Name: Campione strategie di preparazione per la Spettrometria di Massa Imaging di 3D Models Cultura cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Impara la preparazione di colture cellulari 3D per imaging spettrometria di massa usando MALDI MSI. Questo protocollo consente di rilevare proteine, lipidi e metaboliti senza marcatura.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dalla Walther Cancer Foundation nell'ambito del programma Advancing Basic Cancer Research presso l'Harper Cancer Research Institute dell'Università di Notre Dame (DARW) e dal 2011 Starter Grant della Society for Analytical Chemists di Pittsburgh (ABH). Grazie anche allo staff della Facility di Spettrometria di Massa e Proteomica per utili discussioni.

Coltura cellulare 1. 3D e preparazione per Imaging <ol><li> Cultura una linea cellulare adeguata, vale a dire, HCT116 colon carcinoma linea di cellule, in due dimensioni, cultura monostrato. </li><li> Grow HCT 116 cellule in un pallone T-25 con mezzi di McCoy 5A + 10% siero fetale bovino in un incubatore CO 2 5% fino al 50-70% di confluenza, che richiede generalmente un paio di giorni. </li><li> Celle di uscita con 0,25% soluzione di tripsina-EDTA e contano una parte delle cellule utilizzando un emocitometro e trypan blu colorazione per verificare la densità cellulare e la vitalità. </li><li> Dopo conteggio diluire le cellule con mezzo completo per ottenere un adeguato densità di semina di 6000 cellule / pozzetto, o 30.000 cellule / ml. </li></ol> 2. Preparare Agarose Micropiastre 96 pozzetti <ol><li> Aggiungere 0,19 g di agarosio a 10 ml di media normale in una provetta da 50 ml (soluzione di agarosio 1,5% in media) 10. Garantire incorporazione delicatamente miscelazione. Sterilizzare l&#39;agarosio in un bagno d&#39;acquaper 20 min. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, aspirato 50 ml di miscela agarosio + supporti nei 60 pozzi centrali del fondo 96 e piastra di coltura piatto piano. Come i pozzetti a bordi periferici della piastra hanno tassi di evaporazione leggermente superiori, aggiungere 200 microlitri 1x fosfato salina tamponata (PBS) invece del agarosio a questi bordi. </li><li> Una volta che la miscela agarosio è stato aggiunto ai pozzetti interni, impostare la piastra lasciate raffreddare a ~ 37 ° C prima dell&#39;aggiunta delle cellule. </li></ol> 3. Seed e tendono la cultura tridimensionale NOTA: Più o meno cellule possono essere seminate in funzione delle esigenze della cultura coinvolte, ma è stato determinato che tali condizioni producono strutture 3D coltura cellulare di circa 1 mm di diametro dopo 10-14 giorni di coltura (dati non mostrati) . <ol><li> Aggiungere 200 ml di soluzione di cella appropriata (diluito per contenere ~ 6.000 celle) al agarosio rivestito96 pozzetti. Coprire la piastra e impostare in incubatrice umidificata con 5% di CO 2 a 37 ° C per la crescita cellulare. </li><li> Cambiare supporti cellulari almeno ogni 48 ore, o quando appare il supporto da cambiare colore. <ol><li> Cambiare mezzi aspirando accuratamente il vecchio media di tutto il piccolo coltura cellulare 3D (visibile ad occhio nudo per giorno 2) nella parte inferiore della agarosio. Aggiungere 200 ml di mezzi freschi delicatamente sopra la coltura cellulare 3D. </li><li> (Passo opzionale) Durante questi cambiamenti dei media, aggiungere chemioterapici o altri farmaci per il test. Diluire il farmaco di scelta per la concentrazione finale con i media completo e aggiungere i necessari 200 ml di ogni bene. </li><li> Monitor 3D crescita coltura cellulare al microscopio ottico, finché le colture cellulari 3D sono di circa 1 mm di diametro. </li></ol></li></ol> 4. Harvest colture cellulari 3D <ol><li> Utilizzare un 2 ml pipetta sierologica per rimuovere delicatamente la coltura cellulare 3D dal letto agarosio. </li> &lt;li&gt; Lavare le colture cellulari 3D con PBS da loro pipettando delicatamente circa 1 ml di PBS in un attesa di 24 pozzetti. </li><li> Trasferimento raccolto colture cellulari 3D via pipetta sierologica per provette per l&#39;estrazione di proteine ​​o metaboliti, o incorporare in un mezzo taglio per aiutare nella affettare per applicazioni di imaging. </li></ol> 5. Inserire le colture cellulari 3D in gelatina <ol><li> Preparare una soluzione di ~ 175 mg / ml di gelatina in acqua ad elevata purezza (18 MW preferito). 22,23 Mescolare la gelatina vigorosamente. Osservare la soluzione diventa viscoso e difficile da manipolare. Posizionare il tubo conico-gelatina contenente in un bagno di acqua a 60 ° C e caldo fino a quando la soluzione diventa chiara e facile da aspirare. NOTA: La soluzione di gelatina calda indurisce rapidamente quando si raffredda, quindi effettuare tutte le seguenti fasi rapidamente prima del congelamento. </li><li> Dopo che è riscaldata, prendere immediatamente la gelatina alla cappa coltura cellulare. Mantenere il tubo con gelatina in beaker con acqua preriscaldata a circa 60 ° C per evitare l&#39;indurimento della soluzione di gelatina. </li><li> Usando una pipetta 2 ml sierologica, depositare 0,6 ml della soluzione di gelatina calda nel pozzetto di una piastra a fondo piatto 24. Questo volume è sufficiente a coprire il fondo in un sottile strato. Depositare delicatamente le colture cellulari 3D immediatamente al di sopra dello strato di gelatina utilizzando un diverso pipetta 2 ml per evitare la rottura della struttura 3D. NOTA: Si deve prestare attenzione in questa fase non collocare PBS nella gelatina. In questo caso, però, rimuovere il PBS dalla parte superiore della gelatina con una pipetta 200 microlitri. </li><li> Dopo le colture cellulari 3D sono posti sulla superficie dello strato di gelatina, pipettatura un&#39;altra 0,6 ml della miscela calda gelatina sopra le colture cellulari 3D, in modo da non disturbare la posizione delle culture. Dopo il secondo strato è posto, congelare le colture cellulari 3D gelatina incorporato a -80 ° C. </li></ol> 6. Slice e Thaw Monte the gelatina-integrato colture cellulari 3D per Mass spettrometrica Imaging <ol><li> Rimuovere la piastra ben 24 contenente le colture cellulari in 3D dal congelatore. Scaldare il fondo del piatto con il calore dalla tua mano fino a quando una pinzetta o bisturi scivoleranno dolcemente verso il lato del bene. </li><li> Uniformemente scorrere la pinzetta o bisturi, liberando la gelatina, senza scongelare il centro. Prendere una goccia d&#39;acqua al supporto criostato e utilizzare questa aderire il disco di gelatina al supporto. <ol><li> Colture cellulari 3D incorporati in gelatina sono più suscettibili di affettare a -30 ° C. Pulire la lama criostato e vetro con il 70% di etanolo prima dell&#39;uso. Utilizzare una parte diversa della lama o una nuova lama per ogni cella disco 3D cultura gelatina per impedire opacizzare della lama. </li></ol></li><li> Utilizzando il criostato, delicatamente affronteranno la gelatina in eccesso fino a quando le colture cellulari 3D diventano visibili. </li><li> A questo punto lentamente tagliare le colture cellulari 3D con un movimento regolare in 12-16 micron sezioni. NOTA: fattori critici di affettatura includono la distanza del vetro alla lama, l&#39;angolo della lama, la temperatura del criostato, e l&#39;angolo del disco sul supporto, quindi tutti questi devono essere controllati per garantire risultati coerenti. </li><li> Scongelare delicatamente le fette e li montano sul indio ossido di titanio (ITO) vetrini Rivestiti etichettati in modo appropriato e conservarlo in un essiccatore. Utilizzare le fette più rapidamente possibile per la massima qualità. </li></ol> 7. Matrix applicazione e preparazione del campione per MALDI Imaging <ol><li> Prima di imaging MALDI, preparare fette con matrice appropriata. <ol><li> Per piccola analisi molecola, sono generalmente richieste fasi di lavaggio. Per il rilevamento di proteine ​​intatte, lavare le fette a freddo 100% di acetone, il fluido di Carnoy, o al 70% / 95% isopropanolo per rimuovere piccole molecole, come i lipidi che potrebbero mascherare il segnale 24 -. 26 </li><li> Lavare delicatamente per non più di 30 secondi alla volta. Nondisturbare eventuali fette. </li></ol></li><li> Preparare matrice in una soluzione di solvente organico e acqua, con 0,1% TFA. Per piccola molecola come α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA), utilizzare 60% ​​ACN: 40% H 2 O: 0,1% TFA (10 mg / ml). Per il rilevamento di proteine ​​come l&#39;acido sinapico (30 mg / ml), la stessa soluzione solvente. Per solubilità ottimale dell&#39;acido sinapico, dissolvere in acetonitrile prima dell&#39;aggiunta del TFA: H 2 O soluzione. Altre matrici possono essere utilizzati come appropriato. NOTA: Matrix può essere applicato con metodi diversi, ma va notato alcune matrici sono stati trovati per co-cristallizzare con la gelatina, come l&#39;acido ferulico, rendendo inutilizzabile il campione. Cristalli più piccoli producono spettri di massa più consistente, consentendo specie più molecolari per individuare e attribuire alle differenze biologiche, piuttosto che gli effetti matrice. </li><li> Applicare matrice metodo handspotting. <ol><li> Utilizzare una siringa a punta fine di applicare 0,5 microlitri della matrsoluzione ix sulla fetta coltura cellulare 3D e consentire la matrice di cristallizzare. </li></ol></li><li> In alternativa, utilizzare il metodo aerografo. Riempire un aerografo grado commerciale con la soluzione di matrice. <ol><li> Tenere lo spruzzatore 8-12 centimetri di distanza dalla diapositiva, puntare un vapore in slice. Tra passaggi, permettono la matrice asciugare per 1 min per consentire la migliore formazione di cristalli. Fino a 10-20 passi del airbrush è necessario per produrre un livello ottimale di matrice 22. </li></ol></li><li> In alternativa, utilizzare il metodo di sublimazione dettagliato altrove. 25,27 </li><li> Diapositive secchi in un essiccatore per almeno 30 minuti prima MALDI-MSI, indipendentemente dal metodo di applicazione della matrice. 25 </li></ol> 8. MALDI-MSI analisi utilizzando un sistema MALDI-TOF (ie, Autoflex III) NOTA: Questa sezione contiene le istruzioni e consigli per l&#39;impostazione dei parametri per un esperimento di imaging MALDI-TOF. A seconda delle insproduttore trument e software utilizzato, il processo può variare. <ol><li> Inserire le diapositive in un adattatore fatto per tenere saldamente 75 millimetri x 25 millimetri diapositive immagine le fette di coltura cellulare 3D collegati a diapositive ITO rivestiti. Caricare l&#39;adattatore slitta nello strumento. </li><li> Preparare lo strumento per MALDI-MSI selezionando uno standard di calibrazione appropriato per la gamma messa in questione. Per interrogatori di piccole molecole, i segnali rilevati corrispondenti alla matrice utilizzata, α-CHCA, sono un gruppo comune dei calibranti. Per l&#39;analisi delle proteine, standard proteina nota (ad esempio, l&#39;ubiquitina, tripsinogeno) nel range di massa di interesse vengono selezionati e individuati adiacente alle colture cellulari 3D come calibratori. Calibrare lo strumento prima di procedere con lo sviluppo del metodo. </li><li> Prima di imaging, sviluppare metodi di acquisizione dati per l&#39;intervallo di massa di scelta utilizzando il software fornito dal produttore dello strumento. Vedi figure 1 e 2 perpiccola molecola proteica e di imaging. Per le piccole immagini molecola, utilizzare reflectron modalità per la più alta risoluzione di massa. <ol><li> Regolare l&#39;intervallo di massa per l&#39;acquisizione dati piccola molecola tra 100-1.000 m / z e per le proteine ​​tra 8.000 25.000 m / z. Regolare il range di massa per comprendere la regione scelta fornendo la massima risoluzione di massa possibile con lo strumento. </li><li> Regolare potenza del laser, la frequenza, il numero di scatti laser e dimensione dello spot utilizzando la soluzione di calibrazione e una vicina fetta &#39;sacrificale&#39; coltura cellulare 3D. Rispettare queste impostazioni nel software principale di controllo dello strumento. Utilizzare le seguenti impostazioni come punto di partenza consigliato: potenza del 60%, 400 colpi laser, ultra piccola dimensione del punto. Queste impostazioni varieranno tra strumenti e metodi, così ottimizzare i parametri dello strumento per dare gli spettri più di alta qualità per ogni strumento specifico. Altri parametri che possono essere regolati includono il guadagno del rivelatore, frequenza di campionamento, e il guadagno elettronico. Save questo metodo per l&#39;utilizzo del software di imaging (es., Metodo Esecuzione automatica che FlexImaging si avvarrà). NOTA: ioni Soppressione di sotto del range di massa di interesse (nuovo trovato nel controllo dello strumento) in modo da non interferire con il riconoscimento. </li><li> Sviluppare proteine ​​metodi di acquisizione dati per l&#39;intervallo di massa di scelta. Seguite la stessa procedura di cui sopra, ma per le gamme di massa medio-alto, sopra di circa 3 kDa, utilizzare la modalità lineare. NOTA: Le impostazioni saranno diversi da quelli utilizzati per i piccoli metodi di molecola. </li></ol></li><li> Setup specifici parametri dello strumento MS utilizzando il software di imaging fornito dal costruttore dello strumento, come ad esempio per i sistemi FlexImaging Bruker MALDI-TOF. <ol><li> Creare un nuovo file di immagini e cartelle, utilizzando i metodi sviluppati prima e salvati. Selezionare i parametri dello strumento come il formato di punto raster (cambiamento dal difetto circa 200 micron a 50 micron), impostare il metodo di controllo strumento (impostazione al punto 8.3.2 o 8.3.3), e posizione dove eseguire la scansione in coltura cellulare 3D. </li><li> Selezionare tre punti teach appropriate sul campione, spostando il laser a turno. Ottenere la fotografia ottica dal software di controllo laser MALDI-TOF utilizzando &#39;schermata di stampa&#39;. NOTA: Molti programmi software di imaging richiedono una fotografia ottica del campione &#39;insegnare&#39; il software in cui si trova il laser, che può essere ottenuto con uno scanner o spesso fotocamera strumento. </li></ol></li><li> Quindi avviare il processo di imaging dal software di imaging (non il controllo dello strumento) e di acquisire spettri di massa da ogni fetta. Osservare la maggior parte delle masse attraverso la coltura cellulare 3D e altre localizzate in aree particolari. </li></ol> 9. opzionali Dati metodi di analisi <ol><li> Per l&#39;analisi mirata, effettuare analisi manuale degli spettri facendo clic su una massa nello spettro media, o consentire il software di imaging per raccogliere automaticamente le masse di sopra di una determinata soglia (ad es., Picchi abil sobrio all&#39;inizio soglia del 20%). Per il controllo di qualità, esaminare la distribuzione dei picchi di matrice o spettro media. </li><li> Effettuare analisi statistiche con set di dati estratti nel software matematico, come R o Matlab. <ol><li> Export singolo spettri in formato ASCII, un file di testo leggibile, per il caricamento nel software di scelta. </li><li> Convertire gli spettri individuo a ASCII, mzXML, formato mzML per la lettura da diversi programmi software diversi, 28 -. 31 o esportare i dati come Analyze (.img) file di formato, un formato comune utilizzato per altre applicazioni di imaging come la risonanza magnetica 32 Due opzioni open source per l&#39;analisi sono MSiReader e BioMap 32,33. </li><li> Una volta che i file vengono esportati in un formato leggibile dal software, caricare il set di dati tramite le istruzioni del relativo software. Dopo il caricamento, eseguire l&#39;elaborazione post-acquisizione, come la rimozione di base e la normalizzazione. </li><li> Con questo insieme di dati, eseguire ferrtrattamenti stical quali analisi delle componenti principali di clustering gerarchico utilizzando sia script personalizzati o incorporati in algoritmi in software come Matlab 18. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Single cell matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging.</a> Anal Chem. 84 (15), 6293-6297 (2012).</li>
<li>Cornett, D., Frappier, S., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-FTICR+imaging+mass+spectrometry+of+drugs+and+metabolites+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MALDI-FTICR imaging mass spectrometry of drugs and metabolites in tissue.</a> Anal Chem. 80 (14), 5648-5653 (2008).</li>
<li>Reyzer, M. L., Hsieh, Y., Ng, K., Korfmacher, W. a, Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+drug+candidates+in+tissue+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of drug candidates in tissue by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 38 (10), 1081-1092 (2003).</li>
<li>Reyzer, M. L., Chaurand, P., Angel, P. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+molecular+analysis+of+whole-body+animal+tissue+sections+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by MALDI imaging mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 656 (18), 285-301 (2010).</li>
<li>Cornett, D., Reyzer, M., Chaurand, P., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry%3A+molecular+snapshots+of+biochemical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat Methods. 4 (10), 828-833 (2007).</li>
<li>Guenther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+by+mass+spectrometry%3A+label-free+tissue+characterization+obtained+from+high-accuracy+bioanalytical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Histology by mass spectrometry: label-free tissue characterization obtained from high-accuracy bioanalytical imaging.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (22), 3834-3838 (2010).</li>
<li>Schwamborn, K., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+by+mass+spectrometry--looking+beyond+classical+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology.</a> Nat Rev Cancer. 10 (9), 639-646 (2010).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. a, Kreutz, M., Knuechel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+spheroids%3A+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+to+study+tumour+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Multicellular spheroids: a three-dimensional in vitro culture system to study tumour biology.</a> Int J Exp Pathol. 79 (1), 1-23 (1998).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+drug+screen%3A+considerations+and+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat Protoc. 4 (3), 309-324 (2009).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Fernandes, T. G., Kwon, S. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+microarray+for+high-throughput+studies+of+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate.</a> Biotechnol Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).</li>
<li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+a+three-dimensional%2C+microarray+environment+on+human+cell+culture+in+drug+screening+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).</li>
<li>Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry%3A+From+tissue+sections+to+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).</li>
<li>Li, H., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+of+three-dimensional+cell+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems.</a> Anal Chem. 83 (22), 8794-8801 (2011).</li>
<li>Liu, X., Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Therapeutics+in+Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Therapeutics in Three-Dimensional Cell Culture Systems by MALDI Imaging Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 85 (13), 6295-6302 (2013).</li>
<li>Ahlf, D. R., Masyuko, R. N., Hummon, A. B., Bohn, P. Correlated Mass Spectrometry Imaging and Confocal Raman Microscopy for Studies of Three-Dimensional Cell Culture Sections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhlf%2C+DR+%22Analyst%22">Analyst</a>. 139 (18), 4578-4585 (2014).</li>
<li>Derda, R., Tang, S. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multizone+paper+platform+for+3D+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Multizone paper platform for 3D cell cultures.</a> PloS one. 6 (5), 18940(2011).</li>
<li>Imbeault, S., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. aL. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+protein+in+3D+neural+stem+cell+culture%3A+a+hybrid+visualization+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Localizing protein in 3D neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology.</a> J Vis Exp. 2 (46), 2-7 (2010).</li>
<li>He, W., Kuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Comparison+of+3D+and+2D+Glioma+Models+Reveals+Increased+HLA-E+Expression+in+3D+Models+is+Associated+with+Resistance+to+NK+Cell-Mediated+Cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic Comparison of 3D and 2D Glioma Models Reveals Increased HLA-E Expression in 3D Models is Associated with Resistance to NK Cell-Mediated Cytotoxicity.</a> J Proteome Res. 13 (5), 2272-2281 (2014).</li>
<li>Chen, R., Cape, S. S., Sturm, R. M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometric+Imaging+of+Neuropeptides+in+Decapod+Crustacean+Neuronal+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometric Imaging of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues.</a> Methods Mol Biol. 656, 451-463 (2010).</li>
<li>DeKeyser, S. S., Kutz-Naber, K. K., Schmidt, J. J., Barrett-Wilt, G. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+of+Neuropeptides+in+Decapod+Crustacean+Neuronal+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1782-1791 (2007).</li>
<li>Van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Fornai, L., Glunde, K., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+paper+based+tissue+washing+method+for+mass+spectrometry+imaging%3A+localized+washing+and+fragile+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An alternative paper based tissue washing method for mass spectrometry imaging: localized washing and fragile tissue analysis.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 22 (10), 1885-1890 (2011).</li>
<li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Sublimation%2FRecrystalization+for+Imaging+Proteins+by+Mass+Spectrometry+at+High+Spatial+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Matrix Sublimation/Recrystalization for Imaging Proteins by Mass Spectrometry at High Spatial Resolution.</a> Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2012).</li>
<li>Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+protein+sensitivity+for+MALDI+imaging+mass+spectrometry+after+chemical+treatment+of+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).</li>
<li>Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-mass+spectrometric+imaging+for+the+investigation+of+metabolites+in+Medicago+truncatula+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">MALDI-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in Medicago truncatula root nodules.</a> J Vis Exp. 1 (85), 1-11 (2014).</li>
<li>Deutsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mzML%3A+a+single%2C+unifying+data+format+for+mass+spectrometer+output%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output).</a> Proteomics. 8 (14), 2776-2777 (2008).</li>
<li>Pedrioli, P. G. a, Eng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+open+representation+of+mass+spectrometry+data+and+its+application+to+proteomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research.</a> Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).</li>
<li>Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+mzXML+good+for%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">What is mzXML good for.</a> Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).</li>
<li>Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -J., Binz, P. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+the+data+explosion.+A+report+on+the+HUPO-PSI+Workshop.+August+2008%2C+Amsterdam%2C+The+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands.</a> Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).</li>
<li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a, Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSiReader%3A+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).</li>
<li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides+3D+volume+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction.</a> Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).</li>
</ol>

Questo articolo fa parte di un numero speciale sull'imaging preclinico multimodale, sponsorizzato da Bruker Biospin. Il sistema MALDI-TOF utilizzato per ottenere i risultati rappresentativi è un Bruker AutoFlex III.

Utilizzando i metodi di cui sopra, colture cellulari 3D possono essere coltivate e analizzati con MALDI-MSI. Molte linee cellulari immortali formeranno strutture 3D quando coltivate in modo appropriato. 9,10 deve prestare attenzione a coltivare le cellule che non sono stati superati troppe volte, cioè, hanno numeri di passaggio basso. In generale, le cellule con numeri passaggio di dieci e inferiore sono ottimali per la coltivazione di colture cellulari 3D. Crescere le colture cellulari in 3D in un supporto tradizionale agarosio fornisce un modo conveniente per gruppi di ricerca interessati alla coltura cellulare 3D per provare questo sistema. Questo metodo utilizza pochi componenti non già nella maggior parte dei laboratori di coltura cellulare di mammifero. Particolare attenzione deve essere rivolta alla preparazione dei piatti agarosio per la crescita in modo che le colture cellulari 3D sono coerenti per forma e dimensioni; alcuni aspetti che richiedono attenzione includono controllando che bolle d&#39;aria sono intrappolate alla miscela e che un adeguato menisco viene formato nella parte inferiore di ciascun well. Se il menisco non forma correttamente, le cellule possono crescere in forme non sferoidali o in piccoli grumi. Inoltre, bisogna fare attenzione a non mettere PBS in gelatina con sferoidi. Se questo accade, rimuovere il PBS dalla parte superiore della gelatina con una pipetta 200 microlitri. Se il costo non è un fattore, piastre inferiori rotonde vincolanti ultra-basse sono commercialmente disponibili e offrono la semplificazione di questi passi. Mentre altri metodi all&#39;incorporamento tessuti possono anche essere compatibile spettrometria costosa e non di massa, gelatina-embedding ha dimostrato di essere sia poco costoso e versatile. Strategie di preparazione di cui sopra sono state ottimizzate per colture cellulari in 3D per ottenere i dati di altissima qualità. Mentre gelatina-embedding ha dimostrato di essere compatibile con l&#39;analisi di spettrometria di massa, questo processo non restringere le matrici disponibili a causa di co-cristallizzazione. Una volta congelato, le colture cellulari in 3D sono stabili per mesi fino a quando non sono congelamento-scongelamento. La gelatina diventa opaco quando congelato, e la cellula 3Dculture sono di un colore simile, quindi è consigliabile prima del congelamento per documentare il posizionamento coltura cellulare 3D per aiutare a taglio. Nel preparare diapositive, matrice può essere applicato con metodi diversi, ma va notato che alcune matrici sono stati trovati per co-cristallizzare con la gelatina, come l&#39;acido ferulico, rendendo inutilizzabile il campione. Cristalli di matrice più piccoli producono spettri di massa più consistente. Mentre handspotting è il metodo più semplice di applicazione della matrice, il volume di solvente più grande può comportare misure di cristallo più grandi e significative migrazioni analiti. Al spettrometro di massa, i progressi nelle tecnologie MALDI-MSI hanno ridotto le competenze necessarie per le analisi inizio. L&#39;acquisizione dei dati e l&#39;analisi è semplice sulla maggior parte dei sistemi, permettendo anche un principiante di ottenere informazioni di alta qualità da diapositive ITO-rivestiti. Un&#39;attenta selezione dei parametri dello strumento, ottimizzato sulla vicina non un&#39;immagine degna 3D cultur cellularees, è fondamentale per ottenere dati di alta qualità. Ad esempio, aumentando la potenza del laser può aumentare l&#39;intensità di picco ma diminuire la potenza del laser può migliorare la risoluzione e dare forma dei picchi più simmetrici. Colture cellulari 3D devono essere utilizzati rapidamente dopo il taglio al fine di garantire una qualità ottimale del campione. Degradazione del segnale di proteina può essere visto in meno di una settimana senza corretta conservazione (essiccatore / -80 ° C freezer), in particolare nella regione ad alta massa (circa 20 kDa). A causa della crescente domanda, sono stati sviluppati molti programmi software di visualizzazione differenti e sono liberi al pubblico di ricerca. La maggior parte degli spettrometri di massa di imaging hanno installato il software necessario per visualizzare i singoli masse con i formati proprietari utilizzati su ogni strumento. Questi programmi software possono essere utilizzati per ottenere immagini single-massa ed esportare i dati. La maggior parte del software permetterà anche la sovrapposizione di due o più masse di interesse. Inoltre, molti spettatori diversi per i dati MSI sono da scaricare gratuitamente, come ad esempio un MSiReaderd BioMap. 32,33 I dati di spettrometria di massa ottenuti possono anche essere trattati post-acquisizione con facilità, portando informazioni più utili alla ribalta. Da farmaceutici a lipidi alle proteine, il sistema sopra descritto permette una rapida acquisizione di dati per valutare la distribuzione delle molecole di interesse in una struttura di coltura cellulare 3D. Sezioni seriali possono essere adottate per immagine dell&#39;intera struttura 3D costruendo da ogni immagine 2D di una fetta di coltura cellulare 3D. Le tecniche e le note del protocollo saranno di utilità per i ricercatori che desiderano iniziare a coltura cellulare tridimensionale come un ponte tra la cultura monostrato e modelli animali. Una volta masterizzato, queste tecniche possono essere applicate a diversi tipi di colture cellulari 3D, tessuti e colture cellulari, consentendo ai ricercatori di immagine a seconda di quale dei campioni che scelgono.

L'imaging per spettrometria di massa (MSI) è una potente tecnica per esaminare la distribuzione delle specie molecolari tra i campioni di interesse. Con questa tecnica, i ricercatori hanno analizzato campioni biologici da animali interi fino a singole cellule. 1–4 Utilizzando MSI è possibile eseguire l'imaging di centinaia di analiti contemporaneamente, piuttosto che tecniche a singolo substrato che richiedono lo sviluppo di fluorofori aggiuntivi per la microscopia confocale tradizionale o la colorazione per l'istologia. 5-7 Inoltre, l'MSI può essere utilizzato in modo mirato o basato sulla scoperta, rendendolo un approccio interessante per osservare la sovrapposizione tra la distribuzione delle specie chimiche. All'interno vengono presentati metodi per la crescita, la preparazione e l'imaging MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization/Desorption) di piccoli campioni (~1 mm di diametro) di colture cellulari multicellulari tridimensionali. 8–11
Le colture cellulari 3D sono di particolare interesse per la comunità biologica come intermediario tra la tradizionale coltura monostrato e i tumori in vivo. Come suggerisce il nome, le colture cellulari 3D sono aggregati cellulari eterogenei che contengono molti dei gradienti chimici nel microambiente osservati nei piccoli noduli tumorali avascolari, rendendole un sistema modello più realistico per l'ambiente tumorale nativo rispetto alla coltura monostrato. 10 Molte linee cellulari umane possono essere coltivate come colture 3D, comprese le linee cellulari derivate da tessuti di colon, mammella, ovaie, prostate, reni e polmoni. 10 L'imaging di colture cellulari tridimensionali presenta delle sfide intrinseche, in quanto sono più piccole di molti campioni comunemente utilizzati per l'imaging con spettrometria di massa e pertanto richiedono un'attenta preparazione del campione. 7 Tuttavia, i vantaggi di questi sistemi di modelli trattabili includono costi inferiori e tempi di crescita e analisi più rapidi rispetto ai modelli animali. Di conseguenza, gli studi che coinvolgono colture cellulari tridimensionali possono avere una produttività maggiore rispetto agli studi tradizionali sugli animali. 12-14
Tutti questi vantaggi hanno portato a una crescente popolarità delle colture cellulari tridimensionali nella ricerca biologica; c'è una corrispondente necessità di sviluppare nuove strategie analitiche per esplorare sia la composizione che la distribuzione spaziale delle molecole in questi sistemi. 12,15–21 L'obiettivo di questo manoscritto è quello di descrivere l'adattamento dei metodi di imaging con spettrometria di massa e la preparazione dei campioni a colture cellulari tridimensionali.

<table><tbody><tr><td>HCT116 Linea cellulare</td><td>ATCC ATCC</td><td>CCL-247</td><td>Potenziale pericolo, maneggiare con cura</td></tr><tr><td>Terreno 5A di McCoy</td><td>Gibco</td><td>16600-108</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30071,03</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25%</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato </td><td>Gibco</td> salino tamponato <td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>gelatina, Knox</td><td></td><td></td> non aromatizzato <td>Disponibile nella maggior parte dei negozi di alimentari in confezioni singole di</td></tr><tr><td>vetrini rivestiti ITO</td><td>Delta Technologies, Limited</td><td>CG-90IN-S115</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>Acido sinapico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85429</td><td></td></tr><tr><td>0,3 mm Alimentazione a gravità Doppia azione Airbrush Paint Spray Gun Set</td><td>RoyalMax Airbrush</td><td></td><td>Molte opzioni disponibili su siti come Amazon.com</td></tr></tbody></table>

campione strategie di preparazione per la spettrometria di massa imaging di 3d models cultura cellulare

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Le colture cellulari tridimensionali sono modelli interessanti per la ricerca biologica. Combinano la flessibilità e l'economicità della coltura cellulare con parte della complessità spaziale e molecolare del tessuto. Ad esempio, molte linee cellulari formano strutture 3D in condizioni appropriate in vitro. Le linee cellulari di cancro del colon formano sferoidi di colture cellulari 3D, imitatori in vitro di noduli tumorali avascolari. Mentre l'immunoistochimica e altri metodi di imaging classici sono popolari per monitorare la distribuzione di analiti specifici, l'imaging spettrometrico di massa esamina la distribuzione di classi di molecole in modo imparziale. Sebbene l'imaging spettrometrico di massa MALDI sia stato originariamente sviluppato per interrogare campioni ottenuti da esseri umani o modelli animali, questo rapporto descrive l'analisi di colture cellulari tridimensionali in vitro, compresi i miglioramenti nelle strategie di preparazione dei campioni. Qui vengono descritti i metodi per la crescita, la raccolta, il sezionamento, il lavaggio e l'analisi di colture cellulari 3D tramite imaging con desorbimento/ionizzazione-spettrometria di massa laser assistita da matrice (MALDI-MS). Utilizzando colture cellulari 3D di carcinoma del colon come sistema modello, questo protocollo dimostra la capacità di monitorare gli analiti in modo imparziale attraverso il sistema di coltura cellulare 3D con MALDI-MSI.

Immagini MSI ha il potenziale per rivelare molte distribuzioni molecolari diversi in colture cellulari 3D. Utilizzando il metodo descritto sopra, specie da piccole molecole (Figura 1) per grandi proteine ​​(Figura 2) possono essere monitorati attraverso la cultura. Questi risultati mostrano la visualizzazione di un singolo ione con lo strumento gratuito MSiReader. 32 I risultati possono essere analizzati per singoli ioni di interesse attraverso la coltura cellulare 3D con software di visualizzazione in una regione di interesse o l&#39;intera regione scansionata. Inoltre la maggior parte del software visualizzerà automaticamente ioni di sopra di una certa soglia impostata dall&#39;utente, che può aiutare gli sforzi di scoperta. Una volta che si ottengono mappe singolo ione, più software include la capacità di sovrapporre le immagini per vedere la colocalizzazione di ioni. Sia in approcci discovery-based o in modo mirato, l&#39;imaging spettrometria di massa è un potente strumento per analizzare colture cellulari 3D. Figura 1. Risultati rappresentativi del 3D crescita coltura cellulare e sezionamento. Sinistra) ottico di immagine di una struttura di coltura cellulare colorettale HCT-116 3D intatta come visto il giorno 14 prima della raccolta. Destra) ottico di immagine di una fetta di circa equatoriale un colorettale 3D coltura cellulare disgelo montato su uno scivolo di ITO rivestito per l&#39;imaging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" /> Figura 2. Risultati rappresentativi di piccola molecola MALDI-MSI di una sezione equatoriale di una coltura cellulare 3D. Top) spettri di massa medio ottenuto con α-CHCA in gamma bassa massa (piccola molecola). Basso) Immagini rappresentative dellauna massa unica: 327,8 m / z localizzata principalmente all&#39;interno della coltura cellulare 3D e 429,7 m / z localizzata principalmente al bordo della coltura cellulare 3D. La linea tratteggiata indica il margine approssimativo della sferoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" /> Figura 3. Risultati rappresentativi dell&#39;imaging proteine ​​di MALDI-MSI di una sezione equatoriale di una coltura cellulare 3D. Top) spettri di massa medio ottenuto con l&#39;acido sinapico in alto (intervallo di proteine) di massa. Inferiore) Immagini rappresentative di una massa unica: 10.871 m / z localizzata principalmente al bordo dello sferoide, e 12.184 m / z localizzato più verso l&#39;interno dello sferoide. La linea tratteggiata indica il bordo approssimativa dello sferoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Linee cellulari di cancro immortalato può essere coltivata come colture cellulari in 3D, un modello importante per la ricerca biologica. Questo protocollo descrive massa spettrometria di imaging di colture cellulari 3D, tra cui il miglioramento della piattaforma di preparazione del campione. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di istruire gli utenti a preparare colture cellulari in 3D per l&#39;analisi di imaging spettrometria di massa.

Campione strategie di preparazione per la Spettrometria di Massa Imaging di 3D Models Cultura cellulare

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare colture cellulari tridimensionali e analizzarle mediante imaging tramite spettrometria di massa. Questo viene ottenuto innanzitutto costruendo colture cellulari tridimensionali e permettendo loro di crescere fino alla dimensione desiderata. Il secondo passaggio consiste nel raccogliere e incorporare le colture cellulari tridimensionali in gelatina.Successivamente, le colture cellulari tridimensionali vengono tagliate a meno 30 gradi Celsius utilizzando un criostato e montate su vetrini conduttivi. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare le sezioni mediante uno strumento Maldi MSI ed eseguire l'analisi delle molecole rilevate. In definitiva, l'analisi mediante imaging di spettrometria di massa viene utilizzata per mostrare le variazioni nella distribuzione degli analiti appartenenti a numerose classi diverse di biomolecole all'interno della coltura cellulare tridimensionale.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto a metodiche esistenti come la microscopia di massa o l'autoradiografia è che l'analisi spettrometrica consente la rilevazione e la localizzazione di molteplici analiti, come proteine, lipidi, farmaci e metaboliti, in un singolo esperimento senza necessità di marcatura anticorpale. A dimostrazione della procedura saranno Dorothy Alf Wheat craft, io stesso, un postdoc, e Shin Li, uno studente laureando del laboratorio Hamman. Prima di iniziare questa procedura, coltivare una linea cellulare appropriata, come la linea cellulare di carcinoma del colon HCT 116, in una coltura monolayer bidimensionale. Successivamente, aggiungere 0,19 grammi di aros a 10 millilitri di terreno standard in un tubo conico da 50 millilitri.Assicurarsi l'incorporazione mediante mescolamento delicato, quindi sterilizzare in autoclave l'agarosio in bagno d'acqua per 20 minuti utilizzando un aspirato multi-pipetta. Distribuire 50 microlitri della miscela di mezzo Agros nelle 60 pozzette centrali di una piastra per colture a 96 pozzette con fondo piatto. Poiché le pozzette ai bordi periferici della piastra presentano tassi di evaporazione leggermente più elevati, aggiungere 200 microlitri di soluzione salina fosfato al 1x al posto dell'agarosio in queste pozzette periferiche.Dopo aver aggiunto la miscela di aros ai pozzetti interni, mettere da parte la piastra per farla raffreddare a circa 37 gradi Celsius prima dell'aggiunta delle cellule. A questo punto, aggiungere 200 microlitri della soluzione cellulare appropriata alla piastra da 96 pozzetti rivestita con aros, coprire la piastra e collocarla in un incubatore umidificato con 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per la crescita cellulare. Dopo l'incubazione, sostituire il mezzo asportando con attenzione il vecchio mezzo dalle zone circostanti la coltura cellulare tridimensionale situata sul fondo degli aros.Quindi aggiungere delicatamente 200 microlitri di mezzo fresco sulla coltura cellulare tridimensionale. Preparare una soluzione di circa 175 milligrammi per millilitro di gelatina in acqua ad alta purezza. Mescolare vigorosamente la gelatina dopo che la soluzione è diventata viscosa e difficile da manipolare.Posizionare il tubo in un bagno d'acqua a circa 60 gradi Celsius, riscaldando fino a quando la soluzione diventa limpida e facile da aspirare. Utilizzando una pipetta sierologica da due millilitri, depositare 0,6 millilitri della soluzione di gelatina calda nei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti con fondo piatto. Posizionare immediatamente i coltivi cellulari tridimensionali lavati direttamente sopra lo strato di gelatina usando una diversa pipetta da due millilitri per evitare di rompere la struttura tridimensionale.Dopo aver posizionato le colture cellulari sulla superficie dello strato di gelatina, pipettare con attenzione altri 0,6 millilitri della miscela di gelatina calda al di sopra di esse, in modo da non disturbare la loro posizione. Successivamente, congelare. Le colture cellulari tridimensionali incluse nella gelatina vanno conservate a meno 80 gradi Celsius.Dopo aver rimosso la piastra a 24 pozzetti contenente le colture cellulari dal congelatore, riscaldare il fondo della piastra con una mano fino a quando le pinzette possono scivolare delicatamente lungo il lato del pozzetto. Successivamente, far scorrere con movimento uniforme le pinzette attorno al disco, liberando la gelatina senza scongelare il centro.Aggiungere una goccia d'acqua al supporto del criostato e fissare il disco di gelatina al supporto. Quindi posizionare nel criostato per congelare. Dopo aver asportato l'eccesso di gelatina per esporre le colture cellulari tridimensionali, tagliarle lentamente con un movimento uniforme in sezioni di 12-16 micrometri.Dopo aver scongelato le sezioni, montarle su vetrini di vetro rivestiti con ossido di indio e titanio. Dopo aver etichettato i vetrini, conservarli in un essiccatore per la rilevazione delle proteine integre. Lavare le sezioni in acetone freddo per rimuovere piccole molecole come i lipidi che potrebbero mascherare il segnale.Preparare la matrice in una soluzione di solvente organico e acqua contenente acido tricloroacetico allo 0,1%. Utilizzare una siringa con ago sottile per applicare 0,5 microlitri della soluzione di matrice sulla sezione di coltura cellulare tridimensionale. Dopo aver lasciato cristallizzare la matrice, essiccare i vetrini in un essiccatore per almeno 30 minuti prima della Maldi MSI.In questa fase dell'analisi, inserire i vetrini in un adattatore appositamente progettato per contenere in modo sicuro vetrini di dimensioni 75 millimetri per 25 millimetri, al fine di acquisire immagini di sezioni tridimensionali di colture cellulari. Successivamente, caricare l'adattatore con i vetrini nello strumento. Dopo aver sviluppato i metodi appropriati di acquisizione dati, regolare l'intervallo di massa per l'acquisizione dati di piccole molecole tra 101,000 rapporto massa/carica e per le proteine tra 8,020 e 5,000 rapporto massa/carica.In seguito, regolare la potenza del laser, la frequenza, il numero di impulsi laser e la dimensione del punto utilizzando la soluzione di calibrazione e una fetta di coltura cellulare tridimensionale sacrificabile posta nelle vicinanze. Salvare questo metodo per l'uso nel software di imaging fornito dal produttore dello strumento. Sviluppare metodi di acquisizione dei dati proteici per il range di massa scelto come descritto in precedenza.Quindi impostare i parametri specifici dello spettrometro di massa utilizzando il software di imaging. Dopo aver selezionato i parametri dello strumento e configurato la posizione del metodo di controllo dello strumento, scegliere dove eseguire la scansione della coltura cellulare tridimensionale. Successivamente, selezionare tre punti di riferimento appropriati sul campione, spostando il laser su ciascuno di essi.Successivamente, acquisire la fotografia ottica dal software di controllo del laser MALDI TOF utilizzando la funzione di stampa schermata. Quindi avviare il processo di imaging dal software di imaging e acquisire spettri di massa da ciascuna sezione per l'analisi mirata. Eseguire l'analisi manuale degli spettri facendo clic su una massa nello spettro medio.Infine, eseguire l'analisi statistica con i set di dati estratti mediante software matematico. L'imaging mediante spettrometria di massa ha il potenziale di rivelare numerose distribuzioni molecolari differenti in colture cellulari tridimensionali. Utilizzando il metodo precedentemente descritto, è possibile tracciare specie che vanno da piccole molecole a proteine di grandi dimensioni attraverso tutta la coltura.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare, sezionare e analizzare colture cellulari tridimensionali mediante imaging tramite spettrometria di massa.

sample-preparation-strategies-for-mass-spectrometry-imaging-3d-cell

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Qui, presentiamo i protocolli per eseguire sia l'imaging con spettrometria di massa ambientale (MSI) dei tessuti che l'analisi in situ di MS a singola cellula viva (SCMS) utilizzando la sonda singola, che è un dispositivo multifunzionale miniaturizzato per l'analisi MS.

Applicazioni del singolo-probe: Mass Spectrometry Imaging e analisi singola cella in condizioni ambientali

Questo protocollo descrive un metodo attendibile e riproducibile per la preparazione di base di sublimazione di formalina riparata tessuto destinato per imaging spettrometria di massa.

Preparazione ottimale di formalina riparata campioni per Peptide basati su matrice assistita spettrometria totale di desorbimento/ionizzazione Laser i flussi di lavoro di Imaging

Un nuovo metodo di preparazione del campione è stato sviluppato per ospitare coculture delle cellule e del tessuto per rilevare cambio piccola molecola usando la spettrometria totale imaging.

Acquisizione di piccola molecola comunicazione tra tessuti e cellule mediante spettrometria di massa di Imaging

Una piattaforma di manipolazione cellulare integrata è sviluppata per l'uso in combinazione con una configurazione di spettrometria di massa a singola sonda per l'analisi on-line delle singole cellule delle sospensioni in condizioni ambientali.

Piattaforma di manipolazione cellulare integrata accoppiata con la sonda singola per l'analisi della spettrometria di massa di farmaci e metaboliti in singole cellule di sospensione

Qui, forniamo protocolli dettagliati, robusti e complementari per eseguire la colorazione e l'imaging a risoluzione subcellulare di modelli di coltura cellulare tridimensionale fissi che vanno da 100 μm a diversi millimetri, consentendo così la visualizzazione della loro morfologia, composizione del tipo di cellula e interazioni.

Colorazione e imaging ad alta risoluzione di modelli organoidi e sferoidi tridimensionali

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per la produzione di tre diversi tipi di sferoidi in un modo che li rende adatti per lo screening e l'analisi ad alto contenuto su larga scala. Inoltre, vengono presentati esempi che mostrano come possono essere analizzati a livello sferoidale e di singole cellule.

Un metodo robusto per la produzione su larga scala di sferoidi per applicazioni di screening e analisi ad alto contenuto

Presentiamo un protocollo per la coltivazione di sferoidi ad alta riproducibilità e la loro caratterizzazione fenotipica utilizzando l'acquisizione di immagini e la proteomica.

Analisi fenotipica semi-automatizzata di colture cellulari sferoidi 3D funzionali

Qui, presentiamo un protocollo per produrre cocolture biostampate in 3D di neuroni e astrociti derivati da iPSC. Questo modello di cocoltura, generato all'interno di un'impalcatura di idrogel in formati a 96 o 384 pozzetti, dimostra un'elevata vitalità post-stampa e la crescita dei neuriti entro 7 giorni e mostra l'espressione di marcatori di maturità per entrambi i tipi di cellule.

Bioprinting tridimensionale di cocolture neurone-astrociti derivate da iPSC umane per applicazioni di screening

Questo protocollo mira a preservare i metaboliti cellulari per la spettrometria di massa a singola cellula (SCMS) combinando il lavaggio con soluzione salina volatile, l'estinzione rapida dell'azoto liquido, la liofilizzazione e lo stoccaggio a -8 °C. Dimostra che l'estinzione dell'azoto liquido è essenziale per mantenere i profili dei metaboliti, mentre la conservazione prolungata del freddo dovrebbe essere ridotta al minimo per prevenire alterazioni metaboliche.

Preparazione del campione per la spettrometria di massa a singola cellula Studi di metabolomica: lavaggio, tempra, essiccazione e conservazione combinati delle cellule

Questo protocollo descrive l'imaging di spettrometria di massa a singola cella delle celle OVCAR-8 utilizzando ionizzazione elettrospray a desorbo accoppiata a spettrometri di massa Orbitrap per analisi metabolomiche ad alta risoluzione spaziale.

Imaging con spettrometria di massa a singola cella utilizzando ionizzazione elettrospray da desorbiamento accortata agli spettrometri di massa Orbitrap

Impara la preparazione di colture cellulari 3D per imaging spettrometria di massa usando MALDI MSI. Questo protocollo consente di rilevare proteine, lipidi e metaboliti senza marcatura.

Campione strategie di preparazione per la Spettrometria di Massa Imaging di 3D Models Cultura cellulare

Esplora altri video