Name: Manipolazione del Cotton Rat in studi per la valutazione pre-clinica di oncolitici virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Impara una tecnica di manipolazione sicura per i ratti di cotone nei modelli preclinici. Questo metodo riduce lo stress durante la cattura utilizzando un tubo di arricchimento e un cesto in acciaio.

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Breanne Cuddington ha ricevuto una borsa di studio dalla Canadian Breast Cancer Foundation. Questo lavoro è stato sponsorizzato da sovvenzioni operative della Cancer Research Society e del Canadian Cancer Society Research Institute (ex Canadian Breast Cancer Research Alliance). Ringraziamo Ann Tollefson (Saint Louis University School of Medicine) per le cellule LCRT e la dottoressa Kathleen Delaney e Marion Corrick per l'assistenza tecnica con la stabulazione e la sedazione dei ratti di cotone.

NOTA: I protocolli utilizzati sono stati approvati dal nostro istituzionale Animal Research Ethics Consiglio della McMaster University in base al Canadian sugli orientamenti per la cura degli animali. Gli esperimenti sono stati condotti presso l&#39;impianto di McMaster University Central Animal. 1. Le celle Culturing LCRT <ol><li> Cellule Culture LCRT in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina. Mantenere le cellule in T-150 fiasche di coltura tissutale a 37 ° C e 5% di CO 2. Passaggio cellule quando formano un monostrato 90% confluenti (ogni 2-3 giorni, Figura 1). </li><li> Pre-caldo 1x tampone fosfato salino (PBS), 1x tripsina e medie in un bagno d&#39;acqua a 37 ° per 10 minuti prima di dividere le celle. </li><li> Aspirare il terreno dal pallone e lavare le cellule con 5 ml di 1x PBS. </li><li> Dopo il risciacquo, aspirare PBS e incubarecellule con 2 ml di tripsina 1x fino cellule dissociano dal pallone (~ 2 min). </li><li> Risospendere le cellule in 8 ml di mezzo (per un totale di sospensione cellulare 10 ml) e delicatamente pipettare su e giù per rompere grumi di cellule. </li><li> Mantenere cellule in un pallone T-150 mediante inseminazione di 1 ml di sospensione cellulare in 24 ml di mezzo (per un totale di 25 ml per T-150) e pallone roccia delicatamente da lato a lato. Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2 fino al prossimo divisione. </li></ol> 2. Valutare la replicazione del virus e citotossicità in cellule LCRT <ol><li> Replica Virus NOTA: costrutti virus che esprimono un tag fluorescenti, come la proteina verde fluorescente (GFP), sotto il controllo di promotori virali endogeni facilitano la visualizzazione di infezione da virus e diffondere con lettori di piastre a fluorescenza. <ol><li> Seed cellule LCRT in piastre di coltura, lasciando un bene per il conteggio. Cellule semi tale che essi saranno 80-90% confluenti un giorno in più. Utilizzare una concentrazione di 10 5 cells / ml (100 ml per pozzetto) per produrre la confluenza desiderato un giorno in più in 96 pozzetti piastre a fondo piatto. </li><li> Il giorno dopo, pre-caldo 1x PBS, 1x tripsina, terreno completo e privo di siero in un bagno d&#39;acqua a 37 ° per 10 minuti prima di iniziare l&#39;esperimento. </li><li> Aspirare il terreno dalle conteggio ben e risciacquo cellule con 5 ml di PBS 1x di oscillazione sopra la superficie del pozzetto. </li><li> Dopo il risciacquo, le cellule aspirare PBS e incubare con 2 ml di tripsina 1x fino cellule si dissociano dal pallone (~ 2 min). </li><li> Risospendere le cellule in volume appropriato di terreno completo per produrre una densità cellulare nell&#39;intervallo numerabile utilizzando un emocitometro. Per assicurare una conta cellulare accurata, mescolare la sospensione cellulare prima inoculando l&#39;emocitometro pipettando su e giù. </li><li> Determinare il volume del virus azione necessaria per l&#39;infezione alla molteplicità desiderata di infezione (MOI). Richiesto Paque Forming Unit (pfu) = numero di cellule placcato * MOI(Pfu / cell) Volume del virus magazzino required = richiesto pfu / virus magazzino titolo (pfu / ml) </li><li> Preparare inoculo virus in terreno privo di siero in tubi. Mescolare accuratamente con il vortex o pipettare prima di aggiungere inoculo alle cellule. </li><li> Infettare le cellule per 1 ora a 37 ° C, dopo di che applicare una sovrapposizione di DMEM + 1% FBS manutenzione. </li><li> Piastre di scansione uno e due giorni dopo l&#39;infezione (pi) di visualizzare GFP fluorescenza. </li></ol></li><li> Virus citotossicità NOTA: Eseguire il test di citotossicità resazurina in condizioni di scarsa illuminazione, come il composto è fotosensibile. Solo Un mezzo ben contenente dovrebbe essere inclusa per correggere fluorescenza di fondo. <ol><li> Preparare una soluzione al 5% (v / v) di resazurina in PBS 1x. Mescolare la soluzione pipettando. </li><li> Medio Aspirare dalle cellule e applicare la soluzione resazurina 5%. Includere un mezzo ben contenente solo per correggere per fluorescenza di fondo. </li><li> Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C, dopoche leggere la fluorescenza utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza (eccitazione 530 nm, emissione 595 nm). </li><li> Analizzare i dati relativi ai controlli non infetti correzione per fluorescenza di fondo. </li></ol></li></ol> 3. Housing and Handling <ol><li> Housing e dieta <ol><li> Ratti Cotton House individualmente a diminuire in-combattimenti in policarbonato gabbie ratto contenenti biancheria da letto di roditori (1/8 &quot;assestamento pannocchia), un tratto di non più di 8 pollici e nestlets come arricchimento tubi in PVC (Figura 2). </li><li> Usare un cestello in acciaio a protezione diretta a sedersi overtop della gabbia e contenere cibo roditori e una bottiglia d&#39;acqua. NOTA: Questa configurazione gabbia consentirà cattura sicuro e facile degli animali, con il posizionamento del tubo arricchimento contro l&#39;estremità dell&#39;essere gabbia della massima importanza. </li></ol></li><li> Trattamento <ol><li> Maniglia ratti cotone al mattino, prima di giro da parte dei tecnici degli impianti animale per evitare emozionante primauna procedura. </li><li> Durante tutte le procedure, indossare guanti di pelle di spessore per la protezione. </li><li> Come gli animali rimangono essenzialmente nei tubi di arricchimento, utilizzarli per trasferire i ratti in una nuova gabbia durante la pulizia di routine. In alternativa, aprire un po &#39;la gabbia per consentire al gestore di raggiungere la loro mano, l&#39;animale può essere trattenuta scruffing pelle appena sopra le spalle e spingendo verso il basso. Prestare attenzione a non usare forza eccessiva, come l&#39;animale può mordere la lingua. </li><li> Siate pazienti e utilizzare una mano ferma, come gli animali hanno una forte risposta di volo o di lotta e cercheranno di evitare la cattura da correre e saltare fuori dalla gabbia. È importante sottolineare che, non maneggiare gli animali per la coda, come si verificherà degloving. </li><li> Trappola gli animali nel loro arricchimenti tubi sopra manipolazione diretta. Questo diminuisce drasticamente lesioni e fuga. </li></ol></li></ol> 4. Acquisizione e Anestesia <ol><li> Cattura <ol><li> Indossare guanti di pelle di spessore per protezionelitio durante tutte le procedure. </li><li> Utilizzare un grande contenitore in plastica trasparente con fori per l&#39;aria ed un coperchio, una camera di induzione anestetica abbastanza grande da contenere il contenitore ed un cono montato sul tubo di uscita del gas (Figura 3). </li><li> Lavorano in coppia per rendere la procedura più efficiente e per diminuire il tempo di esposizione degli animali isoflurano, un anestetico per inalazione. Assicurarsi un ricercatore è responsabile per l&#39;apertura e la sostituzione della copertura in acciaio sulla gabbia e il coperchio della camera di induzione (gestore 1 #) e loro socio è responsabile per la cattura dell&#39;animale nel tubo e trasporto alla camera di induzione (gestore # 2). </li><li> Posizionare la gabbia su una superficie piana e rimuovere il coperchio esterno. Sollevare il vassoio di alimentazione inox leggermente e lentamente manovrare il tubo arricchimento quindi è parallelo ai lati della gabbia e contro la parte posteriore. Se necessario, utilizzare un oggetto per manovrare il tubo arricchimento senza aprire la gabbia per evitare agitare l&#39;animale (gestirer # 1). </li><li> Se l&#39;animale diventa agitato e lascia il tubo, lasciare il tempo sufficiente per l&#39;animale per rilassarsi e ancora una volta stabilirsi nel tubo (handler 1 #). </li><li> Lentamente e deliberatamente sollevare il bordo della copertura in acciaio lontano dal tubo arricchimento, mantenendo l&#39;altra estremità a contatto con la gabbia. Fare uno spazio sufficiente per il contenitore di plastica (handler 2 #). </li><li> In un movimento rapido e uniforme, spingere il contenitore di plastica overtop del tubo arricchimento. Mantenere il contatto del contenitore con il lato della gabbia, intrappolando l&#39;animale nel tubo. Eseguire i passi 4.1.6 e 4.1.7 il più rapidamente possibile (handler 2 #). </li><li> Rimuovere il vassoio di alimentazione in acciaio e dare il coperchio del contenitore di plastica per Handler 2 # (handler 1 #). Scorrere il coperchio di plastica tra il lato della gabbia e il contenitore, memori di appendici dell&#39;animale intrappolato nel processo. Non sigillare il contenitore come questo renderà il prossimo passo più difficile (handler # 2). </li></ol></li><li> Anesthesia <ol><li> Assicurarsi che il contenitore rimane chiuso e trasportare l&#39;animale alla camera di induzione. Introdurre rapidamente l&#39;animale in camera e rimuovere il coperchio del contenitore in un unico movimento fluido (handler 2 #). Aprire e sostituire immediatamente il coperchio della camera di induzione (handler # 1). </li><li> Accendere il flusso di isoflurano alla camera di induzione (5 L / min) e monitorare l&#39;animale segni di letargia, a questo punto rapidamente scorrono l&#39;animale dal tubo e contenitore, rimozione sia dalla camera di induzione per facilitare la circolazione del gas. </li><li> Quando il ratto è completamente anestetizzato, spostarlo nella superficie di lavoro e posizionare il naso e la bocca nel cono (Figura 3). Il ratto è completamente anestetizzato quando non risponde ad un pizzico punta forte. </li><li> Posizionare vet vaselina pomata oftalmica sugli occhi dell&#39;animale per prevenire la secchezza e abrasioni. Questo è un passo essenziale come i ratti di cotone hanno grandi occhi che possono essere a rischio di infezione in caso di ferite. </li> &lt;li&gt; monitorare attentamente e mantenere un ritmo di respirazione costante e garantire che il naso dell&#39;animale rimane nel naso cono del raccordo durante tutta la procedura. Regolare il flusso di isoflurano appropriato. La quantità di isoflurano richiesta per anestetizzare ogni animale varierà. </li><li> Post-procedura, tornare l&#39;animale a sua gabbia e assicurarsi che riacquista piena mobilità e decubito sternale. </li></ol></li></ol> 5. Preparazione di cellule LCRT per sottocutaneo Tumor Formazione NOTA: Un pallone T-150 LCRT (90% di confluenza) produce circa 2 x 10 7 cellule. Basate il numero di T-150 flaconi necessari sul numero totale di cellule necessarie. Seme flaconi supplementari per garantire il numero totale di cellule viene ottenuta e per ospitare cellule perse durante la preparazione e quelli necessari per iniezioni supplementari. Mantenere le cellule in ghiaccio ogniqualvolta possibile prolungare la vitalità cellulare. <ol><li> Per raccogliere le cellule, a medio aspirato dal un fiascod cellule Sciacquare con 5 ml di 1x PBS. </li><li> Aspirare PBS e incubare cellule con 2 ml di 1x tripsina fino cellule si dissociano dal pallone (~ 2 min). </li><li> Risospendere le cellule in 8 ml di mezzo (per un totale di sospensione cellulare 10 ml) e delicatamente pipettare su e giù per rompere grumi di cellule. Continuare a raccogliere le cellule da palloni supplementari. </li><li> Piscina tutto sospensioni cellulari in un tubo conico, circa 4 T-150s per tubo da 50 ml. </li><li> Centrifugare la provetta a 160 x g per 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirare medio e risospendere il pellet cellulare in volume appropriato di PBS (10 ml PBS per T-150) per produrre una densità cellulare all&#39;interno della gamma numerabile utilizzando un emocitometro. Per assicurare una conta cellulare accurata, mescolare la sospensione cellulare prima di caricare l&#39;emocitometro pipettando su e giù. </li><li> Calcolare il numero totale di cellule: Numero totale delle cellule raccolte = conta delle cellule (cellule / ml) x risospensione volume (ml) </li><li> Determinareil volume di sospensione cellulare richiesto per tutte le iniezioni. Effettuare 2-3 dosi extra per esperimento. Un totale di 5 x 10 5 cellule LCRT iniettate sottocute formerà tumori palpabili entro 3-4 giorni. Numero totale di celle richieste = 5 x 10 5 cellule x numero totale di dosi Sospensione cellulare Volume richiesto (ml) = (cellule totali richiesti * somma dei volumi di iniezione) / (numero totale di cellule raccolte) </li><li> Dispensare il volume richiesto di sospensione cellulare in un tubo conico contenente PBS e mescolare accuratamente. Aliquota iniezioni singole (100 microlitri) in provette Eppendorf. Mantenere i tubi in ghiaccio durante la procedura di iniezione. </li></ol> 6. Iniezioni NOTA: Eseguire le procedure con due ricercatori, uno per eseguire le iniezioni, mentre gli altri monitor frequenza respiratoria dell&#39;animale e la condizione generale, mentre sotto anestesia. Utilizzare siringhe da insulina (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) per tutte le iniezioni e un nuovo ago perogni animale. <ol><li> Iniezioni sottocutanee <ol><li> Cattura e anestetizzare l&#39;animale (sezione 4). </li><li> Shave il sito di iniezione con tagliaunghie. Cotton rat pelliccia è spessa e richiede un trimmer acuto per ottenere una superficie liscia per preparazioni iniettabili. Pulire il sito di iniezione con il 70% di etanolo con un batuffolo di cotone e lasciarlo evaporare completamente prima di procedere. </li><li> Siringhe di carico (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) con le cellule redazione lentamente e costantemente. Se le bolle sono flick evidenti la siringa con una certa forza. Una volta che le bolle sono premendo lo stantuffo alto finché il liquido è nella parte superiore dell&#39;ago. </li><li> Sollevare la pelle al sito di iniezione (denominato tenting pelle) e inserire l&#39;ago smusso verso l&#39;alto. Assicurarsi che l&#39;ago si muove liberamente sotto la pelle per evitare l&#39;iniezione intramuscolare. </li><li> Espellere il contenuto della siringa in modo uniforme e lentamente. Estrarre il lato smusso ago verso il basso. </li></ol></li><li> Iniezioni intratumorale <ol><li> Scattare unad anestetizzare l&#39;animale (sezione 4). </li><li> Pulire il sito di iniezione con il 70% di etanolo con un batuffolo di cotone e lasciarlo evaporare completamente prima di procedere. </li><li> Siringhe di carico (29 G 1/2 x &#39;, 0,3 ml) con l&#39;inoculo del virus elaborando lentamente e costantemente tenendo l&#39;ago in posizione verticale. Se le bolle sono flick evidenti la siringa con una certa forza. Una volta che le bolle sono premendo poi pistone sino all&#39;inizio del liquido è in cima dell&#39;ago. </li><li> Inserire il lato dell&#39;ago fino smusso nel tumore ed espellere il contenuto della siringa in modo uniforme e lentamente mentre si muove l&#39;ago in un modello a ventaglio, parzialmente estratto l&#39;ago prima di ogni movimento per evitare la lacerazione del tumore. Estrarre il lato smusso ago verso il basso. NOTA: i tumori LCRT sottocutanee sono in rapida crescita, raggiungendo circa 100 mm 3 in 5-7 giorni. Inoltre, necrotiche e emorragiche centri spesso formano sulla superficie del tumore entro diversi giorni e richiedono camonitoraggio Reful (Figura 4). </li></ol></li><li> Iniezioni intraperitoneali <ol><li> Cattura e anestetizzare l&#39;animale (sezione 4). </li><li> Pulire il sito di iniezione con il 70% di etanolo con tamponi di cotone e lasciarlo evaporare completamente prima di procedere. </li><li> Siringhe di carico (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) con la droga, elaborando lentamente e costantemente. Se le bolle sono flick evidenti la siringa con una certa forza. Una volta che le bolle sono premendo poi pistone sino all&#39;inizio del liquido è in cima dell&#39;ago. </li><li> Inserire l&#39;ago nel quadrante in basso a destra dell&#39;addome. Tirare indietro lo stantuffo per garantire che il sangue o feci non sono aspirati, ciò indica errato posizionamento dell&#39;ago. In questo caso, ritirare l&#39;ago e preparare una nuova siringa. Quando l&#39;ago è posizionato correttamente, di espellere il contenuto della siringa in modo uniforme e lentamente. </li></ol></li></ol> 7. Tumore escissione e Necropsy <ol><li> Raccogliere e pulire alstrumenti l con etanolo al 70% prima dell&#39;eutanasia dell&#39;animale. </li><li> Euthanize l&#39;animale con il metodo desiderato, si raccomanda CO 2 inalazione (2 L / min per 5-10 min). Esaminare l&#39;animale per eventuali anomalie nella condizione fisica. </li><li> Posto l&#39;animale in decubito dorsale su una tavola di dissezione e pulire l&#39;animale con il 70% di etanolo. </li><li> Utilizzare le pinzette per sollevare la pelle al basso addome. Tagliare la pelle ei muscoli con le forbici e fare un&#39;incisione mediale corre lungo dell&#39;animale (ano al mento). </li><li> Tagliare la gabbia toracica facendo due tagli, uno lateralmente sul lato della gabbia toracica e uno attraverso lo sterno per esporre cuore e polmoni. Esaminare i lobi dei polmoni per eventuali metastasi 27,29. </li><li> Esaminare tutti gli organi per le anomalie e registrare eventuali cambiamenti di colore, la dimensione e la consistenza. Se necessario, gli organi incidere con un bisturi per esaminare tessuti interni. In particolare, esamina il fegato, i reni, la milza e il tratto gastrointestinale. </li><li> Controllare i linfonodi per metastasi e l&#39;allargamento 27,29. </li><li> Per raccogliere il tumore, fare incisioni fianchi sopra e sotto il tumore in modo che la pelle può essere tirato via dal corpo con le pinzette. Tenendo saldamente la pelle con una pinzetta, utilizzare un bisturi per rimuovere accuratamente il tumore tagliando tra tumore e derma (Figura 5). </li><li> Posizionare immediatamente il tumore in un contenitore etichettato del 10% formalina tamponata neutra. </li><li> A seconda delle dimensioni del tumore, consentire 1-2 giorni (≤ 2 mm piccole) o 5-6 giorni (&gt; 2 mm grandi) di fissaggio prima di preparare sezioni per l&#39;analisi istologica (figura 6). </li></ol>

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</ol>

Gli autori riconoscono che non ci sono conflitti di interesse finanziari relativi a questa ricerca.

I ratti del cotone sono altamente eccitabili e hanno una forte risposta al volo. Pertanto, è necessario prestare particolare attenzione per ridurre al minimo qualsiasi stress eccessivo sull'animale. La configurazione della gabbia descritta consentirà una cattura facile e sicura degli animali, con il posizionamento del tubo di arricchimento della massima importanza. Quando si installano le gabbie, assicurarsi che i tubi di arricchimento soddisfino i requisiti di dimensioni e forma e siano posizionati con l'orientamento co...

Virus oncolitici (OV) replicano selettivamente nelle cellule tumorali sfruttando differenze biochimiche tra cellule normali e tumorali 1,2. Ci sono due tipi di VU: quelli che non necessitano di una mutazione per raggiungere oncolisi selettivo, denominato naturalmente allo wild-type virus e quelli che devono essere progettati per ottenere oncolisi selettiva. La collezione di mutazioni all&#39;interno di un determinato tipo di tumore determina la natura del vantaggio di crescita selettiva su cellule normali per OV 2. La sicurezza e vantaggio di utilizzare VU è stata dimostrata in studi clinici 3-7. Nonostante i progressi nel campo della viroterapia oncolytic esistono spazi vuoti tra i risultati pre-clinici e clinici, suggerendo che i modelli migliori sono necessari per valutare l&#39;efficacia antitumorale di VU. Bovine herpesvirus 1 (BHV-1) è un membro della famiglia Herpesviridae, e Alphaherpesviridae sottofamiglia. BHV-1 initiAtes bovina complesso malattie respiratorie nei bovini, manifestando in una grande varietà di sintomi che assomiglia ad un brutto raffreddore 8,9. BHV-1 si lega fissaggio e ingresso recettori utilizzati da HSV-1, come eparan solfato e nectin-1 10. Tuttavia, si lega CD155 nel luogo di nectin-2 10. BHV-1 ha una gamma di ospiti molto ristretta tale che sia in grado di entrare e avviare la replica in cellule murine normali e trasformate 3,4,10 efficiente. Questo rende l&#39;uso di modelli murini convenzionali problematico. La capacità di oncolytic BHV-1 è stata dimostrata in vitro 11,12. BHV-1 ha dimostrato di avviare la replica e uccidere le cellule tumorali umane da una varietà di origini istologici, comprese le cellule del cancro al seno e il cancro al seno avvio cellule 11,12. Tuttavia, la capacità antitumorale di BHV-1 deve essere valutata in vivo nel contesto di un ospite immunocompetente. Adenovirus umano (Ad), per il qualeci sono 57 sierotipi identificati, più comunemente provoca malattie respiratorie negli esseri umani. Ad vettori oncolitici sono stati valutati per la loro efficacia antitumorale con diversi avanzare in studi clinici 13-15. Nonostante i dati pre-clinici promettenti, i risultati clinici sono stati inferiori alle aspettative. Modelli xenotrapianto di tumori umani sono in genere utilizzati per studiare l&#39;efficacia antitumorale di vettori Ad, anche se esibiscono attenuate le risposte immunitarie al virus 16,17. Inoltre, i modelli murini singenici sono non-permissive all&#39;infezione annuncio, rendendo la valutazione della risposta immunitaria con questi modelli impraticabile 17,18. Il sistema immunitario dell&#39;ospite è stato identificato come il meccanismo più influente attraverso il quale VU suscitano tumorali morte cellulare 19. Risposte antitumorali tra tolleranti e l&#39;antigene associato al tumore non-tolleranti (TAA) modelli differiscono e possono influenzare notevolmente il successo della terapia OV. L&#39;HSV-1 OV KM100 (ICP0 N212VP16 nel 1814 20) 20,21 suscitato regressione del tumore nel 80% dei topi portatori di tumore in un murino antigene Polyoma Medio T modello di cancro mammario 22. Tuttavia, in HER-2 modelli / neu, l&#39;efficacia antitumorale di KM100 variava tra il 20% completa regressione nei topi singenici e tumore stasi transgenici, topi HER2-tolleranti. Insieme, questi dati evidenziano l&#39;importanza di valutare pienamente VU utilizzando modelli animali che meglio ricapitolano il paesaggio immunitario umano per comprendere appieno le caratteristiche che determinano il successo terapeutico. Il ratto di cotone (Sigmodon hispidus), indigeni del Nord e Sud America, è più comunemente usato come modello di infezione da virus respiratorio sinciziale (come rivisto in 5). Ratti di cotone sono utilizzati anche in-BHV-1 contro la ricerca di vaccinazione come ricapitolano la patologia associata a malattia respiratoria bovina complessa 6,23. Inoltre, BHV-1 infezione di ratti di cotoneè immunogenico, inducendo mucosa sostenuta e risposte immunitarie sistemiche 6,23-25. Le linee cellulari sono stati derivati ​​da fibrosarcoma spontanea e osteosarcomi della ghiandola mammaria (LCRT) e ossa (CCRT e VCRT), rispettivamente, 26. Cotone ratti sono stati utilizzati per valutare l&#39;efficacia in vivo di vettori Ad oncolytic come sono suscettibili all&#39;infezione annuncio ed esporre patologia simile all&#39;uomo 27-29. L&#39;uso di modelli immunocompromessi per la valutazione pre-clinica di VU non sono solo meno indicativo di risposte cliniche alla terapia ma non tengono conto del ruolo del sistema immunitario in viroterapia oncolitica 30,31. Pertanto, la singenici e modelli tumorali cotone ratto-tolleranti di carcinoma mammario e osteosarcoma sono modelli pertinenti a cui valutare l&#39;efficacia pre-clinica di VU, quali BHV-1 e Ad che non può essere studiata utilizzando modelli murini convenzionali.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medio&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca&nbsp;</td></tr><tr><td>1X soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Può essere preparato in laboratorio, filtrare per sterilizzare</td></tr><tr><td>200 mM di L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>100x antibiotico-antimicotico...</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>di siero fetale bovino</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>110-001-101HI</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>T-150cm2 pallone per colture tissutali</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-80</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>1X TypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari a 12 pozzetti, fondo piatto</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca, deve essere trattata per coltura tissutale</td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Life Tecnologie</td><td>DAL1025</td><td>Può utilizzare un reagente alternativo per la determinazione della vitalità cellulare</td></tr><tr><td>8640 Teklad 22/5 Dieta per roditori</td><td>Harlan</td><td>8640</td><td></td></tr><tr><td>1/8" lettiera per roditori di pannocchie di mais</td><td>Harlan</td><td>7092</td><td></td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Ancare-Realizzato</td><td></td> <td>in fibra di cotone vergine polpato, privo di polvere e autoclavabile</td></tr><tr><td>50 mL Provette coniche</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca, deve essere sterile</td></tr><tr><td>Isoflurano USP, 99,9 %, anestetico per inalazione</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>M60302</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanolo</td><td></td><td></td><td>Può preparare in laboratorio</td></tr><tr><td>10% Formalina tamponata neutra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>NAPCO NapFlow 1200 Classe II A/B3 Biosicurezza Microbiologica Armadio di sicurezza (cappa per colture cellulari)</td><td>NAPCO</td><td>Modello utilizzato non attualmente disponibile</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath Fisher</td><td> Modello scientifico</td><td>utilizzato non attualmente disponibile&nbsp;</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Reichert Bright-line Hemacytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Typhoon Trio BioAnalyzer&nbsp;</td><td>Modello GE Healthcare Life Sciences</td><td>utilizzato non attualmente disponibile&nbsp;</td><td>Può utilizzare qualsiasi lettore di piastre a fluorescenza</td></tr><tr><td>Tecan Safire2 Lettore di micropiastre a rilevamento multiplo</td><td>Modello Tecan</td><td>usato non attualmente disponibile&nbsp;</td><td>Può utilizzare qualsiasi lettore di piastre a fluorescenza</td></tr><tr><td>Centrifuga da banco Allegra 6R</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Macchina per anestesia da tavolo</td><td>VetEquip</td><td>Modello utilizzato non attualmente disponibile&nbsp;</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca, deve essere portatile</td></tr><tr><td>Wahl Peanut Mini Clippers</td><td>Wahl</td><td></td><td>Può utilizzare qualsiasi marca di piccoli clipper</td></tr><tr><td>Siringhe da insulina 29 G x 1/2', 0,3 mL</td><td>BD</td><td>329464</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca. Si consigliano siringhe da insulina in quanto facilitano le iniezioni attraverso il ratto" s pelle dura.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tamponi di cotone</td><td>MedPro</td><td>018-425</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione a punta affilata</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Pinze per tessuti da dissezione</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr></tbody></table>

manipolazione del cotton rat in studi per la valutazione pre-clinica di oncolitici virus

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

I virus oncolitici sono una nuova terapia antitumorale con la capacità di colpire le cellule tumorali, lasciando intatte le cellule sane. Affinché questa strategia abbia successo, studi recenti hanno dimostrato che il coinvolgimento del sistema immunitario dell'ospite è essenziale. Pertanto, la viroterapia oncolitica deve essere valutata nel contesto di un modello immunocompetente. Inoltre, lo studio di terapie antitumorali in modelli animali tollerati può riassumere meglio i risultati osservati negli studi clinici. I ratti di cotone, comunemente usati per studiare i virus respiratori, sono un modello interessante per studiare la viroterapia oncolitica poiché i modelli singenici del carcinoma mammario e dell'osteosarcoma sono ben consolidati. Tuttavia, mancano informazioni pubblicate sulla corretta procedura di manipolazione di questi roditori altamente eccitabili. L'approccio di manipolazione e cattura delineato riduce al minimo lo stress degli animali per facilitare la sperimentazione. Questa tecnica si basa sulla capacità del ricercatore di mantenere la calma durante la manipolazione e di eseguire le procedure in modo tempestivo. Infine, descriviamo come preparare le cellule tumorali mammarie di ratto di cotone per una formazione tumorale sottocutanea coerente e come eseguire iniezioni intratumorali e intraperitoneali. Questi metodi possono essere applicati a un'ampia gamma di studi che promuovono lo sviluppo del ratto del cotone come modello preclinico rilevante per lo studio della terapia antitumorale.

A causa della natura estremamente eccitabile di ratti cotone, essendo a conoscenza e utilizzando procedure ottimizzate per ridurre lo stress degli animali faciliterà nel loro uso come modello animale preclinico. L'uso di tecniche di manipolazione anche minimizzare i rischi per il ricercatore. Quando si utilizzano topi cotone è indispensabile per mantenere la calma. I ratti sono altamente eccitabile e tenteranno di sfuggire alla loro gabbia. L'uso di un tubo di arricchimento e nestlets minimi...

I ratti di cotone sono estremamente eccitabili e hanno una forte risposta di fuga o lotta. Viene descritto un metodo di manipolazione ottimizzato per ridurre lo stress degli animali che renderà i ratti di cotone più accessibili come modello preclinico.

Manipolazione del Cotton Rat in studi per la valutazione pre-clinica di oncolitici virus

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la manipolazione e la cattura sicura dei ratti del cotone utilizzando un metodo specifico volto a ridurre lo stress vissuto dall'animale. Ciò si ottiene posizionando prima un tubo di arricchimento contro l'estremità di una gabbia per topi e un cestello in acciaio sicuro sulla parte superiore. Nella seconda fase, viene indossato l'adeguato equipaggiamento di protezione individuale e il marmocchio di cotone viene lasciato strisciare nel tubo di arricchimento.Il tubo viene quindi tenuto contro il lato della gabbia e l'animale intrappolato viene rapidamente trasferito in un contenitore di plastica con fori per l'aria per il trasporto alla camera di induzione dell'anestetico. Nella fase finale, uno speciale cono nasale appositamente adattato al muso di marmocchio di cotone viene posizionato sull'animale per facilitare la sedazione completa. In definitiva, questa procedura di cattura può essere utilizzata per maneggiare in sicurezza i marmocchi di cotone in modo da ridurre il loro stress e aumentare la loro sicurezza.Quando si utilizzano questi roditori altamente eccitabili negli studi preclinici, generalmente gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa delle discrepanze nella letteratura per quanto riguarda la manipolazione, l'alloggio e il comportamento del ratto di cotone. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per completare i resoconti scritti per preparare i ricercatori alle sfide comportamentali nel lavorare con i ratti del cotone. A dimostrare la procedura saranno Brianne Cuttington, una studentessa laureata, e Meganer, una borsista post-dottorato del mio laboratorio Per ridurre i combattimenti, hanno ospitato i ratti di cotone individualmente in gabbie rack in policarbonato contenenti una lettiera di pannocchie di mais da un ottavo di pollice, una sezione di tubo in PVC non più lunga di otto pollici e nidi per l'arricchimento per consentire la cattura sicura e facile degli animali.Posiziona il tubo di arricchimento contro l'estremità della gabbia e poi posiziona un cestino raffermo sicuro sopra la parte superiore della gabbia contenente cibo per roditori e una bottiglia d'acqua. Ora raccogli un grande contenitore di plastica trasparente con fori per l'aria e un coperchio e una camera di induzione dell'anestetico, abbastanza grande da contenere il contenitore e un cono montato sul tubo di uscita del gas. Si noti che il marmocchio di cotone ha un muso allungato che richiede una forma diversa per erogare il gas anestetico, come raffigurato in questa immagine di un cono nasale, progettato per adattarsi correttamente a un ratto di cotone che lavora in coppia.I ricercatori dovrebbero indossare guanti di pelle spessa per proteggersi durante tutte le parti della procedura. Quando entrambi i ricercatori sono pronti, posiziona la gabbia dell'animale su una superficie piana e rimuovi il coperchio esterno. Quindi, quando l'animale è all'interno del tubo di arricchimento, sollevare leggermente la vaschetta di alimentazione in acciaio e manovrare lentamente il tubo fino a quando non è parallelo ai lati della gabbia e contro la parte posteriore.Successivamente, sollevare lentamente e deliberatamente il bordo del coperchio in acciaio più lontano dal tubo di arricchimento, mantenendo l'altra estremità a contatto con la gabbia. Chiedi al secondo ricercatore di creare uno spazio abbastanza grande per il contenitore di plastica. Quindi, con un movimento rapido e fluido, spingere la plastica e il contenitore sopra il tubo di arricchimento.Mantenere il contatto del contenitore con il lato della gabbia che intrappola l'animale nel tubo. Quando si maneggiano i ratti di cotone, è importante essere pazienti e usare una mano ferma poiché gli animali hanno una forte risposta di volo o di lotta, e cercherà di evitare la cattura correndo e saltando fuori dalla gabbia. Se un animale scappa, evita di maneggiarlo per la coda.Poiché può verificarsi lo sganciamento, rimuovere il vassoio di alimentazione in acciaio e dare il coperchio del contenitore di plastica all'altro ricercatore. Quindi far scorrere il coperchio di plastica tra il lato della gabbia e il contenitore. Prestare attenzione alle appendici dell'animale intrappolato durante il processo e chiudere, ma non sigillare il contenitore, assicurandosi che il contenitore rimanga chiuso.Trasportare l'animale nella camera di induzione. Quindi chiedi a un ricercatore di posizionare rapidamente l'animale nella camera e di rimuovere il coperchio del contenitore con un movimento fluido mentre l'altro si apre e sostituisce immediatamente il coperchio della camera di induzione. Infine, dopo la somministrazione dell'anestesia, riportare il ratto nella sua gabbia con monitoraggio fino a quando l'animale non riacquista la piena mobilità e si ricompone sternale.L'iniezione di cellule tumorali vitali è importante per la corretta formazione del tumore. In questa immagine, viene mostrato un monostrato sano di cellule LCRT che possono essere preparate per l'iniezione nei marmocchi di cotone. Al contrario, queste cellule LCRT hanno una bassa vitalità e non devono essere utilizzate per iniezioni.I tumori formati dalle cellule LCRT sono in rapida crescita e, di conseguenza, i centri necrotici spesso si formano come tali, la formazione del tumore deve essere monitorata attentamente per evitare ulcerazioni. Se si verifica un'ulcerazione, l'animale deve essere sacrificato per evitare l'infezione e la possibile morte per sepsi. Il mantenimento dell'integrità del tessuto tumorale dopo l'escissione si tradurrà in un campione che è una rappresentazione più accurata del tumore in vivo.Ad esempio, qui, viene mostrata una tecnica di escissione mediante la quale il tumore viene accuratamente separato dal tessuto circostante utilizzando un bisturi e una pinzetta, come mostrato in questa immagine finale. La struttura densa e altamente vascolarizzata del tumore viene mantenuta da questa tecnica di escissione, che è importante per l'analisi dei trattamenti che interessano la vascolarizzazione tumorale. Come nel caso di molti virus oncolitici Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere la calma e di eseguire ogni passaggio lentamente e deliberatamente per evitare di agitare i ratti di cotone.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come catturare e gestire in sicurezza i ratti del cotone.

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RNA interference (RNAi) possiede molti vantaggi rispetto knockout del gene ed è stato ampiamente utilizzato come strumento in studi di geni funzionali. L'invenzione di DNA vettoriale basata RNAi tecnologia ha fatto lungo termine e smontabile gene inducibile possibile, e anche aumentata la possibilità di silenziamento...

DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro

Il video dimostra la somministrazione locoregionale di virus oncolitici attraverso l'iniezione arteriosa epatica come approccio terapeutico per il carcinoma epatocellulare. Questi virus si replicano selettivamente nelle cellule tumorali, inducendo la lisi cellulare e rilasciando antigeni associati alle cellule tumorali. Questo processo innesca la morte cellulare immunogenica, inducendo una risposta antitumorale.

Targeting dei tumori epatici con virus oncolitici attraverso l'arteria epatica

Questo video dimostra la procedura di iniezione di virus chimerici dell'HIV nella corteccia del cervello di un ratto, dove l'RNA del virus si integra nel genoma dell'ospite, si replica e si diffonde per stabilire un'infezione da HIV attiva nel modello sperimentale.

Stabilire un'infezione da HIV attiva in un modello di ratto

Questo video dimostra il processo di iniezione di un vettore virale nel ratto substantia nigra per modellare il morbo di Parkinson. Delinea le fasi per la preparazione del ratto, la microiniezione del vettore virale nella substantia nigra e la procedura di recupero.

Un'iniezione di vettore virale nella substantia nigra del ratto per la modellazione della malattia neurodegenerativa

Questo protocollo descrive come silenziare temporaneamente e a distanza l'attività neuronale in regioni cerebrali discrete mentre i ratti sono impegnati in compiti di apprendimento e memoria. L'approccio combina la farmacogenetica (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) con un paradigma comportamentale (precondizionamento sensoriale) progettato per distinguere tra diverse componenti dell'apprendimento.

Un metodo per Remotely Silencing Neural Activity in Roditore Durante Fasi discreti di apprendimento

Le viroterapie oncolitiche sono in fase di sviluppo come nuove terapie per il trattamento del carcinoma epatocellulare (HCC).  Qui descriviamo un metodo per la terapia locoregionale dell'HCC tramite somministrazione arteriosa epatica del virus oncolitico.

Transarteriosa somministrazione di oncolitici virus per locoregionale Terapia delle ortotopico HCC in Rats

Metodi per una consegna del gene su larga scala del sistema nervoso centrale nel ratto sono coperti. In questo esempio, lo scopo è quello di imitare una malattia che colpisce l'intero midollo spinale. La trasduzione diffusa può essere utilizzata per fornire una proteina terapeutica al SNC da un'amministrazione periferica, una tantum.

Metodi e consigli per la somministrazione endovenosa di Virus Adeno-associato ai ratti e valutazione di trasduzione del sistema nervoso centrale

Qui descriviamo un protocollo per impiegando HTS RNAi per scoprire destinazioni di host che possono essere manipolate per migliorare la terapia virus oncolytic, specificamente terapia del rhabodvirus e del vaccinia virus, ma può essere facilmente adattata ad altri oncolytic piattaforme di virus o di scoperta di geni ospitanti che modulano la replicazione del virus in generale.

Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro dettagliato per la generazione ed ex vivo caratterizzazione dei virus oncolytic per espressione di immunomodulatori, usando i virus di morbillo codifica anticorpo cellula T ager come esempio. Applicazione e adattamento ad altre piattaforme di vettore e transgeni accelererà lo sviluppo di nuovi immunovirotherapeutics per la traduzione clinica.

Paramyxoviruses per l'immunomodulazione mirata tumore: progettazione e valutazione Ex Vivo

Abbiamo sviluppato un protocollo per la generazione e la valutazione di un modello murino NOG infettato da virus dell'immunodeficienza umana e umile basato sul trapianto di cellule staminali, sull'esposizione al virus dell'immunodeficienza umana intravaginale e sull'RNA PCR digitale a goccia e droplet Quantificazione.

Mitrai NOG umanizzati per l'esposizione all'HIV intravaginale e il trattamento dell'infezione da HIV

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un nuovo modello di ratto di infezione attiva da HIV utilizzando l'HIV chimerico (EcoHIV), che è fondamentale per migliorare la nostra comprensione dei serbatoi virali dell'HIV-1 nel cervello e offrire un sistema per studiare i disturbi neurocognitivi associati all'HIV e le comorbilità associate (cioè l'abuso di droghe).

Un modello di ratto di infezione cerebrale EcoHIV

Impara una tecnica di manipolazione sicura per i ratti di cotone nei modelli preclinici. Questo metodo riduce lo stress durante la cattura utilizzando un tubo di arricchimento e un cesto in acciaio.

Manipolazione del Cotton Rat in studi per la valutazione pre-clinica di oncolitici virus

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