Primer per immunoistochimica su Cryosectioned Rat tessuto cerebrale: Esempio colorazione per Microglia e neuroni

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare l'immunohistochimica al fine di visualizzare le proteine di interesse. In questo esempio, IBA1 per le microglia e pan-neuronale per i neuroni. Questo risultato si ottiene innanzitutto posizionando le sezioni preparate in una soluzione bloccante per prevenire il legame non specifico.

Come secondo passaggio, gli anticorpi che riconoscono le due diverse proteine di interesse vengono applicati sulle sezioni e lasciati in incubazione tutta la notte. Successivamente, le sezioni vengono lavate e incubate con anticorpi secondari al fine di aggiungere marcatori fluorescenti agli anticorpi primari. I risultati della doppia marcatura possono evidenziare colorazioni delle microglia all'interno dei campi di neuroni.

Generalmente, le persone nuove a questa tecnica incontreranno inizialmente delle difficoltà, poiché ci sono molti parametri da regolare. Oggi dimostrerà questa tecnica Hazel May, una studentessa universitaria del nostro laboratorio. Per iniziare, fissare e sezionare con attenzione i cervelli di roditore come descritto nel protocollo testuale allegato, quindi conservarli con cura a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo.

Quando si è pronti per proseguire con il protocollo, rimuovere le vetrine dal congelatore e farle scongelare a temperatura ambiente. Una volta scongelate, posizionare le vetrine su una rastrelliera e lavarle tre volte in PBS per cinque minuti ciascuna. Da questo momento in poi, evitare che le sezioni si secchino.

Asciugare i bordi dei vetrini e creare un contorno idrofobo lungo il bordo del vetrino utilizzando una penna ad albero per garantire una distribuzione uniforme del liquido e ridurre gli effetti di bordo. Successivamente, bloccare le sezioni aggiungendo 300 microlitri di siero in PBS su ciascun vetrino. Il siero deve provenire dalla stessa specie in cui è stato prodotto l'anticorpo secondario.

In questo caso, è stato utilizzato siero di asino. Assicurarsi che la soluzione di blocco si estenda fino al bordo del vetrino e copra completamente il tessuto. Per evitare una colorazione irregolare, collocare i vetrini in una camera umidificata e incubare a temperatura ambiente per un'ora.

Durante l'incubazione, preparare gli anticorpi primari diluendo l'anticorpo IBA1 a 1:5.000 e l'anticorpo pan-neuronale a 1:500 in una miscela contenente il 1% di siero di asino. In PBS, rimuovere la soluzione di blocco e aggiungere 300 microlitri della soluzione anticorpale, che contiene entrambi gli anticorpi di interesse. Preparare inoltre tre vetrini di controllo.

Aggiungere 300 microlitri della IVA, una sola diluizione su un vetrino, 300 microlitri della diluizione dell'anticorpo pan-neuronale su un secondo vetrino e 300 microlitri di siero di asino al 1% in PBS. Su un terzo vetrino, posizionare tutti i vetrini in una camera umidificata e incubarli tutta la notte a quattro gradi Celsius; il mattino seguente, lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti ciascuno.

Preparare la miscela di anticorpi secondari fluorescenti diluendo entrambi in rapporto 1:250 in soluzione di siero di asino all'1% in PBS. Aggiungere 300 microlitri della miscela su ogni vetrino e posizionare i vetrini in una camera d'umidità opaca per 60 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti ciascuna, e infine risciacquarli in acqua distillata doppia.

Proteggere i vetrini dalla luce durante il lavaggio. In PBS, aggiungere qualche goccia di un mezzo di montaggio acquoso che aiuta a preservare l'intensità del segnale fluorescente su ciascun vetrino. Quindi coprire, applicare il coverslip e rimuovere eventuali bolle d'aria residue utilizzando un applicatore con estremità di cotone per sigillare il mezzo di montaggio sui vetrini e impedire che le sezioni si secchino.

Applicare lo smalto per unghie sui bordi. I vetrini vengono lasciati asciugare in posizione orizzontale per un'ora in una scatola protetta dalla luce, prima di essere conservati in un contenitore opaco avvolto nella pellicola di alluminio a quattro gradi centigradi. Una volta che lo smalto per unghie è asciutto, portare i vetrini nella stanza del microscopio per l'acquisizione delle immagini.

Preparare la stanza spegnendo le luci principali e oscurando tutte le altre fonti di luce esterna. Accendere il microscopio, la sorgente di luce fluorescente e il computer per l'acquisizione delle immagini. Quindi posizionare un vetrino sul portavetrino del microscopio e metterlo a fuoco.

Utilizzando il software fornito, impostare l'esposizione per ciascuna lunghezza d'onda separatamente. Evitare di esporre eccessivamente il campione alla luce per lunghi periodi di tempo per prevenire il fotoblesamento del campione. Quindi acquisire le immagini in ogni canale senza spostare la sezione o regolare il fuoco.

Combinare le immagini utilizzando il software di acquisizione e salvarle per successive analisi d'immagine. Utilizzando il protocollo di colorazione appena descritto, è possibile ottenere facilmente immagini fluorescenti come quelle mostrate qui: nel canale rosso, le microglia positive per IBA1 risultano chiaramente visibili, mentre nel canale verde i neuroni positivi per il marcatore pan-neuronale si distinguono rispetto al fondo. Vengono mostrate anche le immagini di controllo per entrambe queste colorazioni con anticorpi.

La doppia marcatura scura con IBA1 e un marcatore pan-neuronale mostrata qui dimostra principalmente microglia ramificata con lunghe e sottili proiezioni neuronali evidenti attraverso i diversi strati corticali. Risultati di colorazione come quelli mostrati qui possono verificarsi anche se la qualità del tessuto è scarsa. Una scarsa qualità del tessuto si evidenzia per l'assenza di corpi cellulari ben definiti e per la frammentazione dei processi microgliali e neuronali.

Non c'è chiarezza nella colorazione dei microglia e una completa assenza di colorazione dei neuroni, rendendo l'immagine sovrapposta priva di significato durante il tentativo di questa tecnica. È importante coprire uniformemente le sezioni e ricordare di non farle asciugare tra un passaggio e l'altro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione delle tecniche introduttive di immunohistochimica.