Cosa fare e cosa non fare di Cryo-microscopia elettronica: A Primer su preparazione del campione e raccolta dati di alta qualità per la ricostruzione macromolecolare 3D

L'obiettivo del seguente esperimento è quello di essere in grado di visualizzare le macromolecole nel loro stato congelato idrato con il microscopio elettronico a trasmissione. Ciò si ottiene immergendo la griglia con il campione sul criogeno per ottenere un campione vetrificato sottile. In una seconda fase, il campione viene esposto al fascio di elettroni, che formerà un'immagine di proiezione delle macromolecole.

Successivamente, le immagini vengono elaborate al computer al fine di ottenere la ricostruzione 3D della macro molecola. I risultati mostrano una struttura 3D altamente dettagliata della macromolecola, la sua conferma e la posizione 3D dei suoi partner molecolari. C'è un vantaggio principale di questa tecnica, rispetto ad altri metodi di preparazione del campione per l'elettromicroscopia.

Nella criogenia, l'immagine è formata direttamente dagli elettroni all'interno della macromolecola. Questo riflette più fedelmente la sua struttura quasi nativa. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.

La preparazione della griglia criogenica e il trasferimento al microscopio elettronico sono difficili da apprendere a causa della complicazione aggiuntiva quando si lavora a temperature criogeniche, il ciclo di riscaldamento viene utilizzato all'inizio della sequenza di pompaggio e dopo una sessione di crioterapia. Per iniziare questa procedura, inserire il supporto criogenico in una delle porte di pompaggio della stazione di pompaggio. Avvia l'opzione del ciclo di riscaldamento.

Nel controller di stadio freddo, aprire la valvola a farfalla V due, e quando il vuoto nella stazione di pompaggio turbo si stabilizza e legge 10 al giro meno tre, o meglio aprire la valvola a farfalla V uno. Una volta che la temperatura nel supporto è stabile al di sopra della temperatura ambiente e il ciclo di riscaldamento è completo. Abbassa V uno e interrompe il ciclo.

Quindi, avvia l'opzione del ciclo di luce ze e seleziona il tempo necessario per raggiungere un buon vuoto nell'intervallo da uno a due volte 10 a meno quattro tor. Quando il vuoto raggiunge 10 a meno tre per intervallo, aprire la valvola di evacuazione DU B tre e la valvola sul supporto criogenico. Al termine del ciclo, sollevare le valvole nell'ordine opposto a quello in cui sono state aperte.

Usando un paio di pinzette, lascia un pezzo di MICA per esporre due nuove superfici. Posiziona le nuove superfici di mica esposte a faccia in su su un foglio di carta bianco in una capsula di Petri. Dopo aver posizionato la capsula di Petri nel barattolo di un evaporatore a carbone, eseguire la sequenza di pompaggio fino a quando il vuoto non è inferiore a 10 a meno sei per rivestire la mica con un sottile strato di carbonio.

Quindi trasferire il carbone sottile sulla griglia. Che un pezzo di 0,5 per un centimetro di mica rivestita e far galleggiare il carbonio sulla superficie piana di acqua deionizzata filtrata. Usando le pinzette, metti il lato sacro in carbonio della griglia a contatto con la superficie superiore dello strato di carbonio galleggiante e raccoglilo.

Posiziona la griglia con il lato in carbonio rivolto verso l'alto su un vetrino di 7,5 x 2,5 centimetri ricoperto da una pellicola di potenza. Quindi posizionare il vetrino nella camera dell'apparecchiatura di scarica del bagliore e chiudere la camera. Pompa la campana di vetro e illumina.

Scarica per 20 secondi a 25 milliampere e sette volte 10 fino a meno due millibar. A questo punto, accendere l'apparecchio di congelamento a immersione. Tirare verso il basso il contenitore Ethan riempiendo il serbatoio con azoto liquido.

Una volta che l'azoto liquido smette di bollire, posizionare la punta del tubo proveniente dal serbatoio Ethan nella camera interna e aprire la valvola molto lentamente. Liquefare l'etano nella camera interna e riempirla a un millimetro dall'alto. Accendi l'umidità.

Quindi, carica una griglia su una pinzetta e carica da tre a cinque microlitri di campione sulla superficie in carbonio della griglia sacra. Dopo aver atteso che il campione venga assorbito dalla griglia, eseguire il blotting Per ottenere un sottile strato di rossore liquido, congelare la griglia immergendola nell'etano liquido. Rimuovere con cautela il gruppo della griglia della pinzetta dall'etano liquido e trasferirlo nella camera esterna contenente azoto liquido.

Quindi trasferire la griglia in una piccola scatola a griglia immersa nell'azoto liquido. A questo punto, inserire il supporto criogenico nella stazione di lavoro di trasferimento criogenico. Riempire l'esecutore del supporto criogenico e il recipiente della postazione di lavoro con azoto liquido.

Trasferire rapidamente la scatola della griglia criogenica contenente la griglia idratata congelata all'azoto liquido nella postazione di lavoro. Dopo aver aperto la scatola della griglia criogenica, prendere la griglia idratata congelata e posizionarla nella fessura del supporto del campione. Quindi, posiziona l'anello a clip sopra la griglia e premilo delicatamente con l'estremità smussata dello strumento per anelli a clip e finché non è saldamente posizionato in posizione.

Quindi chiudere l'otturatore criogenico. Rabboccare il TEM anti contaminazione con azoto liquido. Inclinare nuovamente il tavolino del microscopio a meno 60 gradi.

Successivamente, iniziare il ciclo di camera stagna PrepU sul microscopio. Una volta terminata la sequenza della camera di compensazione della pompa, inserire il supporto del coro nella camera di compensazione e collegare il cavo di controllo del palco freddo al supporto per monitorare la temperatura. Dopo che la luce rossa si è spenta, ruotare il supporto in posizione zero per il suo inserimento nella colonna ad alto vuoto di T EM.

Ritrarre l'otturatore criogenico e aprire le valvole della colonna. Attivare il programma a basso dosaggio in modalità di ricerca. Centrare il palco e impostare l'altezza centrica utilizzando l'oscillazione alfa per far oscillare il palco di più o meno 15 gradi, selezionare un foro adatto e posizionarlo al centro del campo con il controller di scena XY.

Passa alla modalità di messa a fuoco e metti a fuoco l'immagine. Quindi a fuoco l'immagine tra 0,5 e 4,5 micron. Passa alla modalità di esposizione e registra l'immagine.

Infine, torna alla modalità di ricerca per selezionare il foro successivo e ripetere la sequenza. Qui vengono confrontate le immagini microscopiche ottenute con i metodi della colorazione negativa e della crioEM per quattro campioni rappresentativi con diverse caratteristiche strutturali: i capsidi virali adeno-associati colorati negativamente rivelano particelle simili a virus e la crioEM mostra che sono vuoti. Le immagini del virus del mosaico del tabacco mostrano barre elicoidali con il canale centrale pieno di colorante nella colorazione negativa e vuoto nelle immagini cryo EM.

KLH si assembla in barili caratteristici che mostrano sei striature sia nella colorazione negativa che nelle immagini criogeniche. Le viste laterali rettangolari e le viste circolari e on rivelano un vuoto in una struttura da cryo EM nel recettore odino. Caratteristiche superficiali intricate come una croce centrale e una depressione centrale si manifestano come accumulo di macchie per colorazione negativa e come regioni a bassa densità per crio.

Esempi tipici di artefatti criogenici EM sono il ghiaccio cristallino, la contaminazione da ghiaccio, l'astigmatismo e le strutture simili a ragnatele. L'analisi di singole particelle e la ricostruzione 3D del recettore dell'ine idratato congelato rivelano la sua quadruplice struttura simmetrica. Il dominio citoplasmatico forma un prisma quadrato e contiene diversi domini gulari riproducibili che formano una struttura simile a un'impalcatura.

A una risoluzione di 10 angstrom, è possibile visualizzare alfa HELOC in 3D. La mappatura delle differenze può rivelare la posizione di importanti ligandi. Le modifiche di conferma forniscono una visione dinamica della macromolecola.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni criogenici EM di alta qualità. Cryo EM, combinato con l'elaborazione delle immagini, ha permesso ai ricercatori di esplorare la struttura, l'organizzazione delle subunità e le dinamiche conformazionali delle macchine macromolecolari.