Campione strategie di preparazione per la Spettrometria di Massa Imaging di 3D Models Cultura cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare colture cellulari tridimensionali e analizzarle mediante imaging tramite spettrometria di massa. Questo viene ottenuto innanzitutto costruendo colture cellulari tridimensionali e permettendo loro di crescere fino alla dimensione desiderata. Il secondo passaggio consiste nel raccogliere e incorporare le colture cellulari tridimensionali in gelatina.

Successivamente, le colture cellulari tridimensionali vengono tagliate a meno 30 gradi Celsius utilizzando un criostato e montate su vetrini conduttivi. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare le sezioni mediante uno strumento Maldi MSI ed eseguire l'analisi delle molecole rilevate. In definitiva, l'analisi mediante imaging di spettrometria di massa viene utilizzata per mostrare le variazioni nella distribuzione degli analiti appartenenti a numerose classi diverse di biomolecole all'interno della coltura cellulare tridimensionale.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto a metodiche esistenti come la microscopia di massa o l'autoradiografia è che l'analisi spettrometrica consente la rilevazione e la localizzazione di molteplici analiti, come proteine, lipidi, farmaci e metaboliti, in un singolo esperimento senza necessità di marcatura anticorpale. A dimostrazione della procedura saranno Dorothy Alf Wheat craft, io stesso, un postdoc, e Shin Li, uno studente laureando del laboratorio Hamman. Prima di iniziare questa procedura, coltivare una linea cellulare appropriata, come la linea cellulare di carcinoma del colon HCT 116, in una coltura monolayer bidimensionale. Successivamente, aggiungere 0,19 grammi di aros a 10 millilitri di terreno standard in un tubo conico da 50 millilitri.

Assicurarsi l'incorporazione mediante mescolamento delicato, quindi sterilizzare in autoclave l'agarosio in bagno d'acqua per 20 minuti utilizzando un aspirato multi-pipetta. Distribuire 50 microlitri della miscela di mezzo Agros nelle 60 pozzette centrali di una piastra per colture a 96 pozzette con fondo piatto. Poiché le pozzette ai bordi periferici della piastra presentano tassi di evaporazione leggermente più elevati, aggiungere 200 microlitri di soluzione salina fosfato al 1x al posto dell'agarosio in queste pozzette periferiche.

Dopo aver aggiunto la miscela di aros ai pozzetti interni, mettere da parte la piastra per farla raffreddare a circa 37 gradi Celsius prima dell'aggiunta delle cellule. A questo punto, aggiungere 200 microlitri della soluzione cellulare appropriata alla piastra da 96 pozzetti rivestita con aros, coprire la piastra e collocarla in un incubatore umidificato con 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per la crescita cellulare. Dopo l'incubazione, sostituire il mezzo asportando con attenzione il vecchio mezzo dalle zone circostanti la coltura cellulare tridimensionale situata sul fondo degli aros.

Quindi aggiungere delicatamente 200 microlitri di mezzo fresco sulla coltura cellulare tridimensionale. Preparare una soluzione di circa 175 milligrammi per millilitro di gelatina in acqua ad alta purezza. Mescolare vigorosamente la gelatina dopo che la soluzione è diventata viscosa e difficile da manipolare.

Posizionare il tubo in un bagno d'acqua a circa 60 gradi Celsius, riscaldando fino a quando la soluzione diventa limpida e facile da aspirare. Utilizzando una pipetta sierologica da due millilitri, depositare 0,6 millilitri della soluzione di gelatina calda nei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti con fondo piatto. Posizionare immediatamente i coltivi cellulari tridimensionali lavati direttamente sopra lo strato di gelatina usando una diversa pipetta da due millilitri per evitare di rompere la struttura tridimensionale.

Dopo aver posizionato le colture cellulari sulla superficie dello strato di gelatina, pipettare con attenzione altri 0,6 millilitri della miscela di gelatina calda al di sopra di esse, in modo da non disturbare la loro posizione. Successivamente, congelare. Le colture cellulari tridimensionali incluse nella gelatina vanno conservate a meno 80 gradi Celsius.

Dopo aver rimosso la piastra a 24 pozzetti contenente le colture cellulari dal congelatore, riscaldare il fondo della piastra con una mano fino a quando le pinzette possono scivolare delicatamente lungo il lato del pozzetto. Successivamente, far scorrere con movimento uniforme le pinzette attorno al disco, liberando la gelatina senza scongelare il centro.

Aggiungere una goccia d'acqua al supporto del criostato e fissare il disco di gelatina al supporto. Quindi posizionare nel criostato per congelare. Dopo aver asportato l'eccesso di gelatina per esporre le colture cellulari tridimensionali, tagliarle lentamente con un movimento uniforme in sezioni di 12-16 micrometri.

Dopo aver scongelato le sezioni, montarle su vetrini di vetro rivestiti con ossido di indio e titanio. Dopo aver etichettato i vetrini, conservarli in un essiccatore per la rilevazione delle proteine integre. Lavare le sezioni in acetone freddo per rimuovere piccole molecole come i lipidi che potrebbero mascherare il segnale.

Preparare la matrice in una soluzione di solvente organico e acqua contenente acido tricloroacetico allo 0,1%. Utilizzare una siringa con ago sottile per applicare 0,5 microlitri della soluzione di matrice sulla sezione di coltura cellulare tridimensionale. Dopo aver lasciato cristallizzare la matrice, essiccare i vetrini in un essiccatore per almeno 30 minuti prima della Maldi MSI.

In questa fase dell'analisi, inserire i vetrini in un adattatore appositamente progettato per contenere in modo sicuro vetrini di dimensioni 75 millimetri per 25 millimetri, al fine di acquisire immagini di sezioni tridimensionali di colture cellulari. Successivamente, caricare l'adattatore con i vetrini nello strumento. Dopo aver sviluppato i metodi appropriati di acquisizione dati, regolare l'intervallo di massa per l'acquisizione dati di piccole molecole tra 101,000 rapporto massa/carica e per le proteine tra 8,020 e 5,000 rapporto massa/carica.

In seguito, regolare la potenza del laser, la frequenza, il numero di impulsi laser e la dimensione del punto utilizzando la soluzione di calibrazione e una fetta di coltura cellulare tridimensionale sacrificabile posta nelle vicinanze. Salvare questo metodo per l'uso nel software di imaging fornito dal produttore dello strumento. Sviluppare metodi di acquisizione dei dati proteici per il range di massa scelto come descritto in precedenza.

Quindi impostare i parametri specifici dello spettrometro di massa utilizzando il software di imaging. Dopo aver selezionato i parametri dello strumento e configurato la posizione del metodo di controllo dello strumento, scegliere dove eseguire la scansione della coltura cellulare tridimensionale. Successivamente, selezionare tre punti di riferimento appropriati sul campione, spostando il laser su ciascuno di essi.

Successivamente, acquisire la fotografia ottica dal software di controllo del laser MALDI TOF utilizzando la funzione di stampa schermata. Quindi avviare il processo di imaging dal software di imaging e acquisire spettri di massa da ciascuna sezione per l'analisi mirata. Eseguire l'analisi manuale degli spettri facendo clic su una massa nello spettro medio.

Infine, eseguire l'analisi statistica con i set di dati estratti mediante software matematico. L'imaging mediante spettrometria di massa ha il potenziale di rivelare numerose distribuzioni molecolari differenti in colture cellulari tridimensionali. Utilizzando il metodo precedentemente descritto, è possibile tracciare specie che vanno da piccole molecole a proteine di grandi dimensioni attraverso tutta la coltura.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare, sezionare e analizzare colture cellulari tridimensionali mediante imaging tramite spettrometria di massa.