Vicino infrarosso (NIR) Luce aumenta l'espressione di un marcatore di mitocondriale Funzione nel mouse vestibolare sensoriale Epithelium

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare l'eventuale effetto neuroprotettivo della luce infrarossa vicina sull'epitelio sensoriale vestibolare del topo. Questo viene ottenuto mediante una semplice applicazione transcranica a breve termine di luce infrarossa vicina sui topi in diverse fasi di sviluppo. Come secondo passaggio, vengono dissecati i labirinti ossei degli animali trattati, consentendo l'isolamento dell'epitelio sensoriale vestibolare.

Successivamente, l'espressione del gene antiossidante di interesse viene misurata mediante R-T-P-C-R per valutare l'impatto del trattamento sulle prestazioni mitocondriali. Infine, viene eseguita una densitometria per valutare l'effetto di un breve trattamento con luce infrarossa sull'espressione di specifici geni antiossidanti nei topi. Il principale vantaggio di questa tecnica di trattamento con infrarossi è che è semplice e non invasiva, consentendo ulteriori analisi fisiologiche, molecolari e comportamentali a valle del trattamento.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla possibile neuroprotezione del sistema vestibolare periferico durante l'invecchiamento normale, oppure al miglioramento delle prestazioni dell'equilibrio in seguito a malattia o deficit vestibolare. Due o tre giorni prima di iniziare l'esperimento, rasare il pelo delle regioni della testa e del collo di ciascun topo nel modo più accurato possibile per prevenire la ricrescita dei peli prima del completamento del regime di trattamento. Per mantenere lo stato privo di patogeni degli animali, pulire gli strumenti con etanolo al 70% tra una rasatura e l'altra.

Quindi, nel giorno del trattamento per ogni animale interno, prendere il topo all'estremità prossimale della coda e lasciarlo rilassare nel palmo di una mano per minimizzare lo stress per gli animali trattati con infrarosso vicino. Per ogni animale, tenere un dispositivo LED a 670 nanometri, ad una distanza di uno-due centimetri dall'area rasata, e accendere il dispositivo per 90 secondi. Per il gruppo sham, ripetere la procedura di trattamento nello stesso modo, ma con il dispositivo spento; per il gruppo con infrarosso vicino bloccato, trattare gli animali nello stesso modo del gruppo trattato con infrarosso vicino, ma con il dispositivo coperto da foglio di alluminio.

Dopo aver ripetuto i trattamenti per ogni gruppo a intervalli di 24 ore per cinque giorni consecutivi, congelare il liquido cerebrospinale artificiale appena preparato a base di glicerolo, o A CSF, in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per 45 minuti, fino alla formazione di una sospensione di ghiaccio. Successivamente, per ogni topo, utilizzare una lametta rotonda numero 22 per praticare un'incisione lungo la cute sagittale del cranio, mantenendo il cranio, il cervello e l'apparato vestibolare sottostante il più freddi possibile mediante applicazioni regolari di A CSF ghiacciato sui tessuti. Quindi, utilizzare la punta di un paio di forbici standard per praticare una piccola incisione nel cranio a livello di Lambda e proseguire il taglio lungo la sutura sagittale.

Quindi far scivolare delicatamente un braccio di un URS poco profondo al di sotto dell'osso parietale, quindi fissare e tirare lateralmente l'osso parietale e posteriormente l'osso occipitale fino a esporre l'encefalo. Successivamente, utilizzare una piccola spatola in acciaio inossidabile per sollevare l'encefalo dalle fosse craniche anteriore e media. Per esporre il nervo vestibolococleare, sezionare il nervo per evitare tensioni inutili sugli assoni afferenti primari che innervano direttamente le cellule ciliate vestibolari.

Quindi rimuovere l'encefalo per intero e osservare il labirinto osseo contenente la coclea e gli organi vestibolari periferici nella fossa cranica media. Effettuare ora due piccole incisioni accanto a ciascun labirinto osseo, afferrare e tirare lateralmente il canale semicircolare anteriore per escindere l'intera struttura. Immergere quindi immediatamente il labirinto escisso in una capsula di Petri contenente soluzione A CSF fredda su ghiaccio, continuando a perfondere con carbogeno.

La parte più delicata di questa procedura consiste nell'ottenere quantità costanti di tessuto vitale per ogni animale; si raccomanda pertanto di esercitare un'osservazione accurata e di utilizzare un'illuminazione specifica del tessuto. Successivamente, sotto un microscopio stereoscopico, tenere fermo il labirinto tramite la coclea e utilizzare pinze per fissare il tessuto al fondo della piastra usando pinze fini dritte. Praticare una piccola apertura nell'osso sopra il canale semicircolare anteriore.

Quindi raggiungere immediatamente al di sotto dell'osso ed effettuare un movimento rapido verso l'esterno, allontanandosi dall'ULA, per allargare delicatamente l'apertura. Proseguire in questo modo finché l'utricolo e il polo anteriore e laterale non siano completamente esposti. Successivamente, utilizzare pinze fini per sollevare delicatamente l'utricolo e il polo dal labirinto osseo fino a quando non siano completamente staccati.

Infine, afferrare saldamente gli organi vestibolari tra la punta della pinzetta e posizionarli nel buffer di lisi appena preparato all'interno di una microprovetta con tappo a vite. Ruotare delicatamente la pinzetta nel buffer per staccare gli organi vestibolari. Successivamente, dopo aver verificato al microscopio stereoscopico che la pinzetta sia priva di tessuto, avvitare il coperchio della microprovetta e congelare immediatamente il campione in azoto liquido per confrontare l'impatto del trattamento a infrarossi vicino tra topi giovani e topi più anziani.

L'mRNA è stato retrotrascritto in DNA complementare, quindi l'espressione della superossido dismutasi antiossidante uno o SOD uno è stata analizzata mediante densitometria: si è osservato un aumento significativo, superiore al doppio, dell'espressione di SOD uno normalizzata rispetto alla beta-actina negli animali giovani trattati con luce infrarossa rispetto agli animali giovani sottoposti a trattamento fittizio e agli animali giovani in cui l'infrarosso era stato bloccato. Anche gli animali anziani trattati con infrarosso hanno mostrato un'upregolazione superiore al doppio di SOD uno rispetto agli animali anziani in cui l'infrarosso era stato bloccato. Al termine di questa procedura, possono essere condotti esperimenti comportamentali, molecolari o fisiologici per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se la luce infrarossa aumenti l'espressione di altri geni o proteine nell'epitelio sensoriale vestibolare.

O la luce infrarossa vicina migliora le prestazioni complessive dell'equilibrio nei topi trattati?