Name: Vicino infrarosso (NIR) Luce aumenta lespressione di un marcatore di mitocondriale Funzione nel mouse vestibolare sensoriale Epithelium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Scopri gli effetti neuroprotettivi della luce vicino infrarosso sull'epitelio sensoriale vestibolare di topi invecchiati. Questo metodo non invasivo migliora la funzione mitocondriale e l'espressione genica antiossidante.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Paul Witting e la signora Genevieve Fong per la loro assistenza con estrazione mRNA e PCR, e Garnett Passe e Rodney Williams Memorial Foundation per il supporto.

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure descritte qui di seguito sono stati approvati dalla University of Sydney Comitato etico degli animali. 1. Gli animali NOTE: 1 e 8-9 mesi topi (C57 / BL6) sono stati ottenuti dalla Animal Resources Centre (Perth, Australia). I topi sono stati alloggiati in Facility Bosch Roditore presso l&#39;Università di Sydney. <ol><li> Casa topi in gabbie standard del mouse su un 12/12 luce hr / ciclo scuro con accesso a cibo e acqua ad libitum. </li><li> Topi Divide in ogni fascia d&#39;età in vicino infrarosso (NIR) trattati, o sham trattati (controllo) gruppi per il confronto. </li></ol> 2. vicino infrarosso (NIR) irradiazione e Sham trattamento <ol><li> Accorciare il pelo sulla regione della testa e del collo del mouse con un rasoio elettrico più vicino possibile impedire rapida ricrescita dei capelli prima del completamento del regime di trattamento. Per mantenere lo stato privo di patogeni dei topi, utilizzare etanolo al 70%per pulire strumenti tra gli animali da trucco e F10 veterinaria disinfettante tra animali di gabbie separate. Fare questo 2 - 3 giorni prima l&#39;inizio del trattamento in modo gli animali non sono più manico. </li><li> Trattenere il mouse tenendo l&#39;estremità prossimale della coda e permettono di rilassarsi nel palmo di una mano o superiore del banco di modo da ridurre al minimo lo stress che potrebbe portare a risultati falsi. </li><li> Tenere il NIR (670 nm) LED (light emitting diode) Dispositivo 1 - 2 cm di distanza dal (rasato) area esposta e accendere il dispositivo per 90 secondi (Figura 1A). NOTA: La variazione di temperatura a seguito di esposizione 90 sec stata misurata come &lt;0,2 ° C in 100 ml di acqua. </li><li> Ripetere i passaggi 2,2-2,3 per il gruppo di trattamento sham degli animali, ma lasciare l&#39;apparecchio spento (Figura 1B). </li><li> Ripetere i passaggi 2,2-2,3 per il gruppo di trattamento Nir-bloccato di animali, ma coprire il dispositivo con un foglio di alluminio. </li><li> Ripetere i passaggi 2,2-2,5 giorni alle approximate 24 intervalli hr per 5 giorni consecutivi. </li><li> Estrarre l&#39;epitelio vestibolare sensoriale (3 creste e 1 macula utricular) da entrambe le orecchie per il quinto giorno dopo il trattamento (vedere paragrafo 3). </li></ol> 3. Tissue estrazione 20 <ol><li> Preparare 300 ml di un liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) basato glicerolo-costituiti (in mM): 26 NaHCO3, 11 glucosio, 250 glicerolo, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1.2 MgCl 2, 2,5 e CaCl 2. Prima dell&#39;aggiunta di CaCl 2, gas la soluzione con CarboGen (95% O 2 e 5% CO 2) per stabilire un pH di 7,4 e di evitare la precipitazione di calcio (nuvolosità). Raffreddare la soluzione in un -80 ° C freezer per 45 minuti in modo da formare una sospensione di ghiaccio. </li><li> Preparare il tampone di lisi isolamento RNA etichettati microtubi tappo a vite (ferma il popping dei coperchi, quando le variazioni di pressione del tubo tra congelamento e scongelamento in azoto liquido) in basele istruzioni del fabbricante o usuali pratiche di laboratorio. Avere azoto liquido pronto in un matraccio dewar alluminio. NOTA: Usare indumenti protettivi e eyeware durante la manipolazione di azoto liquido. Assicurarsi che l&#39;azoto liquido viene utilizzato in una stanza ben ventilata come il volume della sua forma di gas è di circa 700 volte quella della sua forma liquida e può causare asfissia. </li><li> Profondamente anestetizzare topi con ketamina (400 mg / kg) tramite una iniezione intra-peritoneale. Lasciare che il riflesso arti posteriori a placarsi del tutto come indicazione che i topi sono completamente anestetizzati. </li><li> Decapitare topi con le forbici in acciaio inossidabile affilate e fare un&#39;incisione lungo la pelle sagittale del cranio con una lama di rasoio (arrotondato # 22). A questo punto e tutto passi 3,5-3,9, mantenere il più fresco possibile, l&#39;applicazione regolare di ACSF ghiacciato sopra il tessuto della volta cranica, cervello e apparato vestibolare sottostante. </li><li> Utilizzando il braccio punta di forbici modello standard fare un small &#39;incisione nel cranio a Lambda e tagliare lungo la sutura sagittale. </li><li> Scorrere delicatamente un braccio di un superficiale rongeurs sotto l&#39;osso parietale mantenendo la lama più vicino possibile alla superficie inferiore dell&#39;osso senza trascinare il cervello. Sicuro e tirare via l&#39;osso parietale laterale e l&#39;osso occipitale posteriormente fino a quando il cervello è esposto. </li><li> Utilizzare una piccola spatola di acciaio inox e sollevare il cervello dal anteriore e centrale fossa cranica per esporre il nervo vestibolococleare (CN VIII). Transetto il nervo per evitare inutili tensioni sui assoni afferenti primari che innervano direttamente le cellule ciliate vestibolari. </li><li> Rimuovere il cervello in toto dopo resezione del CN VIII. </li><li> Osservare il labirinto osseo contiene la coclea e gli organi vestibolari periferici nella fossa cranica media. Fare due piccole incisioni accanto a ogni labirinto osseo e asportare l&#39;intera struttura tenendo il canale semicircolare anteriore e tirare tardialleato. </li><li> Immergere immediatamente labirinti escisse in un piatto dissezione contenente soluzione ACSF ghiacciata (come descritto al punto 3.1), mentre continua perfusione con CarboGen. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio, tenere premuto il labirinto della coclea e fissarla al fondo del piatto con una pinza. <ol><li> Utilizzare pinze dritto fini graffiare una piccola apertura nel midollo sopra anteriore canale semicircolare (SSC) ampolla. </li><li> Allargare delicatamente questa apertura raggiungendo immediatamente sotto l&#39;osso e sfogliando verso l&#39;esterno lontano dal ampolla. Fare attenzione qui per non spingere pinze nell&#39;apertura e danneggiare il labirinto membranoso fragile sotto. Continuare in questo modo fino a quando il utricolo, anteriore e ampolle laterale sono tutti esposti. Se possibile rimuovere anche l&#39;ampolla posteriori. </li></ol></li><li> Utilizzando una pinza sottile, sollevare delicatamente il utricolo e ampolle dal labirinto osseo fino a quando non sono completamente staccati. Ove possibile, tenerlidai canali semicircolari associati per evitare di danneggiare l&#39;epitelio sensoriale. In alcuni casi, la parte prossimale del condotto membranoso semicircolare può avere bisogno di essere tagliato con forbici iris per rilasciare le ampolle dall&#39;osso. </li><li> Saldamente cogliere gli organi vestibolari tra la punta di una pinza e posto nel buffer di lisi preparata in precedenza al punto 3.2. Mescolare delicatamente la pinza intorno nel buffer per garantire organi vestibolari hanno staccato dalla pinza. Controllare questo è il caso per portare le pinze con lo stereomicroscopio. <ol><li> Avvitare sul coperchio microtubuli e congelare il campione in azoto liquido immediatamente. </li></ol></li></ol> 4. RNA Estrazione e RT-PCR <ol><li> Seguire metodi standard di RNA messaggero (mRNA) di estrazione secondo le istruzioni del fabbricante o protocolli di laboratorio preferito. NOTA: un kit commerciale che utilizzava RNA carrier per aiutare isolare le piccole rese di mRNA è stato utilizzato in questoprotocollo. Volumi di eluizione inferiori possono essere usati per aumentare le concentrazioni finali di mRNA. NOTA: Controlli negativo &quot;no enzima&quot; (NEC) e controlli &quot;non modello DNA&quot; (NTC) devono essere completati per garantire la validità degli effetti osservati. </li><li> Applicare metodi standard di trascrizione inversa di mRNA a DNA complementare (cDNA) e l&#39;amplificazione di geni bersaglio 21-23. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

I risultati rappresentativi qui descritti mostrano che breve consegna transcranica di NIR luce (90 sec / giorno per 5 giorni) è sufficiente per aumentare i livelli di espressione antiossidante nei topi anziani rispetto ai topi sham trattati. Mentre calore emesso potrebbe rappresentare una fonte di mitocondriale e / o l&#39;attivazione neuronale, come riportato per ratto vestibolare afferenti 24 - nostra misurazione del calore emesso dal LED NIR dispositivo era &lt;0,2 ° C superiore al 90 sec, e come tale è im...

Il calo delle prestazioni equilibrio e cadute successive sono comuni, e le caratteristiche, purtroppo, spesso definiscono di invecchiamento naturale 1. L&#39;impatto di questo declino può essere sia fisica che sociale, e riduce in modo significativo la qualità della vita per le persone anziane. In risposta, terapie fisiche e riabilitazione sono stati al centro della ricerca di cadute, ma non sono stati associati con la riduzione consistente della prevalenza di cadute ripetute. Allo stesso tempo, il lavoro indagando i cambiamenti nel sistema periferico o centrale vestibolare (il sistema responsabile per mantenere l&#39;equilibrio) è scarso, e potenziali strategie terapeutiche destinate a questi sistemi e le cause di squilibrio limitato. Un recente lavoro su malattie neurodegenerative legate all&#39;età, tra cui età-correlate degenerazione maculare 2-4, modelli di malattia di Alzheimer 5-8, e il morbo di Parkinson 9-12 hanno mostrato effetti neuroprotettivi di simple applicazione non invasiva del vicino infrarosso (NIR) luce. Inoltre, nel sistema vestibolare, NIR è stato usato per aumentare l&#39;attività di neuroni vestibolari afferenti primari in vitro 13. Mentre il meccanismo di Nir luce non è ben compreso,, maggior parte degli studi che utilizzano NIR hanno suggerito che Nir stimola mitocondri complesso IV (citocromo c ossidasi) 14-17 per facilitare il metabolismo cellulare. Nel epitelio sensoriale vestibolare piastra sottocuticolare delle cellule ciliate che tipo è denso in mitocondri 18 e come tale può rappresentare un luogo di azione per il trattamento terapeutico Nir. Qui, una breve, regime di trattamento non invasivo transcranially applicato NIR che può essere utilizzato per misurare il metabolismo cellulare (e di conseguenza, la funzione mitocondriale) nel topo vestibolare dell&#39;epitelio sensoriale descritto. Anche discusso è una preparazione dell&#39;epitelio sensoriale vestibolare e si dimostra che NIR aumenta l&#39;espressione di un ubiquitonoi anti-ossidante (superossido dismutasi 1) nell&#39;epitelio sensoriale - precedentemente dimostrato di essere importante per la sopravvivenza delle cellule dei capelli coclea 19.

<table><tbody><tr><td>Quantum WARP 10</td><td>Quantum Devices</td><td>2070N030-A</td><td></td></tr><tr><td>Microtubuli con tappo a vite Plastica</td><td>scientifica di qualità</td><td>520-GRD-Q</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Parnell, Alessandria Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici modello standard</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgiche in acciaio al carbonio #22</td><td>Livingstone</td><td>SBLDCL 22</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeurs</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>A60S</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 SF pinze</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Isolato II RNA Micro Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-52075</td><td></td></tr></tbody></table>

vicino infrarosso (nir) luce aumenta l&#39;espressione di un marcatore di mitocondriale funzione nel mouse vestibolare sensoriale epithelium

Near Infrared (NIr) Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

Strategie per attenuare il declino in funzione di bilanciamento con l&#39;aumentare dell&#39;età sono prevalentemente concentrati su terapie fisiche, tra cui le attività di bilancio e l&#39;esercizio fisico. Tuttavia, questi approcci non affrontano le cause alla base dell&#39;equilibrio declino. Usando topi, è stato valutato l&#39;effetto di luce vicino infrarosso (NIR) sul metabolismo di cellule dell&#39;epitelio sensoriale vestibolare. I dati raccolti mostrano che questo intervento semplice e sicuro può proteggere queste cellule vulnerabili dagli effetti deleteri di invecchiamento naturale. mRNA è stato estratto dalla isolato epitelio periferico vestibolare sensoriale (ampollare crista e macula utricular) e successivamente trascritto in una libreria di cDNA. Questa libreria è stato poi indagato per l&#39;espressione di antiossidanti onnipresente (SOD-1). Antiossidante espressione genica è stato poi utilizzato per quantificare il metabolismo cellulare. Utilizzando consegna transcranica di Nir in giovane (4 settimane) e anziani (8-9 mesi) i topi, e un regime di trattamento breve (90 sec / giorno per 5 days), questo lavoro suggerisce Nir sola può essere sufficiente per migliorare la funzione mitocondriale nell&#39;epitelio sensoriale vestibolare. Dal momento che non ci sono attualmente disponibili, a prezzi accessibili, i metodi non invasivi di terapia per migliorare la funzione delle cellule dei capelli vestibolare, l&#39;applicazione delle radiazioni NIR esterna fornisce una strategia potenziale per contrastare l&#39;impatto dell&#39;invecchiamento sul metabolismo cellulare inthe vestibolare epitelio sensoriale.

Per confrontare l&#39;impatto del trattamento Nir nei giovani (4 settimane) e anziani (8-9 mesi) topi abbiamo misurato l&#39;espressione di antiossidanti superossido dismutasi 1 (SOD-1) nei giovani (n = 16) e anziani (n = 20) i topi che erano NIR-trattata, sham-trattati, o Nir-bloccato. figura 2 mostra un aumento significativo normalizzato SOD-1 β-actina di oltre 2 volte nei giovani Nir-animali trattati rispetto ai giovani animali sham trattati (p &lt;0.01) e animali giovani NIR-bloccati (p &lt;0.01). A...

Disfunzione mitocondriale è una caratteristica della senescenza cellulare. Questo documento utilizza nel vicino infrarosso (NIR) trattamento non invasivo per migliorare la funzione mitocondriale nel invecchiamento del mouse vestibolare epitelio sensoriale.

Vicino infrarosso (NIR) Luce aumenta l&#39;espressione di un marcatore di mitocondriale Funzione nel mouse vestibolare sensoriale Epithelium

Strategies for attenuating decline in balance function with increasing age are predominantly focused on physical therapies including balance tasks and ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare l'eventuale effetto neuroprotettivo della luce infrarossa vicina sull'epitelio sensoriale vestibolare del topo. Questo viene ottenuto mediante una semplice applicazione transcranica a breve termine di luce infrarossa vicina sui topi in diverse fasi di sviluppo. Come secondo passaggio, vengono dissecati i labirinti ossei degli animali trattati, consentendo l'isolamento dell'epitelio sensoriale vestibolare.Successivamente, l'espressione del gene antiossidante di interesse viene misurata mediante R-T-P-C-R per valutare l'impatto del trattamento sulle prestazioni mitocondriali. Infine, viene eseguita una densitometria per valutare l'effetto di un breve trattamento con luce infrarossa sull'espressione di specifici geni antiossidanti nei topi. Il principale vantaggio di questa tecnica di trattamento con infrarossi è che è semplice e non invasiva, consentendo ulteriori analisi fisiologiche, molecolari e comportamentali a valle del trattamento.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla possibile neuroprotezione del sistema vestibolare periferico durante l'invecchiamento normale, oppure al miglioramento delle prestazioni dell

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I fibroblasti di pazienti portatori di mutazioni nel Parkinson geni che causano malattie rappresentano un facile...

L&#39;uso di fibroblasti umani primari per il monitoraggio fenotipi mitocondriali nel campo della malattia di Parkinson

Fonte: Zhang, L., et al. La luce nel vicino infrarosso (NIr) aumenta l'espressione di un marcatore della funzione mitocondriale nell'epitelio sensoriale vestibolare del topo. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra il processo di applicazione della luce NIr al cuoio capelluto di un topo rasato per attivare i neuroni vestibolari e stimolare la produzione di superossido dismutasi-1 (SOD-1), supportando la funzione neuronale. La procedura evidenzia la terapia NIr come strategia neuroprotettiva.

Modulazione della segnalazione neuronale sensoriale in un modello murino utilizzando la luce del vicino infrarosso

Questo video illustra un metodo, utilizzando un clinico 3 scanner T, per contrasto-enhanced RM del mouse ingenua proiezione visiva e per studi ripetitivi e longitudinali in vivo di degenerazione del nervo ottico associati a lesioni acute ottico schiacciamento del nervo e la degenerazione del nervo ottico cronica topi knock-out (p50 KO).

In vivo imaging di Optic Nerve Fiber Integrity by MRI Contrast-Enhanced nei topi

La luce allo xeno non coerente è stata fatta passare attraverso filtri di interferenza a banda stretta e densità neutra per fornire luce di lunghezza d'onda e intensità variabili alle cellule in coltura. Questo protocollo è stato utilizzato per valutare gli effetti della terapia con luce rossa/vicino infrarosso sulla produzione di specie reattive in vitro: non sono stati osservati effetti utilizzando i parametri testati.

Metodo per la valutazione degli effetti di un intervallo di lunghezze d'onda e intensità di / vicino-infrarosso di terapia della luce rossa sullo stress ossidativo In Vitro

Terapia di fotobiomodulazione è un'innovativa modalità non invasiva per il trattamento di una vasta gamma di disturbi neurologici e psichiatrici e può anche migliorare la funzione cerebrale sano. Questo protocollo include una guida dettagliata all'esecuzione fotobiomodulazione cervello nei topi di transcranial luce consegna, che può essere adattato per l'uso in altri roditori di laboratorio.

Un protocollo per la terapia di fotobiomodulazione Transcranial in topi

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza coloranti Near-Infrared in combinazione con immunoistochimica e scansione ad alta risoluzione per analisi proteine nelle regioni cerebrali.

Utilizzo della fluorescenza Near-Infrared e scansione ad alta risoluzione per misurare l'espressione proteica nel cervello del roditore

Il presente protocollo descrive un'operazione di imaging a fluorescenza NIR-II dettagliata e in tempo reale di un topo utilizzando un dispositivo di imaging ottico NIR-II.

Una sonda di fluorescenza NIR-II luminosa per l'imaging vascolare e tumorale

Questa procedura descrive come stabilire colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino ed è seguita dalla trasfezione con il gene Pulser sistema di elettroporazione MXCell.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

Qui si descrive una raccolta di dati e metodo di analisi dei dati funzionali per Near Infrared Spectroscopy (fNIRS), un romanzo non invasivo sistema di imaging del cervello utilizzata in neuroscienze cognitive, in particolare nello studio del cervello sviluppo del bambino. Questo metodo fornisce uno standard universale di acquisizione ed analisi dei dati vitali per l'interpretazione dei dati e le scoperte scientifiche.

Esplorare le funzioni cognitive in neonati, bambini e adulti con Near Infrared Spectroscopy

Questa procedura mostra come utilizzare il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell di identificare rapidamente e facilmente le migliori condizioni di elettroporazione di fibroblasti embrionali di topo (MEF) o altre cellule primarie. Considerazioni per la risoluzione dei problemi vengono discussi anche nel video associato.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Scopri gli effetti neuroprotettivi della luce vicino infrarosso sull'epitelio sensoriale vestibolare di topi invecchiati. Questo metodo non invasivo migliora la funzione mitocondriale e l'espressione genica antiossidante.

Vicino infrarosso (NIR) Luce aumenta lespressione di un marcatore di mitocondriale Funzione nel mouse vestibolare sensoriale Epithelium (Video) | JoVE Journal

Vicino infrarosso (NIR) Luce aumenta l'espressione di un marcatore di mitocondriale Funzione nel mouse vestibolare sensoriale Epithelium

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