Vicino infrarosso (NIR) Luce aumenta l'espressione di un marcatore di mitocondriale Funzione nel mouse vestibolare sensoriale Epithelium

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare il potenziale impatto neuroprotettivo della luce nel vicino infrarosso sull'epitelio sensoriale vestibolare del topo. Ciò si ottiene con una semplice applicazione transcranica a breve termine della luce nel vicino infrarosso ai topi in vari stadi di sviluppo. In una seconda fase, i labirinti ossei degli animali trattati vengono sezionati, consentendo l'isolamento dell'epitelio sensoriale vestibolare.

Successivamente, l'espressione del gene antiossidante di interesse viene misurata mediante R-T-P-C-R per valutare l'impatto del trattamento sulle prestazioni mitocondriali. Infine, la densitometria viene eseguita per valutare l'effetto di un breve trattamento con luce nel vicino infrarosso sull'espressione di specifici geni antiossidanti nei topi. Il vantaggio principale di questa tecnica di trattamento nel vicino infrarosso è che è semplice e non invasiva, consentendo ulteriori analisi fisiologiche, molecolari e comportamentali a valle dopo il trattamento.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla potenziale neuroprotezione del sistema vestibolare periferico durante il normale invecchiamento, o al miglioramento delle prestazioni equilibrate a seguito di malattia vestibolare o deficit. Due o tre giorni prima di iniziare l'esperimento, radere il pelo sulle regioni della testa e del collo di ciascun topo il più vicino possibile per prevenire la ricrescita dei peli dell'animale prima del completamento del regime di trattamento. Per mantenere lo stato di assenza di agenti patogeni degli animali, pulire gli strumenti con etanolo al 70% tra ogni rasatura.

Quindi, il giorno del trattamento per ogni internato animale, prendi il topo all'estremità prossimale della coda e lascialo rilassare nel palmo di una mano per ridurre al minimo lo stress per gli animali trattati nel vicino infrarosso. Per ogni animale, tenere un dispositivo LED a 670 nanometri, a uno o due centimetri di distanza dall'area rasata, e accendere il dispositivo per 90 secondi. Per il gruppo fittizio, ripetere la procedura di trattamento allo stesso modo, ma con il dispositivo spento per il gruppo bloccato nel vicino infrarosso, trattare gli animali allo stesso modo del gruppo trattato nel vicino infrarosso, ma con il dispositivo coperto con un foglio di alluminio.

Dopo aver ripetuto i trattamenti per ciascun gruppo a intervalli di 24 ore per cinque giorni consecutivi, congelare il liquido cerebrospinale artificiale a base di glicerolo appena preparato o l'A CSF in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per 45 minuti fino a quando non si forma un impasto di ghiaccio. Prossimo. Per ogni topo, utilizzare una lama di rasoio arrotondata numero 22 per praticare un'incisione lungo la pelle sagittale del cranio, mantenendo il cervello della volta cranica e l'apparato vestibolare sottostante il più fresco possibile con applicazioni regolari di liquido cerebrospinale freddo ghiacciato sul tessuto. Quindi usa il braccio appuntito di un paio di forbici standard per praticare una piccola incisione nel cranio a Lambda e taglia lungo la sutura sagittale.

Quindi far scorrere delicatamente un braccio di un URS poco profondo sotto l'osso parietale, quindi fissare e tirare l'osso parietale lateralmente e l'osso occipitale posteriormente fino a quando il cervello non è esposto. Quindi usa una piccola spatola di acciaio inossidabile per sollevare il cervello dalla fossa cranica anteriore e media. Per esporre il nervo cocleare vestibolare, sezionare il nervo per evitare tensioni non necessarie sugli assoni afferenti primari che innervano direttamente le cellule ciliate vestibolari.

Quindi rimuovere il cervello in toto e osservare il labirinto osseo contenente la coclea e gli organi vestibolari periferici nella fossa cranica media. Ora fai due piccole incisioni accanto a ciascun labirinto osseo e tieni premuto e tira lateralmente il canale semicircolare anteriore per asportare l'intera struttura. Quindi immergere immediatamente il labirinto asportato in una capsula da dissezione contenente la soluzione ghiacciata di A CSF perfondendo continuamente con il carbogeno.

La parte più difficile di questa procedura è ottenere quantità costanti di tessuto vitale per ogni animale: si consiglia di praticare un'attenta osservazione e un'illuminazione specifica del tessuto. Quindi, sotto uno stereomicroscopio, tieni premuto il labirinto per la coclea e usa una pinza per fissare il tessuto al fondo del piatto usando una pinza fine dritta. Gratta una piccola apertura nell'osso sopra il canale semicircolare anteriore ula.

Quindi raggiungi immediatamente sotto l'osso e scorri verso l'esterno lontano dall'ULA per allargare delicatamente l'apertura. Continuare in questo modo fino a quando l'utricolo e la pule anteriore e laterale sono tutti esposti. Quindi usa una pinza sottile per sollevare delicatamente l'utricolo e la pule dal labirinto osseo fino a quando non sono completamente staccati.

Infine, afferrare saldamente gli organi vestibolari tra la punta della pinza e metterli nella lisi appena preparata. Tampone in un microtubo con tappo a vite, agitare delicatamente la pinza nel tampone per staccare gli organi vestibolari. Quindi, dopo aver confermato che le pinze sono libere dal tessuto allo stereomicroscopio, avvitare il coperchio del micro tubulo e congelare immediatamente il campione in azoto liquido per confrontare l'impatto del trattamento nel vicino infrarosso tra topi giovani e anziani.

Messaggero, l'RNA è stato trascritto invertito in DNA complementare, quindi l'espressione dell'antiossidante superossido dismutasi uno o SOD uno è stata analizzata misurata mediante densitometria. È stato osservato un aumento significativo dell'espressione della zolla normalizzata della beta actina di oltre il doppio negli animali giovani trattati nel vicino infrarosso rispetto agli animali giovani trattati con sham e ai giovani animali bloccati nel vicino infrarosso. Gli animali più anziani trattati nel vicino infrarosso hanno anche mostrato una sovraregolazione più che doppia rispetto agli animali più anziani bloccati nel vicino infrarosso. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire esperimenti comportamentali, molecolari o fisiologici per rispondere a ulteriori domande come: la luce nel vicino infrarosso aumenta l'espressione di altri geni o proteine nell'epitelio sensoriale vestibolare?

O la luce nel vicino infrarosso migliora le prestazioni complessive dell'equilibrio dei topi trattati?