Name: Candida albicans Biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti Foreign Bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da Bioluminescence Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Scopri come monitorare lo sviluppo di biofilm di Candida albicans in vivo mediante imaging bioluminescente in un modello murino sottocutaneo. Questo metodo consente di quantificare la formazione del biofilm e testare terapie antifungine.

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Questo lavoro è stato supportato dal KU Leuven PF 'IMIR', dalla comunità di ricerca FWO sulla biologia e l'ecologia dei biofilm batterici e fungini (FWO: WO.026.11N) e dal progetto FWO G.0804.11. SK ringrazia KU Leuven per la borsa di studio PDMK 11/089 e FWO per la borsa di studio post-dottorato. Siamo grati a Nico Vangoethem per la sua assistenza nella preparazione delle figure. Ringraziamo Celia Lobo Romero per l'assistenza tecnica durante le procedure sperimentali in vivo.

NOTA: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico della KU Leuven (numero di progetto 090/2013). Mantenere gli animali in conformità con le linee guida KU Leuven cura degli animali. 1. C. albicans Crescita <ol><li> Ventiquattro ore prima dell&#39;inizio della sperimentazione animale, preparare piastre YPD aggiungendo 10 g di estratto di lievito granulato, 20 g di peptone batteriologica, e 15 g di agar granulare. Portare il volume a 900 ml con acqua Milli-Q e autoclave. </li><li> Aggiungere 50 ml di sterile al 40% di glucosio. Mescolare bene e versare in piastre di Petri. Lasciare piastre di agar per raffreddare e solidificare. NOTA: In questo studio, utilizzare due ceppi, cioè wild type C. albicans SC5314 - ceppo GLUC negativo (denominato WT) e C. albicans SKCA23 ceppo, che è un tipo C. selvaggia albicans SC5314 trasformato con Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide 22 .In questo ceppo (chiamato SKCA23- ACTgLuc) Gluc stato fuso al gene endogeno PGA59 sotto il controllo di ACT1 (actina) promotore (questo promotore è attiva nel lievito, nonché hyphal fase di crescita fungina). Questo ceppo può essere richiesto presso il laboratorio del Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belgio. Plasmidi Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide 22 è stata gentilmente donata dal Prof. C. d&#39;Enfert, Istituto Pasteur, Parigi, Francia. </li><li> Mantenere entrambi i ceppi in stock di glicerolo e conservare a -80 ° C. </li><li> Prima di eventuali ceppi esperimento striscia su un piatto YPD. Incubare la piastra a 37 ° C durante la notte. </li></ol> 2. catetere Pezzi Preparazione <ol><li> Prima dell&#39;esperimento, determinare quanti cateteri sono necessari. È possibile impiantare fino a 6 pezzi catetere per topo (3 cateteri a sinistra e 3 catetere sul lato destro dell&#39;animale (Figura 2A). </li><li> Ventiquattro ore prima dell&#39;intervento degli animali, aprire il paccoetà contenente Catetere triplo lume sotto la cappa di sicurezza biologica. Rimuovere tutti i componenti non necessari con le pinzette sterili e tagliare la parte collegata al catetere con un bisturi sterile. Posizionare righello sotto il pacchetto di plastica e tagliare pezzi di cateteri in poliuretano di esattamente 1 centimetro secondo la scala sul righello (Figura 1). NOTA: È importante ricordare che questo tipo di pezzo catetere non è fosforescente e quindi adatto per BLI 18,19. </li><li> Posizionare un massimo di 15 pezzi catetere taglio (passo. 2.2) in 2 ml microprovette. Sempre preparare 3 pezzi aggiuntivi, che vengono utilizzati per enumerare la quantità di cellule Candida allegati sul dispositivo dopo il periodo di aderenza. </li><li> Supplemento cateteri con circa 1,8 ml di siero fetale bovino 100% (FBS). </li><li> Vigorosamente vortice e aggiungere ulteriori 100-200 ml di 100% FBS. Coprire completamente tutti i pezzi catetere con siero. </li><li> Incubare a 37 ° C durante la notte. </li&gt; </ol> 3. Gli animali e la soppressione del sistema immunitario <ol><li> Tenere femmina BALB / c topi (circa 8 settimane di età) in ventilazione individuale top gabbie filtro con libero accesso al cibo normale e acqua ad libitum. </li><li> Avviare la soppressione del sistema immunitario 24 ore prima dell&#39;intervento chirurgico animale con l&#39;aggiunta di desametasone (0,4 mg / L) per l&#39;acqua potabile degli animali. Per evitare qualsiasi contaminazione batterica dell&#39;ospite, integrare l&#39;acqua potabile con antibiotici, per esempio, polvere di ampicillina sodio (0,5 g / L). </li><li> Mantenere immunosoppressione degli animali durante l&#39;intero esperimento (fino a 6 giorni). </li></ol> 4. Substrati poliuretano ex vivo C. albicans Adesione su FBS rivestite <ol><li> Trasferire ogni catetere pezzo di siero rivestite in un nuovo 1,5 ml provetta. </li><li> Raschiare alcuni C. cellule albicans coltivate su piastre YPD (Fase 1) e sospendere in 1 ml di PBS. </li><li> Diluire Cancellule Dida (1: 100) in una provetta separata. Prendere 10 ml di campione diluito e applicarlo su una camera conteggio delle cellule. Contare almeno 16 piccole piazze. </li><li> Preparare cellule Candida (ciascun ceppo separatamente) in terreno RPMI 1640 ad una concentrazione finale di 5 x 10 4 cellule / ml. </li><li> Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare per ogni catetere pezzo di siero-rivestito. </li><li> Vigorosamente VORTEX e assicurarsi che i cateteri sono immersi nel mezzo e non galleggia sulla parte superiore. </li><li> Incubare cateteri a 37 ° C per 90 min (periodo di adesione). </li><li> Rimuovere cateteri con pinzette sterili e lavare due volte con 1 ml di PBS. Durante questa fase assicurarsi che il liquido di lavaggio passa attraverso il lume mantenendo il catetere in posizione verticale mentre delicatamente lavaggio cateteri. Importante, non utilizzare un forte flusso che può portare alla rimozione di cellule attaccate. </li><li> Trasferire ogni catetere lavato in una provetta pulita (un pezzo per tuessere). </li><li> Mettere in ghiaccio e tenere lì fino chirurgia. </li></ol> 5. Anestesia <ol><li> Preparare anestesia mescolando 75 ml di ketamina (100 mg / ml) con 100 ml di medetomidina (1 mg / ml) e 825 ml di soluzione fisiologica sterile. Somministrare per via intraperitoneale (ip) 60-80 ml di cocktail anestetico per 10 g di peso corporeo, con un conseguente dose di 45-60 mg / kg ketamina e 0,6-0,8 mg / kg medetomidina. </li><li> Per l&#39;inversione di anestesia, diluire 50 microlitri atipamezolo (5 mg / ml) in 4,95 ml di soluzione salina, somministrare ip 100 microlitri per 10 g di peso corporeo come antidoto, risultante in una dose di 0,5 mg / kg. </li><li> Dopo l&#39;iniezione di anestesia, mettere l&#39;animale in una gabbia separata e attendere che sia completamente addormentato. </li><li> Verificare il corretto anestesia dell&#39;animale da pizzico pelle chiara e pizzico punta, che non causa alcun danno alla pelle. Qualsiasi movimento osservato che l&#39;animale non è sufficientemente anestetizzati per eseguire un intervento chirurgico. In questo caso, attendere un coupio di minuti in più fino a quando l&#39;animale non mostra alcun segno di movimento su pelle o del piede pizzico. </li></ol> 6. Chirurgia Animal <ol><li> Trasferimento anestetizzato animale dalla gabbia su un tessuto pulito posto sul rilievo di riscaldamento, pre-riscaldato a 37 ° C (Figura 2A, (1)). NOTA: Un&#39;alternativa più economica è quella di utilizzare le termocoperte. È anche possibile utilizzare tamponi isotermici, che devono essere riscaldati nel forno a microonde prima dell&#39;intervento animale. </li><li> Applicare pomata oftalmica sugli occhi. </li><li> Radere la schiena dell&#39;animale con un rasoio elettrico. Rimuovere tutti i peli di animali e trasferire animali su un panno pulito. Disinfettare la pelle (ad esempio, con 1% di iodio isopropanolo o clorexidina 0,5% nel 70% alcool) e lasciare la zona disinfettati per asciugare per circa 1 min (Figura 2A, (2)). </li><li> Effettuare una piccola incisione nella pelle (quella a sinistra e uno sul lato destro dell&#39;animale) (circa 0.5 &amp;# 8211; 1 cm) (Figura 2A, (3)). </li><li> Sezionare il sottocute con una forbice per creare due tunnel sottocutaneo. Ogni tunnel dovrebbe essere lunga circa 1,5 cm di lunghezza e 1 cm. </li><li> Inserire tre pezzi catetere, in precedenza infettati con Candida, in ogni tunnel. Assicurarsi che i cateteri giacciono uno accanto all&#39;altro in una disposizione orizzontale e che non coprono l&#39;altro per consentire l&#39;impianto di sei frammenti catetere in totale (Figura 2A, (4)). </li><li> Chiudere le incisioni con punti di sutura. In alternativa, utilizzare Dermabond per chiudere la ferita. </li><li> Disinfettare la ferita molto delicatamente con clorexidina 0,5% nel 70% alcool o con isopropanolo iodio (1%). </li><li> Applicare anestetico locale (gel xylocaina, 2%) direttamente sulla ferita. </li><li> Somministrare inversione di anestesia (protocollo 5, punto 2): per via intraperitoneale 100 microlitri per 10 g di peso corporeo. </li><li> Trasferimento animale a gabbia pulita precedentemente immesso su una piastra riscaldante. Mantenere l&#39;animaleseparata e caldo fino a quando l&#39;animale è completamente sveglio. Nel frattempo, continuare con l&#39;operazione e l&#39;impianto del prossimo animale. Una volta che tutti gli animali operati sono completamente sveglio. Trasferimento a una gabbia. Monitorare gli animali regolarmente. </li></ol> 7. bioluminescenza Imaging: Preparazione di coelenterazine (CTZ), il substrato per G. luciferasi princeps <ol><li> Preparare coelenterazine fresco (CTZ) stock soluzione sciogliendo 5 mg / ml CTZ in etanolo acidificato o secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Preparare la soluzione di lavoro 1.2 mM diluendo la soluzione madre 1:10 in PBS sterile. NOTA: Iniettare 100 ul CTZ soluzioni di lavoro per via sottocutanea nella zona circostante i cateteri. Utilizzare siringhe da insulina per iniezione sottocutanea di CTZ. </li><li> Tenere sempre CTZ al buio (ad esempio, coprire microprovette contenenti CTZ con foglio di alluminio). Conservare la soluzione madre a -80 ° C per tutta la durata degli esperimenti. </li></ol&gt; 8. Bioluminescence Imaging <ol><li> Inizializzare la fotocamera BLI. </li><li> Anestetizzare gli animali utilizzando una scatola di induzione. Utilizzare una miscela di gas di isoflurano in ossigeno, N 2 O / O 2, o aria a 2-3%. </li><li> Dopo l&#39;induzione, mantenere l&#39;anestesia nella casella induzione e nella camera di imaging a 1,5-2%. </li><li> Prima di iniziare la sessione di imaging, posizionare la piastra di imaging in posizione A, che corrisponde ad un FOV di 10 cm. Assicurarsi che la giusta posizione delle prese anestesia e animali ponendo un animale addormentato nella casella. </li><li> Prendere alcune fotografie fino animale è nella posizione desiderata di imaging, nel FOV destra sotto la telecamera. </li><li> Preparare due siringhe da insulina contenenti ciascuna 100 ml di soluzione di lavoro CTZ. </li><li> Inserire un animale in panchina e tenerlo addormentato mediante un cono forniscono anestesia gas. </li><li> Portare gli aghi delle siringhe in luogo circostante cateteri sottocutanea e iniettareCTZ simultaneamente sopra i cateteri. </li><li> Subito dopo l&#39;iniezione, collocare l&#39;animale sul piatto caldo nella casella fotocamera e avviare l&#39;acquisizione dell&#39;immagine bioluminescenza. </li><li> Acquisire scansioni consecutive con tempi di acquisizione da 20 a 60 sec (a seconda dell&#39;intensità del segnale) fino al raggiungimento della massima intensità del segnale. Durante l&#39;acquisizione del frame successivo, misurare l&#39;intensità del segnale BLI dei telai precedentemente acquisiti posizionando una ROI su ogni cateteri trio e misurando il flusso di fotoni attraverso questo ROI. </li><li> Ripetere dal punto 7 per l&#39;animale successivo (s). </li><li> Dopo l&#39;imaging, ritorno degli animali alla loro gabbia. Ripetere BLI durante il corso di un esperimento per longitudinale, non invasivo di follow-up di formazione di biofilm. </li><li> Analizzare i dati BLI con Living software immagine. Posizionare un ROI rettangolare di dimensioni fisse su ogni trio catetere e misurare il flusso di fotoni (radianza) attraverso ogni ROI. Ripetere questa operazione per ogni animale. </li><li> Relazionel&#39;intensità del segnale BLI di ogni trio catetere fotoni flusso per secondo. Rappresentare i dati BLI su scala logaritmica tracciando la media e la deviazione standard del flusso di fotoni al secondo per ciascun gruppo. Effettuare analisi statistiche sui log 10 dati trasformati. </li></ol> 9. Catetere Espianto <ol><li> Preparare provette da microcentrifuga contenente 1 ml di PBS, uno per ciascun dispositivo catetere e tenerli su ghiaccio. </li><li> Euthanize gli animali per dislocazione cervicale (Figura 2B, (1)). </li><li> Disinfettare la pelle del dorso con 0,5% clorexidina nel 70% alcool o con isopropanolo iodio (1%). </li><li> Praticare un&#39;incisione (circa 3 cm) al di sopra dei cateteri. </li><li> Tagliare il tessuto sottocutaneo e rimuovere i frammenti catetere uno per uno da sotto il tessuto sottocutaneo usando pinzette sterili (Figura 2B, (2)). </li><li> Maniglia catetere delicatamente in posizione verticale e lavarlo due volte con 1 ml di PBS sterile. Posizionare ogni cateterepezzo una provetta separata (preparata al punto 1). </li></ol> 10. Le cellule Quantificazione dei biofilm associati di Colony Forming Count Units (CFU) e analisi statistica dei risultati <ol><li> Cateteri Sonicare precedentemente inseriti in 1 ml di PBS per 10 minuti a 40.000 Hz in un sonicatore bagnomaria e disporli sul ghiaccio. </li><li> Dopo sonicazione, vigorosamente vortex per 30 sec e il luogo di nuovo sul ghiaccio. </li><li> Preparare due microprovette supplementari contenenti 900 ml di PBS. </li><li> Fare 1:10 e 1: 100 diluizioni dal vostro campione originale (quella che contiene il catetere) e mantenere tutte le microprovette su ghiaccio. </li><li> Piatto 100 ml di campioni originali, 1:10 e 1: 100 diluizioni su piastre di agar YPD in duplicato. </li><li> Incubare le piastre per 2 giorni a 37 ° C e contare CFU. </li><li> Contare le colonie cresciute su piastre di agar YPD (quantità numerabile di colonie, massimo 300 colonie / piastra) e moltiplicare per il corretto Dilufattore di (1x-originale, 10x o di diluizione 100x). Ulteriori moltiplicare ogni pezzo catetere 10x, che corrisponde alla quantità finale di colonie in 1 ml provetta contenente il catetere. Portare l&#39;importo finale delle colonie di accedere a 10 cellule / pezzo catetere con deviazione standard (SD). Esprimere i dati come media ± SD. </li><li> Mettere tutti i valori per ogni catetere e gruppo specifico in un foglio di calcolo e / o statistico, effettuare i calcoli di cui sopra e le analisi statistiche. Indicare gruppi specifici di confrontare, cioè WT vs mutante o 2 giorni contro. 6 giorni di formazione di biofilm e di eseguire il test t spaiato e ANOVA con il post-test Tukey sui dati log10-trasformati. <ol><li> Esprimere il livello di significatività per un valore p. In questo studio indicano la significatività se il valore p &lt;0,05, rappresentato come segue: * p &lt;0.05, ** p &lt;0.005, *** p &lt;0,0005. </li></ol></li></ol>

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<li>Van Wijngaerden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+body+infection%3A+a+new+rat+model+for+prophylaxis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment.</a> J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

L&#39;uso di modelli animali, e in particolare i modelli di roditori, per gli studi dedicati a biofilm microbici è molto importante in quanto il sistema immunitario dell&#39;ospite è un fattore essenziale nella formazione di biofilm che i modelli in vitro non possono spiegare. In questo studio, descriviamo un relativamente semplice sottocutanea C. albicans modello murino biofilm, che può essere facilmente adottata in un laboratorio di ricerca e non richiede forti competenze tecniche. Questo modello è s...

Candida albicans è un organismo commensale, che può essere trovato in differenti siti di individui sani, per esempio sulla pelle o come parte della flora gastrointestinale e vaginale. Tuttavia, in ospedalizzati, e specialmente immunocompromessi pazienti, può causare una vasta gamma di infezioni 1. In questi individui, il sistema immunitario indebolito permette alle cellule di Candida per diffondere nel flusso sanguigno e di invadere i tessuti più profondi che causano infezioni pericolose per la vita. Inoltre, la presenza di substrati abiotici quali cateteri venosi centrali e delle vie urinarie, valvole cardiache artificiali e fughe può fornire una nicchia per Candida fissaggio 2. Adesione a tali supporti è un prerequisito per l&#39;ulteriore sviluppo del biofilm, che rappresenta uno strato di cellule di lievito e ifali incorporati in materiale polimerico extracellulare, principalmente da polisaccaridi 2. C. catetere -associated infezioni albicanssono associati con alto tasso di mortalità. Una caratteristica generale del biofilm è la loro ridotta sensibilità al antimicotici noti, come azoli 3,4. Solo nuove classi di farmaci antifungini, come echinocandine e la formulazione liposomiale di amfotericina B ha dimostrato di essere attivo contro le infezioni da catetere-associate 5-7. A causa di biofilm resilienza di antimicotici, approcci terapeutici sono molto limitate, spesso conduce a rimozione del catetere e la successiva sostituzione come una soluzione unica. La maggior parte della nostra attuale comprensione della C. sviluppo biofilm albicans proviene da studi in vitro su substrati abiotici come polistirolo, o plastiche utilizzate per la fabbricazione di dispositivi sopra menzionati, cioè, silicone, poliuretano 2. Questi modelli sono abbastanza avanzato e cercare di simulare la situazione in vivo il più possibile. Tuttavia, questi sistemi non comportano il continuo flusso di sangue e tl sistema immunitario dell&#39;ospite. Questo ha portato allo sviluppo di sistemi modello in vivo, come il modello catetere venoso centrale (CVC) 8-10, il modello stomatite protesi di candidosi orale 11 e un modello murino per catetere associato candiduria 12. Inoltre, C. sviluppo biofilm albicans è stato studiato in vivo sulle superfici mucose, come quelli dalla vagina 13 e 14 della cavità orale. Il nostro laboratorio ha contribuito con la costituzione di un C. sottocutaneo Modello biofilm albicans, che si basa sull&#39;impianto di pezzi catetere infetti sul retro Sprague Dawley 15. Questo modello è stato utilizzato con successo nel nostro laboratorio per testare la suscettibilità biofilm di fluconazolo e echinocandine farmaci 5,16, per studiare l&#39;effetto della terapia combinatoria di diclofenac e caspofungin 17. Più di recente, abbiamo adattato il sistema per l&#39;utilizzo in BALB / c topi 18,19. Inconfronto con altri modelli in vivo, il vantaggio principale di questo modello sottocutanea è la possibilità di studiare più biofilm per animale sviluppato all&#39;interno del lume del catetere pezzi impiantati. Per ridurre il numero di animali da laboratorio, abbiamo adattato questo modello per studiare lo sviluppo di C. albicans biofilm non invasivo mediante bioluminescenza (BLI) 18,19. Questo metodo ha dimostrato di essere una tecnica potente, che può essere usato per quantificare biofilm misurando il segnale specifico BLI alla regione di interesse (nel nostro caso la zona di cateteri impiantati), evitando il sacrificio di animali. Rispetto ai batteri, che può esprimere sia il gene e il substrato richiesta per la reazione bioluminescenza causa dell&#39;introduzione di una specifica lux operone 20, la maggior parte degli organismi eucarioti, comprese C. albicans, dipendono l&#39;espressione eterologa di un gene luciferasi accoppiato con ilgestione esterna di un substrato specifico, come D-luciferina o coelenterazine 21. Probabilmente a causa della presenza della parete cellulare fungina e C. albicans morfogenesi, la consegna intracellulare del substrato per l&#39;enzima luciferasi era una sfida principale 21. Per risolvere questo problema, Enjalbert et al. 22 progettato un ceppo in cui un C. sintetica albicans versione codone ottimizzata del gene per la naturale secreto Gaussia princeps luciferasi (Gluc) è stata fusa al C. gene albicans PGA59, un GPI- ancorata proteine ​​della parete cellulare. A causa della presenza della luciferasi alla parete cellulare, i problemi relativi alla disponibilità intracellulare del substrato potrebbero essere evitati. Questo particolare sistema è stato utilizzato per studiare infezioni superficiali causate da C. albicans 22. Molto recentemente, BLI è stato utilizzato anche per seguire la progressione della candidosi orofaringea e la sua possible trattamento 23. Questi risultati supportano l&#39;uso di BLI come una tecnica promettente per studiare le infezioni causate da cellule a vita libera, ma anche infezioni periferica associata. In questo studio, descriviamo la C. albicans sviluppo biofilm su pezzi catetere in poliuretano in topi BALB / c e la sua quantificazione usando BLI. Forniamo un protocollo dettagliato di colonizzazione in vitro dei cateteri in poliuretano, durante il periodo di aderenza seguita da impianto in topi e successivo sviluppo biofilm di animali vivi. Oltre a misurare il segnale emesso dal BLI C. cellule albicans, si determinano anche l&#39;unità formanti colonia per il confronto con la tecnica standard per biofilm fungina carico quantificazione.

<table><tbody><tr><td>Estratto di lievito granulato</td><td>Merck</td><td>MERC1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Peptone batteriologico</td><td>Oxoid</td><td>LP037B</td><td></td></tr><tr><td>Agar granulato</td><td>Difco</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Fluka</td><td>49159-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp;</td><td>Preparato in laboratorio</td><td></td><td>per 1 litro di 10x PBS: 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 14,4 g di Na2HPO4, 2,4 g di KH2PO4</td></tr><tr><td>RPMI1640 con L-glutammina e senza carbonato di sodio...</td><td>Sigma</td><td>R6504-1L</td><td>Preparati secondo il protocollo per i test di sensibilità ai farmaci Candida albicans&nbsp;</td></tr><tr><td>3-(N-Morpholino)acido propansolfonato (MOPS)</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>MOPS viene utilizzato per regolare il pH del mezzo RPMI (pH 7,0)</td></tr>siero <tr><td>fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Catetere endovenoso in poliuretano trippa-lume (diametro 2,4 mm, Certofix Trio S730)&nbsp;</td><td>BBraun</td><td>CV-15703</td><td>Parte in poliuretano tagliata in pezzi da 1 cm</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Fagron SAS, Francia</td><td>611139</td><td>Immunosoppressore (soluzione madre 10 mg/ml)</td></tr><tr><td>Ampicillina&nbsp;</td><td>Duchefa Biochemie, Paesi Bassi</td><td>A0104</td><td>Profilassi antibatterica</td></tr><tr><td>Ketamina 1000</td><td>Pfizer</td><td>804 119</td><td></td></tr><tr><td>Domito</td> anestetico <td>Pfizer</td><td>134737-1</td><td>Anestetico</td></tr><tr><td>Antisedan</td><td>Pfizer</td><td>134783-2</td><td>Inversione dell'anestesia</td></tr><tr><td>Gel di xilocaina (2%) - questo è Linisol</td><td>AstraZeneca</td><td>352 1206</td><td>Anestetico locale per la pelle</td></tr><tr>Unguento <td></td><td></td><td>oftalmico Terramicina/polimixina-b</td><td>Per prevenire la secchezza e l'infezione degli occhi</td></tr><tr><td>Celenterazina&nbsp;</td><td>Prolume (Nanolight)</td><td>NF-CTZ-FB</td><td>Agente sensibile alla luce (deve essere tenuto al buio)</td></tr><tr><td>Iodio isopropanolo (1%)</td><td>3M&trade; DuraPrep&commercio; &nbsp;</td><td></td><td>Disinfettante per la pelle</td></tr><tr><td>0,5 % di clorexidina in alcol al 70 %. &nbsp;</td><td>Cedium</td><td></td><td>Disinfettante per la pelle</td></tr><tr><td>Attrezzatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td></td><td></td><td></td>di conteggio delle cellule</tr><tr><td>Siringhe da insulina (0,3 ml)</td><td>Terumo Myjector 29G</td><td>324826</td><td>Per iniezione di colenteterazina</td></tr><tr><td>Rasoio</td><td></td><td></td> elettrico <td>Per piccoli animali</td></tr><tr><td>Strumenti</td><td></td><td></td> chirurgici sterili <td>Forbici, 2 paia di pinzette, bisturi</td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Leica</td><td>14042321474</td><td></td></tr><tr><td>Sutura cutanea</td><td>Johnson& Johnson</td><td>K890H</td><td>Filo chirurgico, ago</td></tr><tr><td>Sonicatore a bagno d'acqua</td><td>Branson 2210</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telecamera BLI (IVIS Spectrum)&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, software Alameda</td><td>IVISSPE</td><td></td></tr><tr><td>Living Image&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Alameda</td><td></td> <td>(versione 4.2)</td></tr></tbody></table>

candida albicans biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti foreign bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da bioluminescence imaging

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans sviluppo di biofilm su superfici biotici e / o abiotici rappresenta una minaccia specifica per i pazienti ospedalizzati. Finora, C. biofilm albicans sono stati studiati prevalentemente in vitro, ma vi è la necessità fondamentale per una migliore comprensione di questo processo dinamico in condizioni in vivo. Abbiamo sviluppato un modello di ratto per via sottocutanea in vivo per studiare C. formazione di biofilm albicans. Nel nostro modello, multipla (fino a 9) Candida -infected dispositivi vengono impiantati alla parte posteriore dell&#39;animale. Questo ci dà un grande vantaggio rispetto al sistema venoso centrale modello catetere in quanto ci permette di studiare diversi biofilm indipendenti in un animale. Recentemente, abbiamo adattato questo modello per studiare C. albicans biofilm sviluppo in topi BALB / c. In questo modello, maturo C. biofilm albicans si sviluppano entro 48 ore e dimostrano la tipica architettura biofilm tridimensionale. La quantificazione di biofilm fungineè tradizionalmente analizzato post mortem e richiede sacrificio host. Poiché questo richiede l&#39;uso di molti animali di effettuare studi cinetici, abbiamo applicato non invasivo bioluminescenza (BLI) per longitudinalmente seguire in vivo maturare C. albicans biofilm sviluppare nel nostro modello sottocutaneo. C. cellule albicans erano stati ideati per esprimere il gene Gaussia princeps luciferasi (Gluc) attaccato alla parete cellulare. Il segnale di bioluminescenza è prodotta dalla luciferasi che converte il substrato coelenterazine aggiunto in luce che può essere misurato. Il segnale BLI assomigliava conta di cellule ottenute da cateteri espiantati. Di imaging non invasiva per quantificare in formazione vivo biofilm fornisce applicazioni immediate per lo screening e la validazione di farmaci antifungini in condizioni in vivo, così come per gli studi basati su interazioni ospite-patogeno, dichiara contribuendo ad una migliore comprensionezione della patogenesi delle infezioni da catetere-associate.

In questo studio, dimostriamo la procedura chirurgica di catetere dell&#39;impianto e durante espianto in vivo C. albicans biofilm sviluppo in un topo. Inoltre, mostriamo la quantificazione dei biofilm maturi non solo di CFU classica enumerazione, ma anche di BLI. Come mostrato nella Figura 1A, non fosforescenti pezzi catetere poliuretano sono stati tagliati in 1 dispositivi cm e successivamente rivestite con siero. Questo passaggio è molto importante perché permett...

Presentiamo una procedura sperimentale di sviluppo del biofilm di Candida albicans in un modello sottocutaneo murino. I biofilm fungini sono stati quantificati determinando il numero di unità formanti colonie e mediante un imaging a bioluminescenza non invasivo, in cui la quantità di luce prodotta corrisponde al numero di cellule vitali.

Candida albicans Biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti Foreign Bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di convalidare l'uso di un ceppo che esprime luciferasi per il monitoraggio non invasivo della formazione di biofilm in vivo da parte di cellule di candida albican. Ciò si ottiene impiantando frammenti di catetere colonizzati con un ceppo di candida albicans che esprime luciferasi nella parte posteriore di un topo. Durante la seconda fase, il lievito viene lasciato crescere in uno spesso strato di cellule incorporate all'interno di una matrice extracellulare, generando un biofilm maturo all'interno dei cateteri.Successivamente, viene aggiunto un substrato che verrà convertito dall'enzima luciferasi. Questa reazione produce luce misurabile: l'imaging bioluminescente o BLI viene quindi utilizzato per registrare e quantificare la formazione del biofilm all'interno dell'ospite vivente. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altre tecniche esistenti, come il sistema Venmo centrale, è che possiamo testare fino a sei biofilm all'interno di un animale, riducendo così notevolmente il numero di animali necessari per l'analisi statistica.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della formazione di biofilm di candida albicans, poiché il nostro metodo consente di testare facilmente componenti antifungini esistenti e nuovi. Inoltre, questo metodo può fornire informazioni sulla candida albicans, i biofilm fungini. Può anche essere applicato ad altri microbi come batteri o altre specie divertenti.Le procedure proposte sono facili da implementare in qualsiasi laboratorio che abbia accesso a una struttura per animali 24 ore prima della procedura chirurgica, aprendo la confezione contenente i cateteri a triplo lume all'interno di una cabina di sicurezza biologica. Utilizzare una pinzetta sterile per rimuovere tutte le parti non necessarie e un bisturi sterile per tagliare la parte attaccata al catetere. Quindi posizionare un righello sotto la confezione di plastica e tagliare il catetere in poliuretano in pezzi lunghi un centimetro.Successivamente, riempire ogni catetere con circa 1,8 millilitri di siero bovino fetale al 100% e incubare i pezzi a 37 gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva, trasferire ogni pezzo di catetere rivestito di siero in singole provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri e raschiare il C albicans da una piastra YPD in un millilitro di PBS in una provetta per microcentrifuga separata con una diluizione da uno a 100. Dopo il conteggio, diluire la sospensione cellulare a una concentrazione finale di cinque volte 10 per la quarta cellula per millilitro.E aggiungere un millilitro di cellule a ciascuno dei pezzi di catetere rivestiti di siero. Lasciare che le cellule aderiscano ai cateteri per 90 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi tenendo i tubi in posizione verticale con una pinzetta sterile.Sciacquare delicatamente ogni pezzo attraverso il lume due volte con un millilitro di PBS per posizionare i cateteri. Inizia radendo la parte bassa della schiena di un topo anestetizzato femmina di otto settimane posizionato su un termoforo. Quindi disinfettare la pelle e praticare una piccola incisione da 0,5 a un centimetro su ciascun lato dell'animale.Successivamente, sezionare il sottocu con le forbici per creare due tunnel sottocutanei lunghi circa 1,5 centimetri e larghi un centimetro. Inserire tre pezzi di catetere in ciascun tunnel assicurandosi che i pezzi si trovino uno accanto all'altro in una disposizione orizzontale senza sovrapposizioni. Chiudere le incisioni con punti di sutura e poi pulire le ferite molto delicatamente con un disinfettante.Quindi applicare un anestetico locale direttamente sulle incisioni e somministrare un agente anestetico che inverte l'anestesia, monitorando gli animali fino al loro completo recupero. Per visualizzare la formazione del biofilm al momento sperimentale appropriato, iniettare 100 microlitri di bobina appena preparata e terezin per via sottocutanea in ciascuna area contenente i cateteri in un animale anestetizzato. Acquisisci quindi scansioni consecutive con tempi di acquisizione che vanno dai 20 ai 60 secondi fino al raggiungimento della massima intensità del segnale.Durante l'acquisizione del fotogramma successivo, posizionare una regione di interesse su ciascun trio di cateteri per misurare l'imaging bioluminescente o l'intensità del segnale BLI dei fotogrammi acquisiti in precedenza. Posiziona anche una regione rettangolare di interesse di dimensione fissa su una regione di controllo per misurare il segnale di fondo nel software di immagine vivente. Misurare il flusso di fotoni attraverso le regioni di interesse per ciascun trio di cateteri e per lo sfondo.Dopo aver ripetuto queste misurazioni per ogni animale e in diversi punti temporali durante la formazione del biofilm, l'intensità del segnale BLI di ciascun trio di cateteri è il flusso di fotoni al secondo. I dati possono essere copiati e incollati direttamente in un foglio di calcolo. Al termine dell'esperimento longitudinale, sacrificare ogni animale tagliato attraverso il tessuto sottocutaneo e utilizzare una pinzetta sterile per rimuovere i frammenti del catetere uno per uno.Lavare i cateteri due volte in un millilitro di PBS come appena dimostrato. Quindi sonicare i pezzi in una nuova provetta da microcentrifuga in un millilitro di PBS fresco a 40.000 hertz in un bagno d'acqua. Sonicare dopo 10 minuti, posizionare i tubi contenenti i cateteri sul ghiaccio e lastra 100 microlitri dei campioni originali a una diluizione da 1 a 10 e da una a 100 su piastre di agar YPD.In duplicato. Infine, traccia la media e la deviazione standard delle unità formanti la colonia. E segnale BLI per ogni animale su scala logaritmica.In questa immagine, viene mostrato un animale rappresentativo che mostra il segnale di bioluminescenza insieme a una regione di interesse indicata sei giorni dopo lo sviluppo del biofilm. Si noti la mancanza di segnalazione nell'area di fondo di controllo che conferma la limitazione del biofilm alle aree immediatamente adiacenti ai cateteri rivestiti di candida. In questo esperimento rappresentativo, si può osservare un chiaro segnale BLI prodotto dai biofilm che esprimono la luciferasi, mentre solo il segnale di fondo sembra essere prodotto dal ceppo wild type.Questo aumento del segnale segue la stessa tendenza dell'aumento delle unità formanti colonie per biofilm e delle misurazioni del flusso di fotoni per ciascun gruppo di animali presi insieme. Questi dati illustrano che il BLI è una potente tecnica per monitorare e quantificare in vivo la formazione di biofilm di C albicans maturo in un modello murino sottocutaneo. Una volta padroneggiata, l'infezione dei dispositivi con cellule di candida può richiedere due ore, mentre l'impianto di catetere può essere eseguito in 10 minuti per topo.L'imaging BLI può essere eseguito in cinque minuti per mouse. Il grande vantaggio dell'utilizzo di BLI è che è possibile monitorare ripetutamente lo sviluppo della biomassa e del biofilm nello stesso animale. Nel tempo Seguendo questa procedura, altri metodi come la risonanza magnetica o la TC possono fornire informazioni sull'esatta posizione della cattedrale.Queste informazioni possono quindi essere utilizzate per la quantificazione in modelli più complessi come il modello della cattedrale della vena profonda. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come eseguire in vivo, biofilm sottocutaneo, ss nei topi, e questo potrebbe costituire la base per ulteriori analisi approfondite delle interazioni ospite-patogeno.

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Questo video dimostra lo sviluppo di un modello murino in vivo per studiare la formazione di biofilm di Candida albicans nel tessuto sottocutaneo. L'esperimento prevede l'impianto di dispositivi infetti da Candida nella regione posteriore dell'animale per lo sviluppo del biofilm.

Candida albicans Formazione di biofilm in un modello murino in vivo

Qui descriviamo un nuovo modello murino diabetico utilizzando topi glabri per il monitoraggio in tempo reale, non invasiva, di infezioni di ferita di biofilm di bioluminescenti Pseudomonas aeruginosa. Questo metodo può essere adattato ad infezione di altre specie di batteri e microrganismi geneticamente modificati, inclusi i biofilm multi-specie, di valutare e testare l'efficacia delle strategie di antibiofilm.

Vieni nel lato di luce: In Vivo monitoraggio di Pseudomonas aeruginosa Biofilm infezioni nelle ferite croniche in un modello murino Hairless diabetico

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Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Lo scopo di questo protocollo è quello di visualizzare Candida albicans forma cellulare e localizzazione nel tratto gastrointestinale dei mammiferi.

Visualizzazione degli albicani Candida nel tratto gastrointestinale Murine utilizzando l'ibridazione fluorescente in Situ

Per visualizzare e quantificare le caratteristiche interne dei biofilm Candida albicans, prepariamo campioni intatti fissi che vengono chiariti dalla corrispondenza dell'indice di rifrazione. Quindi, la microscopia ottiva di sezionamento può essere utilizzata per ottenere dati immagine tridimensionali attraverso l'intero spessore del biofilm.

Chiarire e imaging Candida albicans Biofilms

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L'infezione dell'articolazione periprotesica (PJI) causata da agenti patogeni pericolosi è comune in ortopedia clinica. I modelli animali esistenti non sono in grado di simulare accuratamente la situazione reale della PJI. Qui, abbiamo stabilito un modello murino di PJI associato al biofilm di Candida albicans per la ricerca e lo sviluppo di nuove terapie per la PJI.

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Un modello di infezione da Candida albicans correlato al catetere nel topo

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Terapia fotodinamica antimicrobica mediata da curcuminoidi su un modello murino di candidosi orale

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Un modello murino unico per la valutazione quantitativa della formazione di biofilm su impianti chirurgici in ascesso sottocutaneo

Scopri come monitorare lo sviluppo di biofilm di Candida albicans in vivo mediante imaging bioluminescente in un modello murino sottocutaneo. Questo metodo consente di quantificare la formazione del biofilm e testare terapie antifungine.

Candida albicans Biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti Foreign Bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da Bioluminescence Imaging (Video) | JoVE Journal

Candida albicans Biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti Foreign Bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da Bioluminescence Imaging

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