Name: Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Impara a eseguire iniezioni sottoretiniche di cellule epitelio pigmentato retinico in roditori con trauma minimo. Questo metodo consente la somministrazione efficace di cellule RPE per studi preclinici sulle degenerazioni retiniche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Desideriamo ringraziare Alison Dorsey per averci aiutato a sviluppare la tecnica di iniezione sottoretinica. Ringraziamo anche il National Eye Institute (sovvenzioni NEI EY11254 e EY021416), il California Institute for Regenerative Medicine (sovvenzione CIRM TR1-01219) e il Lowy Medical Research Institute (LMRI) per i finanziamenti molto generosi per questo progetto.

NOTA: Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida etiche stabilite dalla Scripps Research Institute. 1. Preparazione di materiali per l&#39;iniezione (~ 20 min) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Soluzione dissociazione cellulare Pre-caldo (preferibilmente uno che è inattivato tramite diluizione, non con siero), PBS sterile, e mezzi di coltura (Tabella 1). </li><li> Sterilizzare la siringa con un ago smussato smontando e bollendo le parti in acqua per 15 min. </li></ol> 2. Preparazione delle cellule RPE per iniezione (~ 30 minuti a 1 ora) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Staccare le cellule RPE utilizzando soluzione dissociazione delle cellule pre-riscaldato per 5-8 minuti a 37 ° C. </li><li> Raschiare le cellule delicatamente per rilasciare qualsiasi che sono ancora attaccato. </li><li> Diluire le cellule con un grande volume di coltura (riempire una provetta da 15 ml) per inattivare la soluzione di dissociazione e contarli. </li><li> Centrifugare a 800 xg per 5 minuti per far sedimentare le cellule. </li><li> Risospendere le cellule a 200.000 cellule / microlitro (per fornire 100.000 cellule in un volume di 0,5 ml) in PBS sterile preriscaldata e trasferirli in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Facoltativamente, aggiungere un marcatore fluorescente transitoria cellule vive e incubare a 37 ° C per 30-45 min. </li><li> Caricare la siringa con un ago senza punta con 0,5 ml di cellule. Iniettare le cellule appena possibile. </li></ol> 3. Sub-retinica Injection (~ 5 min per iniezione) NOTA: Se possibile, imparare la tecnica con ratti albini adulti, poiché le imbarcazioni limbus sono molto più facili da visualizzare. Iniettare veloce soluzione verde quando l&#39;apprendimento (prima di tentare di iniettare le cellule) per agevolare più facilmente la visualizzazione del sito di iniezione. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Anestetizzare il roditore. Utilizzare iniezioni intraperitoneali di 100 mg / ml ketamina e 10 mg / ml xilazina (20 microlitri / 10 g corpo wotto) su inalazione isofluorano poiché è difficile da manovrare il roditore e iniettare nell&#39;occhio col muso nella inalatore. <ol><li> Assicurarsi che l&#39;animale è profondamente anestetizzato pizzicando una delle sue zampe. Se indietreggia, attendere alcuni minuti e riprovare prima di iniziare l&#39;iniezione sottoretinico. </li></ol></li><li> Posizionare il roditore su un lato in modo che l&#39;occhio che verrà iniettata è rivolto verso il soffitto. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione allungare delicatamente la pelle così l&#39;occhio si apre un po &#39;fuori dal socket (proptosi temporaneo) e diventa più accessibile tenendo la testa con due dita appena sopra l&#39;orecchio e per la sua mascella e allungare delicatamente la pelle parallela alle palpebre in modo che l&#39;occhio si apre un po &#39;fuori dal socket (Vedi Figura 1C). Non afferrare il roditore troppo vicino alla gola. </li><li> Con un forte ago pre-sterilizzato monouso 30 G, fare un buco immediatamente sotto il limbus (se le navi sono colpiti, sanguinamento si ball&#39;e significativo e che sia difficile trovare il foro di seguito) e un angolo per evitare di toccare la lente con l&#39;ago (Figura 1D). Evitare di toccare l&#39;obiettivo con l&#39;ago affilato (o spuntato) o immediata formazione di cataratta si verificherà. NOTA: Le iniezioni funzionano meglio con due persone. In questo modo una persona può passare la siringa con l&#39;ago smussato alla persona che esegue l&#39;iniezione dopo aver creato il primo foro con l&#39;ago monouso affilato per mantenere la concentrazione sul dove il foro. </li><li> Allontanare l&#39;ago appuntito monouso dall&#39;occhio mantenendo la presa sulla testa. Ricorda esattamente dove il buco è. </li><li> Dopo il montaggio o la siringa pre-caricato con un ago senza punta su un micromanipolatore o tenendolo per mano, inserire la punta della siringa con l&#39;ago senza punta attraverso il foro, prendendo di nuovo attenzione a non toccare l&#39;obiettivo e spingere delicatamente attraverso l&#39;occhio molto delicatamente fino a sentire resistenza (Figura 1D). </li><li> Keeping tutti i movimenti al minimo, iniettare attentamente le cellule RPE lentamente nello spazio sottoretinico. NOTA: il distacco RPE / retina sarà indotta; questo è inevitabile. Tuttavia, una iniezione di detergente minimizza il distacco e migliora notevolmente le possibilità di riattacco (Figura 1E). Eventuali movimenti esagerati possono spostare l&#39;ago nella retina, e movimenti laterali possono danneggiare la retina. L&#39;impiego di una pompa di iniezione è opzionale ma permette una consegna molto precisa. </li><li> Ritrarre la siringa lentamente. Applicare idratante collirio per mantenere l&#39;occhio idratato. </li><li> Continuare a monitorare l&#39;animale fino a che riacquista decubito sternale. Non lasciare animali incustoditi o tornare a una gabbia con altri animali allarme fino a quando riacquista decubito sternale. </li></ol>

<ol><li>Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targets+in+age-related+macular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targets in age-related macular disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).</li>
<li>Jong, P. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJong%2C+PT+%22Age-related+macular+degeneration%22">Age-related macular degeneration</a>. Med, N. . E. ngl. J. . 355 (14), 1474-1485 (2006).</li>
<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auto+iris+pigment+epithelial+cell+transplantation+in+patients+with+age-related+macular+degeneration%3A+short-term+results%5BTitle%5D)+AND+%22The+Tohoku+Journal+Of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Auto iris pigment epithelial cell transplantation in patients with age-related macular degeneration: short-term results.</a> The Tohoku Journal Of Experimental Medicine. 191 (1), 7-20 (2000).</li>
<li>Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration+with+subfoveal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 232, 707-716 (1994).</li>
<li>Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration%3A+a+prospective+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).</li>
<li>Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium+in+eyes+with+foveal+neovascularization+resulting+from+age-related+macular+degeneration%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study.</a> Am. J. Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).</li>
<li>Juan, E., Loewenstein, A., Bressler, N. M., Alexander, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+the+retina+for+management+of+subfoveal+choroidal+neovascularization+II%3A+a+preliminary+report+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Translocation of the retina for management of subfoveal choroidal neovascularization II: a preliminary report in humans.</a> Am. J. Ophthalmol. 125 (5), 635-646 (1998).</li>
<li>Falkner-Radler, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+transplantation%3A+outcome+after+autologous+RPE-choroid+sheet+and+RPE+cell-suspension+in+a+randomised+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study.</a> British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).</li>
<li>Joussen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+complete+is+successful+%27Autologous+retinal+pigment+epithelium+and+choriod+translocation+in+patients+with+exsudative+age-related+macular+degeneration%3A+a+short-term+follow-up%27+by+Jan+van+Meurs+and+P.R.+van+Biesen%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes.+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">How complete is successful 'Autologous retinal pigment epithelium and choriod translocation in patients with exsudative age-related macular degeneration: a short-term follow-up' by Jan van Meurs and P.R. van Biesen.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 241 (12), 966-967 (2003).</li>
<li>Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+outcomes+following+macular+translocation+with+360-degree+peripheral+retinectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Visual outcomes following macular translocation with 360-degree peripheral retinectomy.</a> Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1317-1324 (2002).</li>
<li>Machemer, R., Steinhorst, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+separation%2C+retinotomy%2C+and+macular+relocation%3A+II.+A+surgical+approach+for+age-related+macular+degeneration%3F+Graefes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retinal separation, retinotomy, and macular relocation: II. A surgical approach for age-related macular degeneration? Graefes.</a> Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 231 (11), 635-641 (1993).</li>
<li>MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+transplantation+of+the+retinal+pigment+epithelium+and+choroid+in+the+treatment+of+neovascular+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Autologous transplantation of the retinal pigment epithelium and choroid in the treatment of neovascular age-related macular degeneration.</a> Ophthalmology. 114 (3), 561-570 (2007).</li>
<li>Peyman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation+for+age-related+macular+degeneration+secondary+to+extensive+subfoveal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Surgery%22%5BJournal%5D)">A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring.</a> Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).</li>
<li>Buchholz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+phagocytosis+by+human+embryonic+stem+cell-derived+RPE+cells+using+a+novel+human+retinal+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay.</a> Mol. Vis. 15 (4), 283-295 (2009).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4 (12), e8152(2009).</li>
<li>Hirami, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+cells+from+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells.</a> Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).</li>
<li>Idelson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).</li>
<li>Klimanskaya, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+comparative+assessment+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+using+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics.</a> Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).</li>
<li>Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Induced+Pluripotent+Stem-Derived+Retinal+Pigment+Epithelium+%28RPE%29+Cells+Exhibit+Ion+Transport%2C+Membrane+Potential%2C+Polarized+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Secretion%2C+and+Gene+Expression+Pattern+Similar+to+Native+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE.</a> Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).</li>
<li>Krohne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+small+molecules+and+OCT4-reprogrammed+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).</li>
<li>Lund, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).</li>
<li>Osakada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+by+small-molecule+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction.</a> J. Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).</li>
<li>Vugler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp. Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Westenskow, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+flow+cytometry+to+compare+the+dynamics+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+in+iPS-derived+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).</li>
<li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch. Ophthalmol. 122 (10), 598-614 (2004).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+%28iPS%29+grafts+in+a+preclinical+model+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa.</a> Molecular Medicine. 18, 1312-1319 (2012).</li>
<li>Wang, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa).</a> Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).</li>
<li>Ramsden, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+retinal+regeneration%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stem cells in retinal regeneration: past, present and future.</a> Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).</li>
<li>Schwartz, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+human+embryonic+stem+cell+therapies+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration.</a> Trends in Neurosciences. 36 (7), 385-395 (2013).</li>
<li>Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWestenskow%2C+P+%22The+New+Visual+Neurosciences%22">The New Visual Neurosciences</a>. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).</li>
<li>Westenskow, P., Sedillo, Z., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Derivation+of+Retinal+Pigment+Epithelium+Cells+from+iPS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from iPS.</a> J. Vis. Exp. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Furhmann, S., Levine, E. M., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraocular+mesenchyme+patterns+the+optic+vesicle+during+early+eye+development+in+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick.</a> Development. 127 (21), 4599-4609 (2000).</li>
<li>Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Safety+and+Function+of+RPE+from+Human+Embryonic+Stem+Cells+in+Preclinical+Models+of+Macular+Degeneration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration).</a> Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).</li>
<li>Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+transplantation+of+MACS+purified+photoreceptor+precursor+cells+into+the+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina.</a> Journal Of Visualized Experiments. , e50932(2014).</li>
<li>Huber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+mouse+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5888-5895 (2009).</li>
<li>Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+mouse+retinal+degeneration+with+high-resolution+spectral-domain+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vision%22%5BJournal%5D)">Monitoring mouse retinal degeneration with high-resolution spectral-domain optical coherence tomography.</a> Journal of Vision. 53 (8), 4644-4656 (2008).</li>
<li>Pennesi, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+retinal+degeneration+in+rd1+and+rd10+mice+using+spectral+domain+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of retinal degeneration in rd1 and rd10 mice using spectral domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 4644-4656 (2012).</li>
<li>Fisher, S. K., Lewis, G. P., Linberg, K. A., Verardo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+remodeling+in+mammalian+retina%3A+results+from+studies+of+experimental+retinal+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+And+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular remodeling in mammalian retina: results from studies of experimental retinal detachment.</a> Progress in Retinal And Eye Research. 24 (3), 395-431 (2005).</li>
<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+subretinal+implantation+of+ultrathin+substrates+containing+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer.</a> Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).</li>
<li>Diniz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+implantation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%3A+improved+survival+when+implanted+as+a+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (7), 5087-5096 (2013).</li>
</ol>

Nessuno degli autori ha alcuna divulgazione commerciale da dichiarare.

In questo articolo si descrive un metodo relativamente semplice per eseguire iniezioni subretiniche di cellule RPE in sospensione in ratti e topi. Il protocollo è facile da imparare e più esperienza con la tecnica si tradurrà in un minor numero di traumi (Figura 3, che rappresenta una delle iniezioni migliori), specialmente se viene utilizzato un micromanipolatore (Figura 1A). Qualsiasi trauma può essere monitorata in vivo con un sistema cSLO e PTOM (Figura 2) ...

La retina sensoriale è organizzata in livelli funzionali di neuroni, glia e cellule endoteliali. I fotorecettori nella parte posteriore della retina sono attivati dalla luce; Attraverso la fototrasduzione convertono i fotoni in segnali elettrici che vengono raffinati dagli interneuroni e trasmessi alla corteccia visiva nel cervello. La fototrasduzione non può avvenire senza gli sforzi coordinati della glia di Mueller e delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). Gli RPE sono organizzati in un monostrato direttamente dietro i fotorecettori e svolgono molteplici e diverse funzioni integrali alla funzione dei fotorecettori e all'omeostasi. Infatti, l'EPR e i fotorecettori sono così co-dipendenti da essere considerati un'unica unità funzionale. La morte o la disfunzione dell'RPE provoca effetti secondari devastanti sui fotorecettori ed è associata alla degenerazione maculare legata all'età (AMD), la principale causa di cecità negli anziani1,2.
Sebbene non sia stata scoperta alcuna cura per l'AMD, diversi studi clinici hanno dimostrato che la sostituzione delle cellule RPE può essere un'opzione terapeutica promettente3-13. Con l'avvento della tecnologia delle cellule staminali, è ora possibile generare un gran numero di cellule RPE in vitro da cellule staminali embrionali e pluripotenti indotte (hES e hiPS) che assomigliano fortemente alle loro controparti somatiche funzionalmente e anatomicamente14-26. È stato anche dimostrato che gli RPE derivati da cellule staminali funzionano in vivo da più gruppi indipendenti, incluso il nostro, per rallentare significativamente la degenerazione retinica nelle linee di ratto e topo con degenerazione retinica spontanea16,18,21,22,25,28,29. Questa combinazione di prove cliniche e precliniche a supporto è così convincente che sono ora in corso diversi studi clinici per prevenire la degenerazione retinica utilizzando cellule RPE derivate da cellule staminali30,31. 
RPE può essere facilmente derivato da hES e/o hiPS e impiantato nello spazio sottoretinico dei roditori utilizzando varie tecniche di derivazione e iniezione32,33. (Vedi Westenskow et al. per un articolo sui metodi in formato multimediale che dimostra il protocollo di differenziazione diretta che impieghiamo)34. Ci sono domande critiche rimanenti riguardanti la sicurezza, la sopravvivenza e la capacità funzionale delle cellule RPE consegnate esogenamente al momento dell'impianto, quindi la capacità di eseguire iniezioni sottoretiniche nei roditori è un'abilità critica16,18,21,29,36,37. La somministrazione di RPE non è banale, e il campo è diviso sulla tecnica di iniezione più efficace. Il protocollo che descriviamo qui è un modo semplice ed efficace per erogare bolo di cellule RPE per via sottoretinica ed è stato utilizzato nel primo studio clinico per il trapianto di RPE derivato da cellule staminali31. (Il lettore può anche fare riferimento a un altro articolo di JoVE di Eberle et al. per una rappresentazione alternativa delle iniezioni sottoretiniche nei roditori. 38) 
La tecnica descritta in questo manoscritto non può essere visualizzata e il trauma è inevitabile (come con qualsiasi tecnica di iniezione sottoretinica). Viene eseguita praticando un foro appena sotto i vasi del limbus e inserendo un ago smussato lungo una via transsclerale per iniettare un bolo di cellule sotto la retina diametralmente opposta. La persona che esegue l'iniezione avvertirà resistenza quando l'ago smussato tocca la retina. Tuttavia, le cellule possono essere visualizzate direttamente dopo l'iniezione e il grado del distacco di retina indotto può essere determinato etichettando le cellule RPE con un marcatore fluorescente transitorio e rilevandole con un oftalmoscopio a scansione confocale (cSLO). Un sistema di tomografia a coerenza ottica (OCT) può essere utilizzato anche per monitorare il trauma e identificare facilmente il sito di iniezione.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanolo (55 mM)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21985-023</td><td>50 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Cell Scapers</td><td>VWR</td><td>89260-222</td><td>Valigetta x 1</td></tr><tr><td>CellTracker Verde CMFDA</td><td>Sonde molecolari</td><td>C34552</td><td>50 &; g x 20</td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Fast</td><td>Green Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td>25 g x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Genteal Geldrops Collirio lubrificante da moderato a grave&nbsp;</td><td>Walmart</td><td>4060941</td><td>25 ml x 1</td></tr><tr><td>Hamilton Modello 62 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>87942</td><td>Siringa x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Ago Hamilton 33 G, 0,5", punto 3 (acciaio inossidabile 304)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Aghi x 6</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero di ricambio KnockOut</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutammina 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>39430216 Supporto x 1</td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali 100X&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Leica Biosystems</td><td>3943001</td><td>Manipolatore x 1</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Siringhe Slip Tip senza aghi BD&nbsp; (3 ml)&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td></td><td>BD309656 Confezione x 1</td></tr><tr><td>Aghi per Uso Speciale BD&nbsp; (30 G, 1")</td><td>Scatola BD305128 VWR</td><td></td><td>x 1</td></tr><tr><td>enzima TrypLE Express (1X), senza rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>100 ml x 1</td></tr></tbody></table>

esecuzione sottoretinico iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

La conversione della luce in impulsi elettrici avviene nella retina esterna e si realizza in gran parte da coni e bastoncelli fotorecettori e dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) cellule. RPE fornisce il supporto critico per fotorecettori e la morte o la disfunzione delle cellule RPE è caratteristico di età degenerazione maculare (AMD), la principale causa di perdita permanente della vista nelle persone 55 anni in su. Mentre è stato identificato alcuna cura per AMD, l&#39;impianto di RPE sana in occhi malati potrebbe rivelarsi essere un trattamento efficace, e un gran numero di cellule RPE può essere facilmente generato da cellule staminali pluripotenti. Molte domande interessanti per quanto riguarda la sicurezza e l&#39;efficacia della consegna delle cellule RPE possono ancora essere esaminate in modelli animali, e sono stati sviluppati protocolli ben accettate utilizzati per iniettare RPE. La tecnica qui descritta è stata utilizzata da più gruppi in vari studi e implica prima la creazione di un foro in un occhio con un ago tagliente. Poi una siringa con un blunt ago caricato con cellule viene inserito attraverso il foro e attraverso il vitreo fino a toccare delicatamente il RPE. Usando questo metodo di iniezione, che è relativamente semplice e non richiede attrezzatura minima, otteniamo integrazione coerente ed efficiente di cellule RPE cellule staminali derivate tra RPE host che impedisce quantità significativa di fotorecettori degenerazione in modelli animali. Pur non parte del protocollo attuale, abbiamo anche descritto come determinare l&#39;entità del trauma indotto dall&#39;iniezione, e come verificare che le cellule sono state iniettate nello spazio sottoretinico usando modalità di imaging in vivo. Infine, l&#39;uso di questo protocollo non è limitato alle cellule RPE; può essere utilizzato per iniettare qualsiasi composto o cella nello spazio sottoretinico.

Possiamo fornire una sospensione di cellule RPE nello spazio sottoretinico di roditori rapidamente e costantemente usando la tecnica descritta in questo manoscritto. Anche se non richiesto, traumi possono essere notevolmente ridotti al minimo con la configurazione mostrata con un micromanipolatore in Figura 1A &amp; B. Mantenere il roditore come mostrato nella Figura 1C per proptosis temporanea. I passaggi sono gli stessi, se eseguita con micromanipolatore oa mano; questi sono rappresen...

Qui presentiamo un protocollo accettato dalla comunità in formato multimediale per l'iniezione sottoretinica di un bolo di cellule RPE in ratti e topi. Questo approccio può essere utilizzato per determinare i potenziali di salvataggio, i profili di sicurezza e le capacità di sopravvivenza delle cellule RPE trapiantate dopo l'impianto in modelli animali di degenerazione retinica.

Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

L'obiettivo generale di questa procedura è iniettare pigmento retinico, epitelio o cellule RPE nello spazio sottoretinico dei roditori, riducendo al minimo il trauma. Ciò si ottiene utilizzando prima un ago affilato per fare un buco nell'occhio di un animale sedato. Successivamente, le cellule vengono iniettate nello spazio sottoretinico utilizzando un ago smussato.Nella fase finale, l'occhio viene rivestito con una crema idratante per mantenerlo idratato. In definitiva, l'istologia e le modalità di imaging in vivo possono essere utilizzate per monitorare l'efficacia dell'iniezione. Mentre il metodo che vi abbiamo mostrato oggi è stato specificamente adattato per la somministrazione di cellule RPE nello spazio sottoretinico, la tecnica stessa è ampiamente applicabile alla somministrazione di una varietà di altri tipi di cellule e sostanze chimiche nello spazio sottoretinico da utilizzare in una varietà di studi preclinici.In generale, le persone che sono nuove a questo metodo avranno difficoltà perché è difficile vedere quanto bene è stata eseguita l'iniezione. Le dimostrazioni visive di questo metodo sono fondamentali in quanto le fasi di iniezione sono difficili da apprendere sen

performing-subretinal-injections-rodents-to-deliver-retinal-pigment

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Questa tecnica chirurgica illustra l'iniezione di vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico dell'occhio mouse.

Iniezione sottoretinico di vettori di terapia genica e cellule staminali nel Eye mouse

Fonte: Park, S. W., et al. Approccio limbare-Iniezione sottoretinica di vettori virali per la terapia genica nell'epitelio pigmentato retinico di topi. J. Vis. Exp. (2015)Il video descrive il metodo per l'iniezione sottoretinica di vettori virali nell'epitelio pigmentato retinico (RPE) in un modello murino. Descrive in dettaglio la procedura, dall'anestesia e dalla preparazione degli occhi alla consegna precisa del vettore lentivirale, garantendo l'integrazione e l'espressione genica nell'EPR.

Iniezione sottoretinica di vettori virali nell'epitelio pigmentato retinico in un modello murino

L'iniezione sottoretinica è una tecnica chirurgica per la consegna efficace di geni all'epitelio pigmentato retinico nell'occhio del topo.  Qui descriviamo un metodo semplice e replicabile per l'iniezione sottoretinica di vettori virali nell'epitelio pigmentato retinico in topi sperimentali.

Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

Le iniezioni sottoretiniche sono la tecnica più comune per somministrare grandi agenti terapeutici come proteine e vettori virali ai fotorecettori e all'epitelio pigmentato retinico. Qui viene descritto un metodo alternativo nei topi che si rivolge con successo allo spazio sottoretinico con danni collaterali minimi e tempi di recupero rapidi.

Un metodo alternativo e validate iniezione per l&#39;accesso ai sottoretinico Spazio<i&gt; via</i&gt; Un approccio Transcleral posteriore

Iniezione subretinal è stato ampiamente applicato negli studi preclinici di terapia sostitutiva delle cellule staminali per degenerazione maculare senile. In questo articolo visualizzato in quel momento, descriviamo una tecnica di iniezione subretinal meno rischioso, riproducibile e precisamente modificati tramite l'approccio trans-sclerale per fornire cellule negli occhi del ratto.

Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

Cellule epiteliali del pigmento retinico potrebbero servire come una terapia di sostituzione delle cellule per la forma avanzata di degenerazione maculare senile secca. Questo protocollo descrive la generazione di un modello di grande-eyed di atrofia geografica e il subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivati da cellule staminali embrionali umane in questo modello della malattia.

Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

L'impianto sottoretinico dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) è uno degli approcci più promettenti per il trattamento delle malattie degenerative della retina. Tuttavia, le prestazioni degli studi preclinici su modelli animali di grandi occhi rimangono impegnative. Questo rapporto presenta le linee guida per il trapianto sottoretinico di RPE su un vettore cellulare in maialini.

Impianto sottoretinico di RPE su un portatore in maialini: linee guida per preparazioni preoperatorie, tecniche chirurgiche e cure postoperatorie

Questo protocollo presenta un approccio trans-sclerale guidato dalla visione transpupillare per fornire in modo sicuro e preciso innesti cellulari sottoretinici, con un basso tasso di complicanze chirurgiche, in riceventi murini con o senza degenerazione retinica.

Trapianto trans-sclerale transpupillare guidato di innesti sottoretinici in un modello murino di degenerazione retinica

Descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC post-crioconservate e la somministrazione sub-retinica di queste cellule in topi rd10 .

Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

Questo articolo descrive i metodi per l'iniezione sottoretinica nei ratti, utilizzando la visualizzazione intraoperatoria per controllare sia il sito di iniezione che l'area di distacco della retina.

Visualizzazione intraoperatoria dell'iniezione sottoretinica e del distacco di retina nei ratti

Le iniezioni sottoretiniche sono una tecnica indispensabile per lo sviluppo preclinico di terapie per le malattie dei fotorecettori e dell'EPR. Descriviamo una tecnica di iniezione sottoretinica transsclerale ottimizzata nei topi che migliora le percentuali di successo intraoperatorio e riduce al minimo il danno retinico.

Tecnica di iniezione sottoretinica transsclerale minimamente invasiva ottimizzata nel topo

Impara a eseguire iniezioni sottoretiniche di cellule epitelio pigmentato retinico in roditori con trauma minimo. Questo metodo consente la somministrazione efficace di cellule RPE per studi preclinici sulle degenerazioni retiniche.

Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

Esplora altri video