Name: Primer per immunoistochimica su Cryosectioned Rat tessuto cerebrale: Esempio colorazione per Microglia e neuroni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Impara l'immunoistochimica su sezioni cerebrali di ratto per visualizzare microglia e neuroni con marcatura duale. Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile per studiare le interazioni cellulari nel cervello.

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Gli autori desiderano ringraziare il signor Ryan Hart e il signor Arriz Lucas per il loro prezioso feedback su questa comunicazione. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH NINDS R01 NS065052 e Phoenix Children's Hospital Mission Support Funds.

NOTA: Tutte le procedure sono state eseguite in conformità alla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) della University of Arizona. Un elenco di materiali e attrezzature raccomandate possono essere trovate nella tabella 1. 1. Preparazione del tessuto <ol><li> Perfusion <ol><li> Euthanize roditore con una overdose di pentobarbital sodico (25 mg / kg, IP), e profumato transcardially con tampone fosfato salino (PBS) fino a completo dissanguato (3-5 min) a una velocità di flusso di 8 ml / min. Per le istruzioni di perfusione in profondità, vedi Gage et al 2012 9. </li><li> Subito dopo PBS filo, fissare il tessuto mediante perfusione con paraformaldeide al 4% in PBS per 15-20 min ad una velocità di flusso di 8 ml / min. </li><li> Rimuovere cervello e posto in paraformaldeide al 4% per 24 ore, seguita da soluzioni di saccarosio graduati (15%, 30%, 30%, in sequenza, preparata in soluzione salina tamponata con Tris) a 4 ° C. Trasferire il cervello per la successiva soluzione di saccarosio oolo dopo che il cervello ha affondato in ogni soluzione. Nota: Di solito, 5 giorni in ogni soluzione è un tempo sufficiente per il tessuto di affondare. </li></ol></li><li> Tissue Congelamento e criosezionamento <ol><li> Posizionare il cervello in mezzo di inclusione, quali OCT e immergere in isopentano a una temperatura di -35 ° C. Lasciare che il cervello di congelare per un minimo di 10 minuti, e poi conservare a -80 ° C. Possono sorgere problemi se diligenza a temperatura non è presa; si rimanda la discussione per la risoluzione dei problemi. </li><li> Tagliare sezioni coronali seriali ad uno spessore di 20 um e una temperatura di -20 ° C. Raccogliere il tessuto su vetrini caricati positivamente. Sezioni del cervello possono essere collocati in una scatola di diapositive avvolto in un foglio in una busta zip-top e conservati a lungo termine a -80 ° C. Questo metodo di memorizzazione crea un doppio limite per evitare l&#39;esposizione all&#39;aria e al gelo. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Processing NOTA: attrezzature e materiali Esempio r, facoltativo per la colorazione sono mostrati in figura 3. Le alternative sono disponibili, tuttavia, queste immagini aiuteranno chi è nuovo di immunoistochimica per visualizzare elementi del caso prima di procedere all&#39;acquisto. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> Figura 3: Esempio di oggetti necessari per la colorazione immunoistochimica La scatola nera mostrato in (A) è una camera di umidità ideale per immunofluorescenza, come diapositive sono protetti dalla luce, senza la necessità di avvolgere la scatola su un foglio.. Dopo sezionamento, vetrini possono essere memorizzati in una scatola quali la scatola gialla mostrato in (B). Avvolgere la scatola ermeticamente in un foglio e messa in un sacchetto di zip-top prima freezer aiuta a proteggere i campioni di tessuto da bruciature da freddo. Un esempio di diapositive è dato in (C), con diversi piatti di colorazione descritti in (D) e (E </strong&gt;). Coprioggetto può variare in termini di dimensioni e spessore (F), tuttavia 1.2 vetrini spessi di risultati di imaging belle sulla maggior parte microscopi diritti e confocale. Una matita come quello mostrato in (G) può essere utilizzato per etichettare diapositive. Marcatore permanente dovrebbe essere evitato come l&#39;inchiostro può essere eseguito, che interessano sia la colorazione e la capacità di determinare ciò che il campione è. Un mini penna pap come quello mostrato in (H) permette un bordo repellenti da trarre su vetrini. <ol><li> Preparazione diapositive <ol><li> Estrarre i vetrini da freezer e scongelare a temperatura ambiente. <ol><li> Opzionale: Se le sezioni hanno già galleggiare da diapositive, collocare le diapositive scongelati in forno a 60 ° C per non più di 4 ore per evitare sezioni di tessuto da galleggiante al largo diapositive. </li></ol></li><li> Posizionare i vetrini in un rack scorrevole e piatto corrispondente. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno, cambiando soluzione tra un lavaggio. Da questo punto in avanti, evitare di avere sectiComponenti senza liquidi per periodi di tempo prolungati. Nota: Se le sezioni asciugano, la colorazione di fondo è aumentata e dati significativi non può essere ottenuto in modo affidabile. </li></ol></li><li> Tissue Colorazione <ol><li> In una scatola di colorazione a tenuta di luce, creare una &quot;camera umida&quot; con i tessuti privi di lanugine imbevuto con acqua deionizzata. </li><li> Asciugare i bordi della slitta con un tessuto privo di lanugine, usare un mini penna pap per fare un bordo liquido repellente ai margini della diapositiva, lontano da sezioni di tessuto. Questo bordo dovrebbe garantire un ampio spazio fra il menisco del liquido e il bordo del tessuto in modo che la tensione superficiale non influisce colorazione. NOTA: Il confine repellente penna pap può essere applicato prima del 2.1.3, se gli anticorpi di interesse non richiedono microonde recupero dell&#39;antigene. Se la penna pap è stato applicato prima del lavaggio in PBS, l&#39;integrità del confine liquido repellente deve essere controllato in questa fase. Utilizzare una penna mini-pap per colmare eventuali lacune nel confine. </li><li&gt; Con diapositive disposti orizzontalmente, l&#39;antigene non specifico blocco vincolante incubando nel 4% v / v siero in PBS (soluzione di blocco). Dispensare 300 ml di soluzione di blocco per vetrino per 1 ora a temperatura ambiente. Assicurarsi che la soluzione blocco estende alla penna pap al bordo della diapositiva e copre completamente il tessuto per evitare colorazione irregolare causato dalla tensione superficiale vicino al tessuto. <ol><li> Utilizzare siero dalla stessa specie in cui è fatto anticorpo secondario. Nota: In questa procedura, gli anticorpi secondari sono realizzati in asino, e quindi viene utilizzato siero asino. Se si utilizzano anticorpi secondari di due o più specie diverse, includere siero di ogni specie. </li></ol></li><li> Pipetta anticorpo primario su vetrini. Nota: le concentrazioni di anticorpi per questa colorazione sono stati ottimizzati a 1: 5.000 e 1: 500 per Iba1 e Pan-neuronale, rispettivamente. Queste concentrazioni sono stati trovati per mostrare colorazione significativo con l&#39;assenza di colorazione di fondo. <ol><li> Diluire soluzione blocco1% di siero in PBS e aggiungere anticorpi primari. Dispensare 300 ml di soluzione di anticorpo primario in 1% di siero per vetrino. Ancora una volta, assicura il fluido è al bordo della penna pap. Incubare per una notte a 4 ° C. </li><li> Include tre vetrini di controllo: uno che contiene anticorpi né Iba1 né Pan-neuronali, una con Iba1 senza anticorpi Pan-neuronale, e uno con l&#39;anticorpo Pan-neuronale senza Iba1. Macchia queste diapositive nella stessa seduta con le stesse soluzioni, tuttavia omettere le anticorpi primari per verificare il legame degli anticorpi secondari non specifici. </li></ol></li><li> La mattina seguente, lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno, cambiando soluzione tra un lavaggio. </li><li> Gli anticorpi fluorescenti sono sensibili alla luce, quindi, da questo punto in avanti, ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce garantendo contenitori lavaggio sono avvolti in fogli e ibridazione scatole sono nero o incubate al buio. Pipettare gli anticorpi secondari appropriati in tutte le diapositive e incubare per60 min a temperatura ambiente ad una concentrazione di 1: 250 in soluzione di blocco (vedere fase 2.2.3) in una &quot;camera umida&quot; a tenuta di luce (vedere fase 2.2.1). <ol><li> Utilizzare anticorpi secondari di differenti lunghezze d&#39;onda. Qui, per il coniglio anticorpo primario anti-Iba1, utilizzare asino anti-coniglio 594 come l&#39;anticorpo secondario appropriato. Per il mouse anticorpo primario anti-Pan-neuronale, utilizzare asino anti-topo 488 come l&#39;anticorpo secondario appropriato. In alternativa, utilizzare anti-coniglio 488 e anti-topo 594. </li></ol></li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno. </li><li> Opzionale: eseguire colorazione nucleare. <ol><li> Posto in Hoechst (o altro colorazione nucleare) ad una concentrazione di 0,03 mg / ml in doppia H 2 0 distillata per esattamente 60 sec. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno. </li></ol></li><li> Lavare in DDH 2 0. </li></ol></li><li> Coprioggetto <ol><li> Vetrini coprioggetto con un mezzo di montaggio a base acquosa, come Fluoromount-G o ProlongGold. Fare attenzione a rimuovere tutte le bolle con un applicatore di cotone con punta. Nota: Altri agenti di montaggio potrebbero essere utilizzati, per quanto alto sanguinare-through tra coloranti è stato notato da alcuni pochi giorni di copertura dei vetrini. </li><li> Utilizzare smalto trasparente per sigillare i bordi, impedendo sezioni si secchi a causa dell&#39;evaporazione. Lasciare smalto si asciughi in un contenitore a tenuta di luce mentre scivoli resta piatta ea temperatura ambiente, e poi conservare in un contenitore a tenuta di luce avvolti in un foglio a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Imaging Tissue Stained <ol><li> Microscopia <ol><li> Lasciare che il smalto ad asciugare per almeno un&#39;ora prima di iniziare la microscopia, che dovrebbe avvenire in una stanza buia. </li><li> Acquisire microfotografie usando un confocale o microscopio di ricerca con una sorgente di luce fluorescente e un attacco della telecamera digitale. Utilizzando il software di accompagnamento, impostare l&#39;esposizione per ogni lunghezza d&#39;onda - 405, 488, e 594 - separatamente. Nota: in modo approfondito le istruzioni di imaging dovrebbero essere disponibili on-line presso il produttore del microscopio. </li><li> Acquisire microfotografie in ogni canale senza spostare le sezioni o la regolazione della messa a fuoco. Prendere immagini a colori, in scala di grigi o alternativamente e convertire in colore dopo. Nota: Il colore o scala di grigi di ciascun canale possono essere raccolti in post-processing. </li><li> Assicurarsi che le sezioni di tessuto non siano esposti a luce ambiente o alla luce microscopica per lunghi periodi di tempo, come si verificherà fotometabolismo delle sezioni. Per evitare questo, aumentare il tempo di esposizione, piuttosto che aumentando l&#39;intensità della luce / laser. </li><li> Non spegnere la sorgente di luce fluorescente entro 30 minuti di essere stato acceso. Nota: Modificare la sorgente e lo spegnimento in rapida successione, potrebbe diminuire la durata della vita della lampadina fluorescente. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> J Immunol. 45, 159-170 (1942).</li>
<li>Marshall, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+adrenocorticotropic+hormone+by+histochemical+and+immunochemical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods.</a> The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).</li>
<li>Mellors, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+demonstration+of+the+in+vivo+localization+of+antibodies%3A+antigenic+components+of+the+kidney+and+the+pathogenesis+of+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li>
<li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+hebdomadaires+des+seances+de+l%27Academie+des+sciences.+Serie+D%3A+Sciences+naturelles%22%5BJournal%5D)">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).</li>
<li>Cuello, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCuello%2C+AC+%22Immunohistochemistry%22">Immunohistochemistry</a>. , Wiley. (1983).</li>
<li>Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJunqueira%2C+LCU+%22Junqueira%27s+basic+histology+%3A+text+and+atlas%22">Junqueira's basic histology : text and atlas</a>. , Thirteenth edition / edn, (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Christensen, N. K., Winther, L. Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. Kumar, G. L., Rudbeck, L. , DAKO North America. Carpinteria, California. 103-108 (2009).</li>
<li>Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyramide+signal+amplification+method+in+multiple-label+immunofluorescence+confocal+microscopy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy).</a> Methods. 18, 459-464 (1999).</li>
<li>Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+sections+of+70-100+mum%3A+a+novel+technique+and+its+benefits+for+studying+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system.</a> Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;obiettivo generale di questa comunicazione è stato quello di introdurre procedure immunoistochimiche al lettore. Per questo, l&#39;esempio della doppia etichettatura con Iba1 e antigeni Pan-neuronali per osservare microglia e neuroni in paraformaldeide perfusione, è stato utilizzato il saccarosio cervello crioprotetti, ratto cryosectioned. Questa tecnica può essere adattata per servire scopi infinite. Una serie di diversi antigeni in una varietà di tipi di tessuto, come, ma non limitat...

<html> L&#39;immunoistochimica è un processo per rilevare antigeni (cioè proteine) in sezioni di tessuto utilizzando anticorpi primari che si legano specificamente agli antigeni di interesse. L&#39;immunoistochimica è stato lanciato da JR Marrack nel 1934, quando decise che gli anticorpi possano localizzare gli antigeni con grande specificità 1. A partire dal 1942, tra i primi studi in vitro con anticorpi fluorescenti per visualizzare immunoistochimica sono stati pubblicati 2,3, dopo di che il primo studio in vivo istochimico è stato pubblicato 4. Durante il 1960, tre decenni dopo l&#39;inizio dei metodi di immunoistochimica, gli anticorpi enzima-coniugati cominciarono ad essere usati come reagenti secondari. Questi metodi sono stati contemporaneamente e indipendentemente sviluppate in Francia e negli Stati Uniti 5,6. Oggi, una vasta gamma di anticorpi fornisce infinite possibilità per gli studi di immunoistochimica 7. &quot;&gt; L&#39;obiettivo generale di questa corrispondenza è quello di fornire una breve introduzione in immunoistochimica, ma non vuole essere una rassegna completa ed esaustiva di questa tecnica Nel metodo descritto, tecniche di immunoistochimica per due antigeni sono presentati (marker di microglia e. neuroni) per la colorazione di paraformaldeide perfuso, saccarosio crioprotetti, cervello di ratto cryosectioned. La colorazione immunoistochimica inizia con il blocco vincolante per ridurre la colorazione di fondo aspecifica antigene. Successivamente, l&#39;incubazione con l&#39;anticorpo primario consente per il legame ad un antigene specifico nel tessuto. Dopo l&#39;anticorpo primario, un altro anticorpo, chiamato anticorpo secondario, viene applicato per collegare l&#39;anticorpo primario a un segnale di visualizzazione coniugato 8. L&#39;anticorpo secondario obiettivi delle immunoglobuline G (IgG) dominio specifico per le specie in cui l&#39;anticorpo primario è stato sollevato. L&#39;anticorpo secondario amplifica il segnale dell&#39;anticorpo primario poiché le regioni Fab di tegli anticorpi legano secondario a più siti sul dominio IgG dell&#39;anticorpo primario. O enzimi o molecole fluorescenti coniugate alle regioni c F dell&#39;anticorpo secondario consentono la visualizzazione. Per esempio, un anticorpo primario anti-Iba1 coniglio è un coniglio IgG molecola specifica per Iba1. Quando IgG anti-coniglio asino viene applicato come anticorpo secondario, sarà riconoscere e legarsi a più regioni dell&#39;anti Iba1-IgG di coniglio (vedere Figura 1). L&#39;anticorpo asino può essere visualizzata con vari metodi. Questa corrispondenza concentra sulla rilevazione di un fluoroforo coniugato con l&#39;anticorpo secondario, che riconosce l&#39;anticorpo primario, per la visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza. In immunoistochimica fluorescente, una macchia nucleare come Hoechst o DAPI può essere utilizzato per visualizzare tutti i nuclei. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> Figura 1: SchRappresentazione ematico di vs diretta tecniche di etichettatura di anticorpi indiretto. Gli anticorpi legano all&#39;antigene di interesse e può essere amplificata da anticorpi secondari sollevate contro la specie degli anticorpi primari. Questa tecnica può essere eseguita utilizzando complesso avidina-biotina (ABC) per l&#39;amplificazione e DAB per la visualizzazione (A), o di un anticorpo secondario fluorescente direttamente coniugato (B). In alternativa, gli anticorpi primari possono essere coniugati direttamente con molte etichette diverse, tra cui la biotina o un fluoroforo (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Un metodo alternativo per la visualizzazione di colorazione immunoistochimica utilizza 3,3&#39;-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB; vedi figure 1 e 2). Ciò differisce dalla fluorescenza utilizzando un biotinilato orafano perossidasi (HRP) anticorpo secondario coniugato, che fornisce un enzima per convertire DAB ad un precipitato che è visibile al microscopio in campo chiaro. Nei casi in cui un unico antigene è di interesse o colorazione è tenuto ad essere di lunga durata, DAB può essere più adatto di colorazione fluorescente. Tuttavia, DAB colorazione non è molto adatto per la differenziazione tra più marcatori, soprattutto se due antigeni nucleari sono di interesse. Per informazioni sui materiali DAB e modifiche di protocollo, consultare Tabella 1. In alternativa, nitro blu tetrazolio cloruro / 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT / BCIP) può essere utilizzato per visualizzare una fosfatasi alcalina (AP) secondario coniugato anticorpo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Immagini rappresentative della DAB sezioni di tessuto cerebrale di ratto con etichetta singola nichel-enhanced cervello Rat sareZIONI che sono contrassegnati con DAB nichel-enhanced per Iba1 (A) e Pan-neuronale (B) consentire l&#39;analisi di lunga durata della microglia o neuroni da soli. Bar Scala 20 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Si deve considerare l&#39;abbondanza stimata dell&#39;antigene di interesse all&#39;interno del tessuto che viene analizzato. I metodi indiretti (come descritto sopra) sono utili per gli obiettivi a bassa abbondanza. Quando l&#39;antigene di interesse è molto abbondante, metodi diretti possono essere applicati. Metodi diretti implicano un anticorpo primario che è direttamente coniugato ad un segnale di visualizzazione, e quindi non è richiesta anticorpo secondario. Questo metodo semplifica il processo di colorazione, ma elimina l&#39;amplificazione ottenuti con metodi indiretti. Utilizzando un anticorpo primario direttamente coniugato elimina anche cross-reattività di anticorpi secondariquando doppia etichettatura. Dettagli La presente comunicazione il protocollo per la doppia etichettatura con Iba1 e Pan-neuronali (dettagli nella tabella 1). Iba1 macchie microglia in molti stati di attivazione, tra cui ramificato, iper-ramificato, attivato, ameboidi, e l&#39;asta. Macchie Pan-neuronali neuronale assoni, dendriti, e soma. Poiché Iba1 macchie più microglia e obiettivi Pan-neuronali del neurone, questa combinazione di macchie è utile ad acquisire una vasta comprensione delle interazioni microglia-neuroni. In sintesi, immunoistochimica si basa sulla selezione accurata degli anticorpi. Poiché la domanda di ricerca diventa più specifica, anticorpi diretti contro antigeni alternativi possono desiderare. Per individuare un particolare stato di attivazione della microglia, si può scegliere di utilizzare anticorpi CD45 o CD68, piuttosto che Iba1. Inoltre, in collaborazione con i topi, F4 / 80 può fornire i risultati necessari. Allo stesso modo, gli elementi neuronali possono essere specificamente mirati con anticorpi razato contro il nucleo, sinapsi (pre o post), assone, e cono di crescita. Inoltre, ci sono altri indicatori che differenziano l&#39;età del neurone (Double-Cortin, NeuN) e rigenerazione neuronale (GAP-43).

<table><tbody><tr><td>Fisherbrand Vetrini Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td>Utilizzato per il montaggio dei tessuti (1.2.2)</td></tr><tr><td>Forno</td><td>Thermo Scientific</td> 51028112 <td>Utilizzato per l'essiccazione dei tessuti (2.1.1)</td><td></td></tr><tr><td>Mini Pap pen</td><td>Life Technologies</td><td>00-8877</td><td>Utilizzato nel passaggio 2.2.2</td></tr><tr><td>Andwin Scientific Tissue-tek Coloring Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-149-429</td><td>Utilizzato per tutti i lavaggi durante la colorazione (2.2), nonché per il passaggio Hoechst (2.2.8)&nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td>Utilizzato per asciugare i vetrini (2.2)</td></tr><tr><td>Scatola colorante nera</td><td>Ted Pella</td><td>21050</td><td>Utilizzato per le fasi di blocco e colorazione (2.2)</td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-413-253</td><td>Utilizzato per l'incubazione di blocchi e anticorpi (2.2)</td></tr><tr><td>Millipore</td> di <td>topo &alfa;-pan-neuronale</td><td>MAB2300</td><td>Utilizzato per anticorpi primari (2.2.4)</td></tr><tr><td>Coniglio &alfa;-Iba1</td><td>Wako Chemical</td><td>019-19741</td><td>Utilizzato per anticorpi primari (2.2.4)</td></tr><tr><td>Asino &alfa;-coniglio 594</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>Utilizzato per anticorpi secondari (2.2.6)</td></tr><tr><td>Asino &alfa;-topo 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-150</td><td>Utilizzato per anticorpi secondari (2.2.6)</td></tr><tr><td>Foglio da catering</td><td>Qualsiasi</td><td>N/A</td><td>Utilizzato nei passaggi 1.2.2 e 2.3.2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Utilizzato per vetrini coprioggetti (2.2.8)</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Utilizzato per vetrini coprioggetti (2.2.8)</td></tr><tr><td>Smalto trasparente&nbsp;</td><td>Qualsiasi</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per il montaggio di vetrini coprioggetti (2.2.8)</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 e LSM 710 (scansione laser, confocale)</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per l'imaging (3)</td></tr><tr><td>Axioskop A2</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per l'imaging (3)</td></tr><tr><td>CitriSolv&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td></td><td>Per il protocollo DAB</td></tr><tr><td>ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>Per il protocollo</td></tr><tr><td>DAB Kit DAB Perossidasi</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Per il protocollo DAB</td></tr><tr><td>Cavallo biotinilato &alfa;-coniglio IgG Vector</td><td>Laboratories</td><td>BA-1100</td><td>Per il protocollo DAB</td></tr><tr><td>Cavallo biotinilato &alfa;-topo IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-2001</td><td>Per il protocollo DAB</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno al 30%</td><td>FisherScientific</td><td>H325-500</td><td>Per il protocollo DAB</td></tr><tr><td>Rack per vetrini Wheaton e piastre per la colorazione</td><td>TedPella</td><td>21043</td><td>Per il protocollo DAB</td></tr><tr><td>Pompa di perfusione Masterflex e tubi</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>Utilizzato per la perfusione (1.1.1 e 1.1.2)</td></tr><tr><td>Composto CRYO-OCT per tessuti Andwin scientific (confezione da 12)</td><td>Fisher Scientifico</td><td>14-373-65</td><td>Utilizzato per il congelamento dei tessuti (1.2.1)</td></tr><tr><td>Termometro (da -50 a 50 C)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-059-228</td><td>Utilizzato per il congelamento dei tessuti (1.2.1)</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM3500S</td><td>Utilizzato per il sezionamento dei tessuti (1.2.2)</td></tr><tr><td>Piatto di colorazione, plastica con 2 coperchi Grale</td><td>Scientific</td><td>353</td><td>Per retrival antigene</td></tr><tr><td>20 posti Rack di colorazione, scivoli Horizontal</td><td>Grale Scientific</td><td>354</td><td>Per referral antigene</td></tr><tr><td>Microonde</td><td>Qualsiasi</td><td>N/A</td><td>Per retrival antigene</td></tr></tbody></table>

primer per immunoistochimica su cryosectioned rat tessuto cerebrale: esempio colorazione per microglia e neuroni

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

L&#39;immunoistochimica è una tecnica largamente usata per rilevare la presenza, la posizione e l&#39;abbondanza relativa di antigeni in situ. Questo protocollo di livello introduttivo descrive i reagenti, le attrezzature e le tecniche necessarie per completare immunoistochimica del tessuto cerebrale dei roditori, utilizzando marcatori per microglia e gli elementi neuronali come esempio. In particolare, questo documento è un protocollo step-by-step per la visualizzazione fluorescente della microglia e neuroni tramite immunoistochimica per Iba1 e Pan-neuronale, rispettivamente. Fluorescenza doppia etichettatura è particolarmente utile per la localizzazione di più proteine ​​all&#39;interno dello stesso campione, fornendo la possibilità di osservare accuratamente interazioni tra tipi cellulari, recettori, ligandi, e / o la matrice extracellulare in relazione l&#39;uno all&#39;altro così come proteina co localizzazione all&#39;interno di una singola cellula. A differenza di altre tecniche di visualizzazione, la fluorescenza immunoistochimica intensità della colorazione può diminuire inle settimane a mesi seguenti la colorazione, se non si prendono le opportune precauzioni. Nonostante questa limitazione, in molte applicazioni di fluorescenza doppia etichettatura è preferito su alternative come 3,3&#39;-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB) o fosfatasi alcalina (AP), come fluorescenza è più tempo efficiente e permette di differenziare più precisa tra due o più marcatori. La discussione include la risoluzione dei problemi e consigli per promuovere il successo.

Questo protocollo di colorazione si traduce in sezioni di tessuto di cervello di ratto che hanno microglia fluorescente nel 594 canali (rosso) e neuroni marcati nel 488 canali (verde; vedi Figura 4). Se una colorazione nucleare è stato fatto, mostrerà nel canale 405 (blu). Le immagini possono essere prese in canali diversi e sovrapposti per confronto diretto dei tre canali, o tra due canali. Molte suite software di acquisizione digitale comprendono questa funzionalità. Doppia etichettatura con Iba1 e Pa...

Questo protocollo di livello introduttivo descrive i reagenti, le attrezzature e le tecniche necessarie per completare la colorazione immunoistochimica del cervello dei roditori, utilizzando come esempio marcatori per microglia ed elementi neuronali.

Primer per immunoistochimica su Cryosectioned Rat tessuto cerebrale: Esempio colorazione per Microglia e neuroni

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare l'immunohistochimica al fine di visualizzare le proteine di interesse. In questo esempio, IBA1 per le microglia e pan-neuronale per i neuroni. Questo risultato si ottiene innanzitutto posizionando le sezioni preparate in una soluzione bloccante per prevenire il legame non specifico.Come secondo passaggio, gli anticorpi che riconoscono le due diverse proteine di interesse vengono applicati sulle sezioni e lasciati in incubazione tutta la notte. Successivamente, le sezioni vengono lavate e incubate con anticorpi secondari al fine di aggiungere marcatori fluorescenti agli anticorpi primari. I risultati della doppia marcatura possono evidenziare colorazioni delle microglia all'interno dei campi di neuroni.Generalmente, le persone nuove a questa tecnica incontreranno inizialmente delle difficoltà, poiché ci sono molti parametri da regolare. Oggi dimostrerà questa tecnica Hazel May, una studentessa universitaria del nostro laboratorio. Per iniziare, fissare e sezionare con attenzione i cervelli di roditore come descritto nel protocollo testuale allegato, quindi conservarli con cura a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo.Quando si è pronti per proseguire con il protocollo, rimuovere le vetrine dal congelatore e farle scongelare a temperatura ambiente. Una volta scongelate, posizionare le vetrine su una rastrelliera e lavarle tre volte in PBS per cinque minuti ciascuna. Da questo momento in poi, evitare che le sezioni si secchino.Asciugare i bordi dei vetrini e creare un contorno idrofobo lungo il bordo del vetrino utilizzando una penna ad albero per garantire una distribuzione uniforme del liquido e ridurre gli effetti di bordo. Successivamente, bloccare le sezioni aggiungendo 300 microlitri di siero in PBS su ciascun vetrino. Il siero deve provenire dalla stessa specie in cui è stato prodotto l'anticorpo secondario.In questo caso, è stato utilizzato siero di asino. Assicurarsi che la soluzione di blocco si estenda fino al bordo del vetrino e copra completamente il tessuto. Per evitare una colorazione irregolare, collocare i vetrini in una camera umidificata e incubare a temperatura ambiente per un'ora.Durante l'incubazione, preparare gli anticorpi primari diluendo l'anticorpo IBA1 a 1:5.000 e l'anticorpo pan-neuronale a 1:500 in una miscela contenente il 1% di siero di asino. In PBS, rimuovere la soluzione di blocco e aggiungere 300 microlitri della soluzione anticorpale, che contiene entrambi gli anticorpi di interesse. Preparare inoltre tre vetrini di controllo.Aggiungere 300 microlitri della IVA, una sola diluizione su un vetrino, 300 microlitri della diluizione dell'anticorpo pan-neuronale su un secondo vetrino e 300 microlitri di siero di asino al 1% in PBS. Su un terzo vetrino, posizionare tutti i vetrini in una camera umidificata e incubarli tutta la notte a quattro gradi Celsius; il mattino seguente, lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti ciascuno.Preparare la miscela di anticorpi secondari fluorescenti diluendo entrambi in rapporto 1:250 in soluzione di siero di asino all'1% in PBS. Aggiungere 300 microlitri della miscela su ogni vetrino e posizionare i vetrini in una camera d'umidità opaca per 60 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti ciascuna, e infine risciacquarli in acqua distillata doppia.Proteggere i vetrini dalla luce durante il lavaggio. In PBS, aggiungere qualche goccia di un mezzo di montaggio acquoso che aiuta a preservare l'intensità del segnale fluorescente su ciascun vetrino. Quindi coprire, applicare il coverslip e rimuovere eventuali bolle d'aria residue utilizzando un applicatore con estremità di cotone per sigillare il mezzo di montaggio sui vetrini e impedire che le sezioni si secchino.Applicare lo smalto per unghie sui bordi. I vetrini vengono lasciati asciugare in posizione orizzontale per un'ora in una scatola protetta dalla luce, prima di essere conservati in un contenitore opaco avvolto nella pellicola di alluminio a quattro gradi centigradi. Una volta che lo smalto per unghie è asciutto, portare i vetrini nella stanza del microscopio per l'acquisizione delle immagini.Preparare la stanza spegnendo le luci principali e oscurando tutte le altre fonti di luce esterna. Accendere il microscopio, la sorgente di luce fluorescente e il computer per l'acquisizione delle immagini. Quindi posizionare un vetrino sul portavetrino del microscopio e metterlo a fuoco.Utilizzando il software fornito, impostare l'esposizione per ciascuna lunghezza d'onda separatamente. Evitare di esporre eccessivamente il campione alla luce per lunghi periodi di tempo per prevenire il fotoblesamento del campione. Quindi acquisire le immagini in ogni canale senza spostare la sezione o regolare il fuoco.Combinare le immagini utilizzando il software di acquisizione e salvarle per successive analisi d'immagine. Utilizzando il protocollo di colorazione appena descritto, è possibile ottenere facilmente immagini fluorescenti come quelle mostrate qui: nel canale rosso, le microglia positive per IBA1 risultano chiaramente visibili, mentre nel canale verde i neuroni positivi per il marcatore pan-neuronale si distinguono rispetto al fondo. Vengono mostrate anche le immagini di controllo per entrambe queste colorazioni con anticorpi.La doppia marcatura scura con IBA1 e un marcatore pan-neuronale mostrata qui dimostra principalmente microglia ramificata con lunghe e sottili proiezioni neuronali evidenti attraverso i diversi strati corticali. Risultati di colorazione come quelli mostrati qui possono verificarsi anche se la qualità del tessuto è scarsa. Una scarsa qualità del tessuto si evidenzia per l'assenza di corpi cellulari ben definiti e per la frammentazione dei processi microgliali e neuronali.Non c'è chiarezza nella colorazione dei microglia e una completa assenza di colorazione dei neuroni, rendendo l'immagine sovrapposta priva di significato durante il tentativo di questa tecnica. È importante coprire uniformemente le sezioni e ricordare di non farle asciugare tra un passaggio e l'altro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione delle tecniche introduttive di immunohistochimica.

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Fonte: Evilsizor, M. N., et. al., Primer per l'immunoistochimica su tessuto cerebrale di ratto criosezionato: esempio di colorazione per microglia e neuroni. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra una procedura di colorazione immunoistochimica passo-passo su tessuto cerebrale di ratto criosezionato per visualizzare la disposizione spaziale di microglia e neuroni.

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