Name: Un Mouse fetale Modello Skin of Wound Repair scarless (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Scopri un modello di guarigione fetale senza cicatrici nel topo, confrontando le ferite a E16.5 e E18.5. Questo metodo chirurgico in utero aiuta a studiare le differenze molecolari nella rigenerazione cutanea.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione NIH concedere R01 GM087609 (a HPL), un regalo da Ingrid Lai e Bill Shu in onore di Anthony Shu (a HPL), NIH concedere U01 HL099776 (a MTL), il Laboratorio per Hagey Pediatrica Medicina Rigenerativa e La Fondazione Oak (a MTL e HPL). GGW è stato sostenuto dalla Stanford School of Medicine, il Programma di Formazione Stanford Medical Scientist, e borsa di formazione NIGMS GM07365. MSH è stato sostenuto da CIRM Clinical Fellow formazione di Grant TG2-01159. WXH è stato sostenuto da un finanziamento della Cardiovascular Foundation Sarnoff.

NOTA: Tutte le procedure descritte in questo documento vengono eseguite secondo le linee guida stabilite dal Pannello di Amministrazione Stanford on Laboratory Animal Care (APLAC). 1. Timed Gravidanze - Tecnica Superovulazione (Figura 1) NOTA: Proprio tempi l&#39;età gestazionale di embrioni di topo per la chirurgia fetale a E16.5 e E18.5 è di importanza fondamentale. In questa sezione abbiamo dettaglio il nostro protocollo di sincronizzazione gravidanze del mouse utilizzando mares siero incinta (PMS) e gonadotropina corionica umana (HCG) iniezioni per indurre superovulazione. <ol><li> Iniettare topi femmina (&lt;5 per gabbia) per via intraperitoneale (IP) con 3,0-5,0 unità internazionali (UI) di PMS in un volume di 100 microlitri PBS 1:00-15:00 per il giorno 1. </li><li> Tra le 12:00 e le 14:00 del giorno 3 (quarantacinque a 47 ore dopo l&#39;iniezione PMS), iniettare topi femmina IP con 3,0-5,0 UI di HCG in un volume di 100 microlitri PBS. NOTA: Le induce iniezione HCG<html> ovulazione circa 12 ore dopo l&#39;iniezione. </li><li> Subito dopo iniezioni di HCG, accoppiarsi con le femmine i maschi di età compresa tra 8-16 settimane. NOTA BENE: Noi di solito poniamo due femmine in una gabbia di singoli uomini. </li><li> Femmine separati da uomini la mattina del giorno 4 (6:00-10:00) e record come fetale E0.5 età. NOTA: tappi vaginali possono essere controllati in questo momento; Tuttavia, l&#39;osservazione di un tappo vaginale non garantisce gravidanza e femmine può diventare incinta quando non si osserva la spina. Dato che la gravidanza è in genere osservabile mediante ispezione visiva e / o la palpazione in età gestazionale E16.5 e E18.5, controllando tappi vaginali la mattina del giorno 4 non è strettamente necessario. Nella nostra esperienza, e seconda del ceppo, circa il 30-50% delle femmine super ovulato diventa incinta utilizzando la tecnica qui descritta. </li></ol>pg &quot;/&gt; Figura 1. Schema di Tecnica Superovulazione. Procedura mostra Schema superovulazione cronometrato gravidanze nei topi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52297/52297fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2. murino fetale Surgery (Dorsale Ferimento) su E16.5 e E18.5 embrioni (Figura 2) <ol><li> Prima della procedura, pulire tutte le superfici della sala operatoria e attrezzature con il 70% di alcol isopropilico. Inoltre, sterilizzare tutte le forniture chirurgiche e gli strumenti che saranno utilizzati nella procedura da essi autoclave. Alcuni istituti possono consentire il successivo utilizzo di caldo tallone sterilizzazione. Per il funzionamento, utilizzare confezioni sterili che includono la garza e strumenti chirurgici. </li><li> Indurre l&#39;anestesia in donne in gravidanza (fetale E16.5 età o E18.5) inferiore al 2,5% della miscela isoflurano / ossigeno a 2 L al min seguita da anestesia di mantenimento a 1 L per min. </li><li> Per conimpresa adeguata anestesia, assicurano i riflessi pedale profondi del mouse vengono soppressi e posizionare il mouse in posizione prona. </li><li> Applicare una pomata oftalmica veterinario come Puralube prevenire l&#39;irritazione degli occhi o secchezza durante la procedura. </li><li> Preparare addome somministrando una leggera applicazione di crema depilatoria per non più di 30 secondi (Figura 2A). </li><li> Preparare addome per la chirurgia asettica con povidone-iodio e di alcol (figura 2B e 2C). </li><li> Eseguire linea mediana laparotomia sotto il microscopio con le forbici microchirurgia (Figura 2D e 2E). </li><li> Esporre delicatamente utero e feto selezionato per la chirurgia (Figura 2F). </li><li> Irrigare campo chirurgico con il caldo (38 ° C) PBS (PBS) con un ago smussato punta NOTA: Si può essere fatto piegando con cautela la punta di un ago di grosso calibro. (Figura 2G e 2H). </li><li> Posizionare il feto in modo da consentires pieno accesso a dorso. </li><li> Passare un punto stringa di borsa utilizzando 7-0 nylon sutura attraverso l&#39;utero che insiste sul sito di ferimento dorsale previsto (Figura 2I). Posizione stringa di borsa su una regione del dorso a sinistra oa destra del midollo spinale, e in una regione di parete uterina privo di grandi vasi sanguigni. </li><li> Eseguire un&#39;incisione 3 millimetri attraverso la parete uterina e sacco amniotico nel centro della stringa borsa (Figura 2J). </li><li> Irrigare sito di incisione con acqua calda (38 ° C) PBS. </li><li> Utilizzando forbici microchirurgiche, tagliare una sola ferita excisional tutto spessore, di circa 1 mm di lunghezza, nel dorso del feto. </li><li> Delicatamente sito di incisione asciugare con cotone applicatore. </li><li> Iniettare 3 ml di volume India sottocutanea inchiostro nel sito della ferita per contrassegnare posizione di ferita (Figura 2K). </li><li> Irrigare con acqua calda (38 ° C) PBS per assicurare l&#39;inchiostro è stato mantenuto all&#39;interno del sito della ferita. </li><li> Avere chirurgica assistant inject caldo (38 ° C) PBS attraverso blunt punta siringa da 10 G nel sacco amniotico, come la stringa di borsa è chiusa (Figura 2L). Ritrarre siringa come chiusura stringa di borsa si avvicina al completamento (Figura 2M). </li><li> Ritorno delicatamente dell&#39;utero nella cavità addominale (Figura 2N). </li><li> Evert pelle e del peritoneo. </li><li> Hanno assistente chirurgica irrigare cavità addominale con acqua calda (38 ° C) PBS. </li><li> Chiudi addome rapidamente pinzatura pelle e del peritoneo chiuso (Figura 2O). La chiusura standard viene eseguita in due strati; peritoneo e muscoli addominali in uno strato, tessuto sottocutaneo e la pelle nel secondo strato. Per sacrificio immediato e la raccolta del feto, la nostra manifestazione dimostra la chiusura in un solo strato. </li><li> Posto l&#39;animale sotto osservazione in un incubatore calda a 37 ° C per 30 minuti o fino a quando l&#39;animale riprende conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. </li><li> Non returna l&#39;animale per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato dalla procedura. </li><li> Al risveglio dall&#39;anestesia e durante il successivo 48 hr, amministrare l&#39;iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,05 mg / kg) ogni 12 ore di analgesia come necessario sulla base della valutazione del dolore. Somministrare carprofen (5 mg / kg) per via sottocutanea per il sollievo del dolore post-operatorio supplementare se necessario. </li><li> Animali Ritorno alla gabbia e di fornire loro cibo e acqua ad libitum. </li><li> Monitorare attentamente per manifestazioni di dolore. </li><li> Post-operatorio 48 ore, sacrificio madre incinta con una dose eccessiva di isoflurano e del raccolto feriti feto. Per fare questo, regolare la concentrazione isoflurano al 5% o superiore e mantenere l&#39;esposizione per 1 min dopo la cessazione della respirazione. Confermare l&#39;eutanasia con dislocazione cervicale. Raccolto un embrione illeso per il controllo di pari età. Embrioni tardivi dovrebbero avere un sistema diverso di eutanasia in linea con le raccomandazioni IACUC, come decaptazione, dislocazione cervicale, o iniezione chimica. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52297/52297fig2highres.jpg" /> Figura 2. Schema di Murine fetale Surgery. Passi generali per la dorsale ferendo in E16.5 e E18.5 embrioni di topo. (A) Depilazione di topo dell&#39;addome. (B e C) Preparazione di topo dell&#39;addome. (D) microscopio utilizzato per chirurgica procedura. (E) Midline laparotomia. (F) L&#39;esposizione dell&#39;utero. (G) Creazione di blunt-punta dell&#39;ago. (H) Irrigazione dell&#39;utero con soluzione salina calda. (I) Creazione di stringa di borsa sutura. (J) incisione attraverso uterina muro e 1 mm completa generazione ferita excisional spessore. (K) L&#39;iniezione sottocutanea di inchiostro di china. (L e M) Chiusura della stringa di borsa sutura. (N e O)Chiusura dell&#39;addome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52297/52297fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo chirurgico presentato qui descrive un modello escissionale fetale guarigione scarless murino pubblicato nel 2006 dal nostro laboratorio 10. Oltre agli altri modelli consolidati di ferimento excisional 11, esistono modelli incisionali di fetale murino scarless guarigione così 12,13. Indagini di fetale guarigione scarless nella scimmia, agnello, coniglio, opossum, e ratti sono stati segnalati 14-17. Tuttavia, i topi rappresentano un modello ideale per esplorare fet...

Ferite cutanee fetali guariscono rapidamente e scarlessly fino a tardi in gestazione 1. Fetal riparazione della ferita scarless è caratterizzata dalla rigenerazione di architettura tessuto normale e la funzione. Il passaggio da un scarless a cicatrici fenotipo avviene nel terzo trimestre di gravidanza negli esseri umani e in tutto il giorno embrionale 18 (E18) in topi 2,3. In confronto ad adulto, riparazione della ferita fetale è caratterizzata da una rapida riepitelizzazione, la deposizione di tessuto connettivo, e la migrazione dei fibroblasti. Molti studi hanno offerto possibili spiegazioni per il fenomeno di scarless guarigione delle ferite durante le prime fasi dello sviluppo fetale. L&#39;infiammazione è una componente fondamentale di riparazione adulti ferita; Tuttavia, ferite fetali sono caratterizzati da una mancanza di infiammazione acuta 4. Se questa è una conseguenza della immaturità funzionale del sistema immunitario durante fasi fetale rimane chiaro. Uno studio recente ha suggerito che le differenze di abbondanza, tappetourity, e la funzione dei mastociti in E15 vs. E18 cute fetale possono essere responsabili per il passaggio da un fenotipo scarless, almeno nel topo 3. Altri studi ipotizzano che le differenze nelle proprietà e abbondanza di macrofagi ferite fetali e adulti sono responsabili per la riforma della matrice extracellulare normale (ECM) durante ferita fetale riparazione 5. Le differenze nei fattori ambientali durante lo sviluppo fetale e adulti possono anche interessare la riparazione delle ferite. Longaker e colleghi hanno dimostrato che il fluido ferita dal feto possiede alti livelli di attività acido ialuronico stimolante rispetto a nessuno in adulti ferita fluido 6. Di conseguenza, i livelli elevati di acido ialuronico, un glicosaminoglicano che promuove un microambiente favorevole alla motilità e proliferazione cellulare, nell&#39;ambiente della ferita fetale possono essere responsabili del fenotipo scarless visto durante precoce sviluppo fetale. Altre linee di punto prova al fatto che la fetaambiente l ferita è relativamente ipossiemico e sommersa in sterile liquido amniotico ricco di fattori di crescita 7. Tuttavia, nessuna risposta definitiva è stata fornita per un evento critico o fattore durante l&#39;embriogenesi che innesca la transizione dalla rigenerazione scarless a riparazione fibrotica. La comprensione dei meccanismi responsabili per la guarigione scarless nel feto richiede un modello preciso e riproducibile. Qui i dettagli di un modello riproducibile di fetale scarless guarigione delle ferite nel dorso di E16.5 (scarless) ed embrioni E18.5 (cicatrici) del mouse. Inoltre, variazioni minori di questo modello può essere utilizzato per eseguire una serie di ulteriori studi, come l&#39;analisi di espressione genica di ferite fetali e 8,9 pelle. Dato che le gravidanze a tempo proprio sono fondamentali per il successo della ricapitolazione questo scarless ferita modello guarigione fetale, abbiamo anche dettagliato il nostro protocollo superovulazione cronometrato gravidanze.

<table><tbody><tr><td>7-O MONOSOF Suture</td><td>eSuture</td><td>SN-1647G</td><td></td></tr><tr><td>Pinze chirurgiche</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650916</td><td></td></tr><tr><td>Micro-forbici</td><td>Kent Scientific INS600127</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclip 9 mm</td><td>Texas Scientific Instruments</td><td>205060</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-272-382</td><td></td></tr><tr><td>Nero Siringa da</td> 3 ml <td>Pigment AIMS</td><td>242</td><td></td></tr><tr><td>BD Safety-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>309596</td><td></td></tr> soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>OPMI-MD Microscopio operatorio</td><td>Carl Zeiss Surgical Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavalle gravide (PMS)</td><td>Millipore</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina corionica umana (HCG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG10</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di preparazione allo iodio povidone</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Nair (crema depilatoria)</td><td>Church and Dwight Co.</td><td></td><td></td>22600267058</tr></tbody></table>

un mouse fetale modello skin of wound repair scarless

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

All'inizio dell'utero, ma non nella vita postnatale, le ferite cutanee subiscono una rigenerazione e guariscono senza la formazione di una cicatrice. La guarigione delle ferite fetali senza cicatrici avviene in tutte le specie, ma dipende dall'età. La transizione da un fenotipo senza cicatrici a cicatriziale avviene nel terzo trimestre di gravidanza nell'uomo e intorno al giorno 18 embrionale (E18) nei topi. Tuttavia, questo varia con le dimensioni della ferita con difetti più grandi che generano una cicatrice in un'età gestazionale più precoce. L'emergere del tracciamento del lignaggio e di altri strumenti genetici nel topo ha aperto nuove strade promettenti per lo studio della guarigione delle ferite fetali senza cicatrici. Tuttavia, dati i tassi intrinsecamente elevati di morbilità e contrazione uterina prematura associati alla chirurgia fetale, le indagini sulla guarigione delle ferite fetali senza cicatrici in vivo richiedono un modello chirurgico preciso e riproducibile. Qui descriviamo in dettaglio un modello affidabile di guarigione fetale delle ferite senza cicatrici nel dorso di embrioni di topo E16.5 (senza cicatrici) e E18.5 (cicatriziali).

Per l&#39;analisi istologica, ferite cutanee della pelle dorsale E16.5 e E18.5 embrioni di topo dovrebbero essere raccolti 48 ore dopo il ferimento, fissati in 4% PFA, e inclusi in paraffina. Nei modelli transgenici fluorescenti, la crioconservazione di ottobre può essere appropriato. Ci sono diverse macchie che possono essere utilizzati per visualizzare architettura tessuto cellulare e connettivo. Ematossilina e eosina è una macchia a due colori che macchia nuclei blu e strutture eosinofili (es., Citoplasma e ...

Durante lo sviluppo dei mammiferi, le ferite cutanee gestazionali precoci guariscono senza cicatrici. Qui descriviamo in dettaglio un modello affidabile e riproducibile di guarigione fetale delle ferite senza cicatrici nel dorso cutaneo di embrioni di topo E16.5 (senza cicatrici) e E18.5 (cicatriziali).

Un Mouse fetale Modello Skin of Wound Repair scarless

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è modellare in modo riproducibile la guarigione cutanea senza cicatrici nel feto di topo. Questo risultato si ottiene innanzitutto determinando con precisione l'età gestazionale degli embrioni per l'intervento chirurgico fetale mediante la tecnica di superovulazione. Successivamente, viene eseguita una chirurgia fetale in utero per creare una ferita cutanea fetale in precisi momenti temporali.I risultati mostrano che le ferite fetali generate all'età gestazionale E 16,5 rigenerano, mentre quelle all'età E 18,5 subiscono una riparazione con formazione di cicatrice fibrotica, come evidenziato dalla colorazione istologica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della guarigione delle ferite senza cicatrice, ad esempio identificando le differenze molecolari presenti nelle ferite fetali precoci che guariscono senza formazione di cicatrice. È fondamentale, infatti, determinare con precisione l'età gestazionale degli embrioni di topo per interventi chirurgici fetali agli stadi E 16,5 ed E 18,5.In questa sezione, descriviamo il nostro protocollo per determinare i tempi della gravidanza nei topi mediante inie

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In questo rapporto, descriviamo tridimensionale pelle ricostruire modello che imita la pelle umana in architettura e composizione. Fisiologia melanociti, la progressione del melanoma e il destino delle cellule staminali cutanee sono state studiate utilizzando il modello di ricostruire la pelle. Il modello è anche utile come strumento di pre-clinici per la valutazione dei farmaci.

Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello: uno strumento per studiare la pelle normale e progressione Melanoma

Un modello murino di guarigione della ferita cutanea che può essere utilizzato per valutare composti terapeutici in contesti fisiologici e fisiopatologici.

Modello murino di guarigione delle ferite

Vascolarizzazione è la chiave per approcci in ingegneria dei tessuti successo. Pertanto, tecnologie affidabili sono necessari per valutare lo sviluppo di reti vascolari in tessuto-costrutti. Qui vi presentiamo un metodo semplice e conveniente per visualizzare e quantificare vascolarizzazione in vivo.

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali<em&gt; In Vivo</em

Qui, presentiamo un protocollo per un saggio in vitro graffio utilizzando fibroblasti primari e per un saggio di guarigione della ferita della pelle in vivo nei topi. Entrambi i test sono metodi semplici per valutare la guarigione delle ferite in vitro e in vivo.

Scratch Migration Ssay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro e In Vivo Analisi della Guarigione delle Ferite

Qui vengono descritti due modelli di guarigione delle ferite murine, uno progettato per valutare le risposte di guarigione della ferita cellulare e citochina e l'altro per quantificare il tasso di chiusura della ferita. Questi metodi possono essere utilizzati con modelli di malattia complessi come il diabete per determinare i meccanismi di vari aspetti della scarsa guarigione delle ferite.

Valutazione della guarigione acuta delle ferite utilizzando l'impianto di spugna alcolica sottocutaneo dorsale e modelli di ferite cutanee della coda excisionali.

Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un modello murino di guarigione delle ferite da ustione. Un'ustione termica è stata indotta sulla pelle dorsale dei topi utilizzando un modello di ottone preriscaldato. Il tessuto bruciato è stato disretto e sovrapposto con un innesto cutaneo raccolto dalla coda di un topo donatore geneticamente simile.

Un modello Murine di una ferita da ustione ricostruita con un innesto di pelle allogenica

Questo protocollo descrive la generazione di un espianto della fascia cutanea chiamato "SCar like tissue in A Dish" o SCAD. Questo modello consente una visualizzazione senza precedenti di singoli fibroblasti durante la formazione di cicatrici.

Visualizzazione dello sviluppo delle cicatrici utilizzando il test SCAD - Un test di cicatrici cutanee ex-situ

Questo studio presenta due tecniche sperimentali cruciali: la costruzione di un modello di ferita murina per valutare la chiusura della ferita e la preparazione di sospensioni unicellulari dalla pelle murina per preservare la vitalità cellulare.

Modelli di ferita nel topo e preparazione di sospensioni a cellula singola

Questo protocollo spiegherà come stabilire un modello murino di cicatrici ipertrofiche che aumenta la segnalazione di meccanotrasduzione per simulare cicatrici simili a quelle umane. Questo metodo prevede l'aumento della tensione meccanica attraverso un'incisione di guarigione in un topo e l'utilizzo di un dispositivo specializzato per creare un tessuto cicatriziale riproducibile ed eccessivo per analisi istologiche e bioinformatiche dettagliate.

Un modello murino di cicatrici ipertrofiche simili a quelle umane guidate dalla meccanotrasduzione

Le ferite rappresentano una sfida sanitaria globale. Questo studio ha sviluppato una cabina fotografica standardizzata utilizzando la planimetria digitale per ridurre al minimo la variabilità della misurazione della ferita. Il monitoraggio delle ferite nei topi per 14 giorni ha rivelato un aumento iniziale dell'area e del perimetro della ferita, seguito da una chiusura graduale. Questa metodologia può aiutare a valutare la cinetica di chiusura della ferita in modelli preclinici.

Planimetria digitale per la valutazione della cinetica di chiusura della ferita in un modello murino

Scopri un modello di guarigione fetale senza cicatrici nel topo, confrontando le ferite a E16.5 e E18.5. Questo metodo chirurgico in utero aiuta a studiare le differenze molecolari nella rigenerazione cutanea.

Un Mouse fetale Modello Skin of Wound Repair scarless

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