Candida albicans Biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti Foreign Bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da Bioluminescence Imaging

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di convalidare l'uso di un ceppo che esprime luciferasi per il monitoraggio non invasivo della formazione di biofilm in vivo da parte di cellule di candida albican. Ciò si ottiene impiantando frammenti di catetere colonizzati con un ceppo di candida albicans che esprime luciferasi nella parte posteriore di un topo. Durante la seconda fase, il lievito viene lasciato crescere in uno spesso strato di cellule incorporate all'interno di una matrice extracellulare, generando un biofilm maturo all'interno dei cateteri.

Successivamente, viene aggiunto un substrato che verrà convertito dall'enzima luciferasi. Questa reazione produce luce misurabile: l'imaging bioluminescente o BLI viene quindi utilizzato per registrare e quantificare la formazione del biofilm all'interno dell'ospite vivente. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altre tecniche esistenti, come il sistema Venmo centrale, è che possiamo testare fino a sei biofilm all'interno di un animale, riducendo così notevolmente il numero di animali necessari per l'analisi statistica.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della formazione di biofilm di candida albicans, poiché il nostro metodo consente di testare facilmente componenti antifungini esistenti e nuovi. Inoltre, questo metodo può fornire informazioni sulla candida albicans, i biofilm fungini. Può anche essere applicato ad altri microbi come batteri o altre specie divertenti.

Le procedure proposte sono facili da implementare in qualsiasi laboratorio che abbia accesso a una struttura per animali 24 ore prima della procedura chirurgica, aprendo la confezione contenente i cateteri a triplo lume all'interno di una cabina di sicurezza biologica. Utilizzare una pinzetta sterile per rimuovere tutte le parti non necessarie e un bisturi sterile per tagliare la parte attaccata al catetere. Quindi posizionare un righello sotto la confezione di plastica e tagliare il catetere in poliuretano in pezzi lunghi un centimetro.

Successivamente, riempire ogni catetere con circa 1,8 millilitri di siero bovino fetale al 100% e incubare i pezzi a 37 gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva, trasferire ogni pezzo di catetere rivestito di siero in singole provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri e raschiare il C albicans da una piastra YPD in un millilitro di PBS in una provetta per microcentrifuga separata con una diluizione da uno a 100. Dopo il conteggio, diluire la sospensione cellulare a una concentrazione finale di cinque volte 10 per la quarta cellula per millilitro.

E aggiungere un millilitro di cellule a ciascuno dei pezzi di catetere rivestiti di siero. Lasciare che le cellule aderiscano ai cateteri per 90 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi tenendo i tubi in posizione verticale con una pinzetta sterile.

Sciacquare delicatamente ogni pezzo attraverso il lume due volte con un millilitro di PBS per posizionare i cateteri. Inizia radendo la parte bassa della schiena di un topo anestetizzato femmina di otto settimane posizionato su un termoforo. Quindi disinfettare la pelle e praticare una piccola incisione da 0,5 a un centimetro su ciascun lato dell'animale.

Successivamente, sezionare il sottocu con le forbici per creare due tunnel sottocutanei lunghi circa 1,5 centimetri e larghi un centimetro. Inserire tre pezzi di catetere in ciascun tunnel assicurandosi che i pezzi si trovino uno accanto all'altro in una disposizione orizzontale senza sovrapposizioni. Chiudere le incisioni con punti di sutura e poi pulire le ferite molto delicatamente con un disinfettante.

Quindi applicare un anestetico locale direttamente sulle incisioni e somministrare un agente anestetico che inverte l'anestesia, monitorando gli animali fino al loro completo recupero. Per visualizzare la formazione del biofilm al momento sperimentale appropriato, iniettare 100 microlitri di bobina appena preparata e terezin per via sottocutanea in ciascuna area contenente i cateteri in un animale anestetizzato. Acquisisci quindi scansioni consecutive con tempi di acquisizione che vanno dai 20 ai 60 secondi fino al raggiungimento della massima intensità del segnale.

Durante l'acquisizione del fotogramma successivo, posizionare una regione di interesse su ciascun trio di cateteri per misurare l'imaging bioluminescente o l'intensità del segnale BLI dei fotogrammi acquisiti in precedenza. Posiziona anche una regione rettangolare di interesse di dimensione fissa su una regione di controllo per misurare il segnale di fondo nel software di immagine vivente. Misurare il flusso di fotoni attraverso le regioni di interesse per ciascun trio di cateteri e per lo sfondo.

Dopo aver ripetuto queste misurazioni per ogni animale e in diversi punti temporali durante la formazione del biofilm, l'intensità del segnale BLI di ciascun trio di cateteri è il flusso di fotoni al secondo. I dati possono essere copiati e incollati direttamente in un foglio di calcolo. Al termine dell'esperimento longitudinale, sacrificare ogni animale tagliato attraverso il tessuto sottocutaneo e utilizzare una pinzetta sterile per rimuovere i frammenti del catetere uno per uno.

Lavare i cateteri due volte in un millilitro di PBS come appena dimostrato. Quindi sonicare i pezzi in una nuova provetta da microcentrifuga in un millilitro di PBS fresco a 40.000 hertz in un bagno d'acqua. Sonicare dopo 10 minuti, posizionare i tubi contenenti i cateteri sul ghiaccio e lastra 100 microlitri dei campioni originali a una diluizione da 1 a 10 e da una a 100 su piastre di agar YPD.

In duplicato. Infine, traccia la media e la deviazione standard delle unità formanti la colonia. E segnale BLI per ogni animale su scala logaritmica.

In questa immagine, viene mostrato un animale rappresentativo che mostra il segnale di bioluminescenza insieme a una regione di interesse indicata sei giorni dopo lo sviluppo del biofilm. Si noti la mancanza di segnalazione nell'area di fondo di controllo che conferma la limitazione del biofilm alle aree immediatamente adiacenti ai cateteri rivestiti di candida. In questo esperimento rappresentativo, si può osservare un chiaro segnale BLI prodotto dai biofilm che esprimono la luciferasi, mentre solo il segnale di fondo sembra essere prodotto dal ceppo wild type.

Questo aumento del segnale segue la stessa tendenza dell'aumento delle unità formanti colonie per biofilm e delle misurazioni del flusso di fotoni per ciascun gruppo di animali presi insieme. Questi dati illustrano che il BLI è una potente tecnica per monitorare e quantificare in vivo la formazione di biofilm di C albicans maturo in un modello murino sottocutaneo. Una volta padroneggiata, l'infezione dei dispositivi con cellule di candida può richiedere due ore, mentre l'impianto di catetere può essere eseguito in 10 minuti per topo.

L'imaging BLI può essere eseguito in cinque minuti per mouse. Il grande vantaggio dell'utilizzo di BLI è che è possibile monitorare ripetutamente lo sviluppo della biomassa e del biofilm nello stesso animale. Nel tempo Seguendo questa procedura, altri metodi come la risonanza magnetica o la TC possono fornire informazioni sull'esatta posizione della cattedrale.

Queste informazioni possono quindi essere utilizzate per la quantificazione in modelli più complessi come il modello della cattedrale della vena profonda. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come eseguire in vivo, biofilm sottocutaneo, ss nei topi, e questo potrebbe costituire la base per ulteriori analisi approfondite delle interazioni ospite-patogeno.