlitri di buprenorfina nel muscolo gluteo per 100 microgrammi per chilogrammo. Postoperatorio. Riscalda l'animale e monitoralo finché non riprende conoscenza. Per riaprire l'animale per l'imaging, indurre l'anestesia come prima, quindi rimuovere le clip della ferita secondo le istruzioni del produttore.

Se necessario, applicare un prodotto per la depilazione sull'area intorno all'incisione. Questa volta, applica scrub extra con iodio povidone e alcol al 70%. Ora, riapri la pelle lungo l'incisione precedente.

Rimuovere i punti di sutura rimanenti e aprire i muscoli con una pinza usando le forbici secondo necessità. Al microscopio da dissezione, utilizzare le forbici per creare tasche per i morsetti del midollo spinale lungo i processi trasversali sulla vertebra, un livello sopra la laminectomia e un livello sotto la laminectomia. Inserire i morsetti dello stabilizzatore del midollo spinale attorno a ciascuna vertebra e serrare i morsetti.

Regolare i morsetti in modo che il midollo spinale sia parallelo alla piattaforma di imaging e che il tessuto sia stabile. Se si nota un artefatto respiratorio, regolare i morsetti per ridurre al minimo il movimento. Quindi coprire i morsetti e la paraforma.

Quindi, rimuovere delicatamente la schiuma di gel usando una pinza. Rimuovere il più possibile. Inoltre, rimuovere qualsiasi tessuto cicatriziale spesso sopra le meningi che potrebbe essere presente.

Una volta rimossa tutta la schiuma di gel, coprire il midollo spinale con soluzione fisiologica. Se si nota sanguinamento, utilizzare una spugna di gelatina per tamponare il sanguinamento. Se necessario, utilizzare il cauterizzazione durante la cauterizzazione.

Fare attenzione a non toccare il midollo spinale e tenerlo coperto con soluzione salina e schiuma di gel. Ora creare un pozzetto per trattenere il fluido di immersione, sigillare la pelle e i tessuti con adesivo cianoacrilato. Quindi costruire un pozzetto di acrilico dentale tra i due morsetti.

Lascia che il pozzo abbia il tempo di indurire. Una volta indurito, riempire il pozzetto con liquido cerebrospinale artificiale. Continui a monitorare il sanguinamento durante questi passaggi.

A questo punto, facoltativamente, iniettare i fuochi fluorescenti nella vena caudale. Per evidenziare i vasi sanguigni durante l'imaging, utilizzare un filamento DExT fluorescente sopra punti quantici da 70 kilodalton o lectine marcate in fluorescenza. Durante l'imaging, mantenere il mouse a 37 gradi Celsius in un ambiente controllato Sul palco del microscopio, i passaggi più critici per una preparazione di successo sono assicurarsi che il midollo spinale sia pulito, non sanguini e che non vi siano artefatti respiratori visibili.

Periodicamente durante l'imaging, controllare il livello di anestesia monitorando la respirazione dell'animale, che dovrebbe essere compresa tra 60 e 100 respiri al minuto. Correggere l'anestesia regolando i livelli ISO di fluoro. Dopo l'imaging, riportare l'animale nel sito chirurgico lì, rimuovere i morsetti spinali e staccare l'acrilico dalla pelle.

Il topo può quindi essere chiuso per l'imaging successivo alla fine dell'intervento chirurgico iniziale o essere soppresso cinque giorni dopo l'infortunio. I siti di inserimento del forcipe sono ancora visibili, ma la lesione ha iniziato ad aumentare di dimensioni a causa di una lesione secondaria causata dall'infiammazione. Gli assoni all'estremità della lesione si sono ritirati dal sito iniziale della lesione.

Contemporaneamente, un grande afflusso di cellule CX tre C one positive, microglia o macrofagi possono essere visti infiltrarsi dentro e intorno alla lesione di schiacciamento per discernere il comportamento di queste cellule all'interno del microambiente della lesione, è stato utilizzato per primo un modello di chimera di radiazioni. Le cellule progenitrici del midollo osseo di un topo CX tre CR e un topo GFP positivo sono state sostituite con cellule donatrici non fluorescenti, quindi solo la microglia residente nel SNC GFP positiva sarebbe stata visibile. In secondo luogo, le cellule progenitrici del midollo osseo in un topo non fluorescente sono state sostituite da cellule del midollo di un topo CX tre CR e un topo GFP positivo per visualizzare le cellule derivate dal midollo osseo.

Prima della lesione, le uniche cellule positive alla GFP derivate dal midollo osseo rilevate erano in gran parte paravascolari, che sono state segnalate per essere continuamente sostituite dal midollo osseo dopo la lesione da schiacciamento. CX tre cellule C una GFP positiva sono aumentate lungo l'interno dei vasi sanguigni che circondano la lesione. Inoltre, il centro della lesione è stato riempito con macrofagi infiltranti CX tre CR e GFP positivi.

Utilizzando questa tecnica, diversi animali transgenici possono essere utilizzati per marcare altre popolazioni di cellule fluorescenti per identificare le loro interazioni sia all'interno del midollo spinale che in altri modelli di malattia.