Genome-wide proteina-proteina interazione Screening per Protein-frammento Complementation Assay (PCA) in cellule viventi

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare i partner di interazione proteica di una proteina di interesse utilizzando il saggio di complementazione del frammento proteico DI idro folato reduttasi, o D-H-F-R-P-C-A. Ciò si ottiene condensando prima la raccolta DH FFR F three o la lode su array di colonie ad alta densità. Successivamente, il ceppo esca viene realizzato con la serie di lodi su un terreno ricco.

Nella fase finale, vengono selezionati i diploidi risultanti da questi accoppiamenti. In definitiva, la ricostituzione del DHFR viene quantificata misurando le dimensioni delle colonie su terreno PCA selettivo, che fornisce un segnale proporzionale alla quantità di complesso di prede esca ricostituito nelle cellule. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di malattie come il cancro, in quanto avviene attraverso il ricablaggio delle reti di interazione proteica.

Che le mutazioni possono portare a tali malattie. La mattina della procedura, sterilizzare la piattaforma robotica immergendo prima gli strumenti PIN cinque volte per 10 secondi nella stazione a bagno d'acqua per rimuovere eventuali grumi di cellule residue. Quindi immergere lo strumento PIN due volte avanti e indietro nella stazione di spazzola e due volte nella stazione di recupero per 20 secondi ogni immersione per rimuovere le celle rimanenti durante la pulizia degli strumenti PIN.

Accendi la lampada UV per cinque minuti per sterilizzare un robot. Custodia quindi, dopo l'ultimo lavaggio, asciugare gli strumenti PIN nella stazione di essiccazione dell'aria per 25 secondi. Condensa la collezione A-D-H-F-R su 16 array di 384 ceppi qui.

Un array 384 può essere suddiviso in quattro quadranti equidistanti tra interessi, ciascuno costituito da 96 posizioni in un layout a matrice due per due per un totale di quattro quadranti. Per fare questo per ogni array 384, stampa quattro piastre di glicerolo sui quattro quadranti di un vassoio omni contenente YPD più 250 microgrammi per millilitro. L'igromicina B, utilizzando lo strumento a 96 pin per fare ciò, inserisce 4 piastre da 96 pozzetti contenenti il controllo negativo LDH FFR F tre tra le 60 piastre di glicerolo della collezione DHFR tre per avere un set finale di 64 piastre che riempiono esattamente quattro array da 1.536.

Quindi inserire 4 piastre da 96 pozzetti contenenti il controllo negativo LDH FFR F tre tra le altre 60 piastre per avere un set finale di 64 piastre che riempiono esattamente 4, 15, 36 array prima di aggiungere le celle alle piastre di origine, bagnare i perni sterilizzati in 35 millilitri di acqua sterile in un vassoio omnidirezionale nella stazione umida. Incubare gli array a 37 gradi Celsius per due giorni, quindi condensare la collezione in quattro array di 1.536 ceppi. Stampa quattro array di 384 ceppi su ciascuna delle quattro piastre di destinazione.

Utilizzando lo strumento a spillo 384. Sterilizzazione dello strumento PIN tra ogni ciclo di replicazione, come appena dimostrato dopo un'altra incubazione di due giorni. Standardizzare le dimensioni della colonia replicando i quattro array sul terreno YPD selezionato con uno strumento da 1.536 pin e incubare le piastre per altre 48 ore.

Per un'elevata produttività. D-H-F-R-P-C-A inoculare prima una coltura del ceppo esca in 20 millilitri di YPD liquido più CIO ricina in una provetta da 50 millilitri e incubare le cellule per due giorni a 30 gradi Celsius con agitazione a 250 giri/min. Quando la cultura ha raggiunto la saturazione.

Piastra cinque millilitri di sospensione cellulare su un vassoio omni YPD plus gnat e lascia che le cellule vengano assorbite sulla superficie dopo 5-10 minuti, rimuovi il liquido in eccesso e incuba la coltura a 30 gradi Celsius dopo due giorni. Usa lo strumento 1.536 pin per stampare il ceppo dell'esca su 12 piastre YPD utilizzando ogni prato a celle non più di quattro volte. Quindi, utilizzando lo strumento 1, 536 pin, di nuovo, stampare l'array appropriato per la raccolta DHFR F three sopra le celle dell'esca.

Lasciare che i ceppi si accoppino durante un'altra incubazione di due giorni e poi selezionare le cellule diploidi stampando le colonie su vassoi omni contenenti YPD più idromicina B e nortina. Incubare i diploidi per altri due giorni a 30 gradi Celsius, quindi ripetere la selezione come appena dimostrato un giorno dopo l'inizio dell'incubazione. Versare le piastre con un terreno contenente metotrexato il giorno successivo.

Utilizzare lo strumento a spillo 1.536 per stampare le cellule diploidi sul terreno di coltura metotrexato e incubare le piastre per altri quattro giorni in sacchetti di plastica per evitare che le colture si secchino. Il terzo giorno di incubazione. Versare un secondo lotto di vassoi omni contenenti il terreno MTX come appena dimostrato il giorno successivo, accendere la luce del robot e utilizzare una piattaforma robotica per visualizzare le piastre per ridurre la crescita di fondo dei ceppi PCA e aumentare la risoluzione quantitativa, replicare le celle sul secondo lotto di terreni MTX per eseguire un secondo ciclo di selezione MTX come appena dimostrato.

Infine, dopo aver acquisito le immagini dal secondo set di piastre, analizzare gli array di colonie con il software appropriato, raccogliendo le informazioni sulla dimensione della colonia per ogni posizione di ciascun array. La soglia definita con i tre controlli LDH FFR F può essere utilizzata come soglia empirica per determinare i colpi di alta confidenza. Gli interattori fisici noti dell'esca possono quindi essere recuperati da database come Biogrid e sovrapposti ai dati.

Ad esempio, in questo caso, cinque su otto riscontri ad alta confidenza sono stati precedentemente segnalati come interattori NUP 82, tra cui altri NUP one 16 e NUP 1 59 sono stati determinati come parte del sottocomplesso NUP 82. I dati indicano anche che la proteina di membrana approssimale PEX 30 può rappresentare un nuovo interattivo fisico di Nup 82, come confermato utilizzando D-H-F-R-P-C-A a basso rendimento due degli altri partner di interazione rilevati. Il nuovo 20 e il nuovo 85 sono stati determinati per non far parte del nuovo sottocomplesso 82, illustrando la capacità di D-H-F-R-P-C-A di rilevare le interazioni all'interno e tra i sottocomplessi di complessi più grandi.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare i terreni Freshly Report per evitare qualsiasi risoluzione dei problemi con le fasi di stampa e di includere i controlli necessari per assicurarsi che il terreno PCA finale consenta la crescita delle sole cellule che dimostrano la complementazione DHFR.