Metodo di isolato Ex Vivo Lung Perfusion in un modello di ratto: Lezioni apprese da Sviluppo di un programma EVLP Rat
25 febbraio 2015
Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) ha permesso il trapianto di polmone nell'uomo a diventare più facilmente disponibili, consentendo la possibilità di valutare gli organi ed espandere il pool di donatori. Qui, descriviamo lo sviluppo di un programma di topo EVLP e filtri che consentono un modello riproducibile per espansioni future.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un modello coerente di perfusione polmonare ex vivo di ratto che produrrà risultati riproducibili. Il primo passo è incannulare la trachea e iniziare la ventilazione meccanica. Successivamente, l'arteria polmonare e l'atrio sinistro vengono incannulati.
Il passaggio finale consiste nel rimuovere il blocco cuore-polmone dalla cavità toracica e inserirlo nel circuito di perfusione polmonare ex vivo. Infine, i sensori di pressione, i trasduttori di peso e un analizzatore di gas ematici vengono utilizzati per mostrare le condizioni del polmone in tempo reale misurando la pressione arteriosa polmonare e altri parametri. La profusione polmonare ex vivo è una tecnologia straordinaria che ci ha permesso di ampliare il pool di donatori per il trapianto di polmone.
Prevediamo che attraverso questa tecnologia che fungerà da piattaforma per la valutazione degli organi, potremo migliorare la qualità degli organi sottoposti al trapianto e i risultati complessivi del trapianto. Qui al laboratorio del rame, abbiamo coniato l'espressione armare l'organo, quindi valutare, rimodellare o riparare, e quindi modificare l'organo per migliorare la qualità e quindi migliorare i risultati del trapianto. Abbiamo sviluppato un modello robusto e riproducibile di perfusione polmonare ex vivo su piccoli animali di ratto.
Attraverso questo video, dimostreremo i passaggi chiave e critici per lo sviluppo di questo modello di perfusione polmonare ex vivo, che può quindi fungere da piattaforma per la ricerca sulla perfusione e sui trapianti. Inizia configurando il circuito EVLP e facendo circolare otto perfuse calde in tutto il sistema. Imposta il bagno di acqua calda, lo scambiatore di calore e il torace artificiale a 37 gradi Celsius.
Far passare un gas di ossigenazione deossigenata attraverso l'otto PERFUSE nel filtro del gas per assicurarsi che contenga circa il 6% di ossigeno disciolto per l'esperimento. Dopo aver aperto il programma di acquisizione dati, collegare il trasduttore di pressione dell'arteria polmonare, la tracheale, il trasduttore di pressione differenziale, il flusso respiratorio, il trasduttore di pressione differenziale, il trasduttore di peso polmonare e il trasduttore di velocità della pompa alla scatola del convertitore analogico-digitale. Infine, allestisci il tavolo operatorio e prepara tutti gli strumenti operativi e le forniture necessarie per la procedura.
Dopo aver verificato la sedazione con la punta del piede, pizzicare, posizionare l'animale anestetizzato in posizione supina sul tavolo operatorio. Iniziare a registrare i dati utilizzando il programma di acquisizione dati. Quando è pronto, entrare nella cavità addominale e iniettare eparina nella vena cava inferiore.
Seguendo le procedure standard, incannulare la trachea e collegare la cannula a un circuito di ventilazione. Accendere il ventilatore meccanico per iniziare a ventilare meccanicamente i polmoni. Successivamente, ritrarre la cavità toracica per esporre i polmoni facendo attenzione a non toccarli.
Rimuovere il timo e spostare il contenuto addominale da un lato per esporre la vena cava inferiore o la vena mesenterica. Dopo l'eutanasia, posizionare una sutura di seta dietro l'arteria polmonare e l'aorta. In preparazione per il fissaggio della cannula dell'arteria polmonare, praticare un'incisione di due o tre millimetri sulla superficie anteriore del tratto di efflusso ventricolare destro e inserire la cannula nell'arteria polmonare principale.
Fissare con sutura di seta, rimuovere i coaguli dal sistema vascolare polmonare perfondendo circa 15 millilitri di una soluzione elettrolitica positiva a basso contenuto di potassio attraverso l'arteria polmonare e fuori attraverso l'apice del cuore. Successivamente posizionare una sutura di seta dietro il cuore e intorno ai ventricoli. Per dilatare la valvola mitrale e facilitare l'incannulamento, inserire un piccolo paio di pinze chirurgiche nell'apice attraverso la valvola mitrale e nell'atrio sinistro.
Quando è pronto, inserire una cannula nell'apice attraverso la valvola mitrale e nell'atrio sinistro. Fissare la cannula dell'atrio sinistro con la sutura di seta. Quindi, collegare la cannula dell'arteria polmonare al circuito EVLP.
Assicurarsi che la linea di afflusso proveniente dal circuito sia adescata con perfuse eight. Per evitare che l'aria entri nel cuore e nei polmoni, accendere la pompa peristaltica principale e impostarla su una velocità bassa. Ciò consentirà al perfuse otto di scorrere attraverso l'arteria polmonare e fuori dal ventricolo sinistro nella cavità toracica.
Monitorare la pressione dell'arteria polmonare per assicurarsi che non si verifichi un picco, indicando un blocco o una scarsa incannulamento. Quando è pronta, spegnere la pompa peristaltica. Collegare la cannula dell'arteria polmonare al circuito di perfusione polmonare ex vivo.
Non collegare la cannula dell'atrio sinistro al circuito fino a quando il blocco cuore-polmone non è stato rimosso dal corpo. Rimuovere il blocco cuore-polmone bloccando l'esofago con un emostatico e tagliando sotto il morsetto in modo che l'esofago possa essere utilizzato per sollevare le strutture cardiopolmonari in modo smussato, sezionare il tessuto circostante e tagliare l'aorta discendente e i vasi ausiliari per liberare il blocco cuore-polmone mentre lo solleva attraverso l'esofago. Sezionare la trachea per liberare il blocco cuore-polmone e posizionarlo nella posizione designata sul circuito EVLP.
Quindi collegare la cannula dell'atrio sinistro alla linea di deflusso e avviare la pompa peristaltica. Per registrare i dati di ventilazione e monitorare rapidamente la pressione, rimuovere rapidamente la linea di ventilazione dalla parte superiore dell'apparecchio EVLP e collegare l'alloggiamento con i sensori di pressione. Quindi, reinserire la linea di ventilazione sopra l'apparecchio EVLP.
Assicurarsi che la trappola a bolle d'aria sia adeguatamente riempita con perfuse eight. Per evitare l'introduzione di bolle d'aria nei polmoni durante i primi 15 minuti, modificare lentamente le impostazioni di ventilazione e perfusione ai livelli sperimentali desiderati. Aumentare la portata di perfusione alla velocità e alla pressione desiderate anche durante questa fase iniziale di rampa di salita.
Si consiglia di programmare il ventilatore in modo da produrre respiri laterali intermittenti per facilitare il movimento del fluido fuori dallo spazio polmonare e ritardare l'insorgenza dell'edema. Definisci il tempo zero come il tempo in cui i parametri di ventilazione sono a un volume corrente di quattro millilitri per chilogrammo positivo. Terminare la pressione espiratoria a due centimetri.
I parametri di H2O e perfusione sono ai livelli previsti e rimangono costanti. Se lo si desidera, prelevare otto campioni di Perfuse dalla porta del campione, congelare in azoto liquido e annotare l'ora in cui sono stati prelevati i campioni. Al termine dell'esperimento, isolare tutti i pezzi anatomici necessari per la raccolta e congelarli in azoto liquido o metterli in soluzione di fissaggio per ulteriori studi.
Il peso polmonare dei ratti maschi Sprague dolly non è cambiato significativamente durante i 60 minuti di perfusione polmonare ex vivo dopo i primi 10 minuti. Inoltre, non c'è stato alcun cambiamento nella pressione arteriosa polmonare. Allo stesso modo, la resistenza vascolare polmonare non è stata alterata per tutta la durata dello studio.
Dopo un'ora di ventilazione ad alti volumi correnti e ad alti livelli di peep, le concentrazioni di citochine pro-infiammatorie sono aumentate nello studio PERFUSE 8, mentre le concentrazioni di citochine antinfiammatorie sono rimaste invariate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione dei passaggi chiave necessari per stabilire un modello di profusione polmonare ex Viva per piccoli animali nei ratti nel tuo laboratorio.
Panoramica
Questo articolo descrive l'istituzione di un modello di perfusione polmonare ex vivo (EVLP) nel ratto, finalizzato al miglioramento degli esiti del trapianto polmonare. Il modello consente una valutazione in tempo reale delle condizioni polmonari, ampliando così il pool di donatori.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia del trapianto
- Perfusione polmonare ex vivo
- Conservazione d'organo
Sfondo
- La tecnologia di perfusione polmonare ex vivo consente una migliore valutazione dei polmoni donatori.
- Ha il potenziale di migliorare gli esiti del trapianto attraverso la valutazione della qualità dell'organo.
- Lo sviluppo di un modello animale riproducibile è fondamentale per il progresso della ricerca.
- Il laboratorio Copper ha come obiettivo perfezionare le tecniche di valutazione degli organi.
Scopo dello studio
- Creare un modello ratto standardizzato per la perfusione polmonare ex vivo.
- Facilitare la ricerca nel trapianto polmonare e nel miglioramento della qualità dell'organo.
- Illustrare i passaggi fondamentali per l'allestimento del modello EVLP.
Metodi Utilizzati
- Canulazione della trachea, dell'arteria polmonare e dell'atrio sinistro.
- Utilizzo di sensori di pressione e acquisizione dati per il monitoraggio in tempo reale.
- Configurazione della perfusione a caldo e mantenimento delle condizioni fisiologiche.
- Esecuzione passo dopo passo delle procedure chirurgiche per l'estrazione del polmone.
Risultati principali
- Stabilimento con successo di un modello di EVLP su ratto con risultati riproducibili.
- Monitoraggio in tempo reale delle condizioni polmonari durante la perfusione.
- Dimostrazione di tecniche per migliorare la qualità dell'organo ai fini del trapianto.
- Potenziale miglioramento degli esiti nel trapianto polmonare grazie a questo modello.
Conclusioni
- Il modello EVLP del ratto è uno strumento prezioso per la ricerca nel trapianto polmonare.
- Miglioramenti nel modello possono portare a una migliore valutazione e conservazione degli organi donatori.
- Questo studio contribuisce agli sforzi in corso per migliorare i tassi di successo del trapianto.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La creazione di un modello riproducibile di perfusione polmonare ex vivo (EVLP) nel ratto fornisce una piattaforma preclinica per valutare strategie di conservazione del polmone e analizzare la qualità dell'organo prima del trapianto. Questo modello consente una riduzione meccanicistica dei rischi associati a interventi terapeutici mirati al danno polmonare indotto dalla ventilazione e ad altre patologie rilevanti per l'ottimizzazione del polmone donatore. Permettendo il monitoraggio in tempo reale dei parametri polmonari, il sistema aumenta la sicurezza predittiva nei flussi di lavoro della fase iniziale dedicati alla biologia del trapianto e alla riparazione d'organo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative ai meccanismi di danno e riparazione polmonare in condizioni di perfusione controllate.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale di bersagli permettendo la valutazione dei percorsi molecolari in un sistema d'organo integro.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce un sistema rilevante per la patologia per preparare sistemi biologici validati per testare composti volti a migliorare la qualità del polmone.
- Valore operativo: Facilita la standardizzazione dei saggi mediante la misurazione in tempo reale della pressione arteriosa polmonare, del peso del polmone e dei parametri dei gas nel sangue.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella il danno polmonare indotto dalla ventilazione (VILI) per valutare le risposte fisiopatologiche e testare potenziali strategie di attenuazione.
- Valore operativo: Garantisce la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, mantenendo le condizioni fisiologiche durante la perfusione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello EVLP del ratto si integra nel percorso della scoperta supportando la verifica delle ipotesi nella biologia iniziale, consentendo la preparazione dei saggi per lo screening dei composti e fornendo output quantitativi per decisioni di avanzamento preclinico di tipo go/no-go.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico chiarificando il coinvolgimento delle vie nei processi di danno e riparazione polmonare.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili, come la pressione polmonare e il peso del polmone, per confrontare le condizioni sperimentali.
- Analisi: Permette l'acquisizione in tempo reale dei dati mediante sensori di pressione, trasduttori di peso e analisi dei gas del sangue per valutare la funzione polmonare.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso la modellizzazione del danno polmonare indotto dalla ventilazione (VILI), una patologia clinicamente rilevante nel trapianto polmonare.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per test iterativi di soluzioni di conservazione, strategie ventilatorie e agenti farmacologici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità della risposta polmonare agli interventi.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione attraverso protocolli definiti di cannulazione, perfusione e monitoraggio.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale corretto rispetto al rischio nella ricerca sulla conservazione degli organi, riducendo i fallimenti in fase avanzata dello sviluppo dei trapianti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei candidati in base agli esiti funzionali polmonari piuttosto che a marcatori surrogati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella cannullazione microvascolare e nell'anatomia cardiorespiratoria nei modelli rodentici.
- È dipendente da strumentazioni quali pompe peristaltiche, trasduttori di pressione, sensori di peso e analizzatori di gas nel sangue.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i parametri di perfusione, le impostazioni del ventilatore e i protocolli di acquisizione dati.
- Comporta considerazioni di adattamento nel passaggio da modelli ratini a modelli mammiferi più grandi o alla valutazione del polmone umano.
- Comprende limitazioni pratiche, come la complessità tecnica dell'estrazione del blocco cuore-polmone e il mantenimento della sterilità durante la perfusione.
