Adattamento umani videofluoroscopia Rondine metodi di studio per individuare e caratterizzare disfagia in modelli di malattia Murine

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la funzione di deglutizione nei roditori che si comportano liberamente, indicato prima come studio video fluoroscopico della deglutizione o VFSS. Una camera di alimentazione è costruita per confinare i roditori in un piccolo spazio durante i test. Il secondo passo consiste nell'eseguire il condizionamento comportamentale con una soluzione di test per garantire la massima partecipazione.

Il passo successivo è quello di condurre il test VFSS con i topi precondizionati. Infine, i video vengono sottoposti ad analisi fotogramma per fotogramma per quantificare i parametri di deglutizione. In definitiva, questo nuovo strumento di valutazione può essere utilizzato per rilevare e caratterizzare la disfagia in modelli di malattia speculari e fornire biomarcatori funzionali da utilizzare negli studi preclinici.

All'inizio abbiamo avuto l'idea di utilizzare le camere di osservazione perché i test VFSS sugli esseri umani sono volontari e senza restrizioni, e volevamo imitare da vicino la procedura clinica umana. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a metodi simili esistenti è che suscita rapidamente comportamenti alimentari volontari nei roditori per consentire test rapidi di tutte le fasi della deglutizione. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con l'analisi video perché i movimenti piccoli e rapidi della deglutizione e dei topi sono difficili da discernere.

Inizia assemblando le camere di osservazione, quindi assembla un sistema di erogazione della siringa per erogare la soluzione alle ciotole dei pioli durante il test. Una volta assemblata, posizionare la camera di osservazione su un sollevatore a forbice motorizzato per il posizionamento a distanza. Il vantaggio principale della piattaforma elevatrice a forbice telecomandata è una maggiore sicurezza dalle radiazioni per i ricercatori, pur mantenendo i roditori che si comportano liberamente nel campo visivo della fluoroscopia.

Preparare i topi abituandoli alla camera di osservazione e sottoponendoli a un periodo di regolazione dell'acqua durante la notte. Quando è pronto per il test, rimuovere la camera dalla gabbia e pulirla accuratamente. Utilizzare un pennarello cancellabile a secco per etichettare ogni tubo pulito prima di rimetterlo nella gabbia di casa.

Quindi, preparare la soluzione di iohexol aromatizzata al cioccolato per impostare l'ambiente di fluoroscopia. Utilizzare una camera di osservazione di riserva e una ciotola a pioli per determinare l'altezza e la posizione ottimali all'interno del fascio del fluoroscopio che consente la visualizzazione del consumo sul piano laterale. Impostare la frequenza dei fotogrammi della fluoroscopia su 30 fotogrammi al secondo.

Se disponibili, è possibile utilizzare frame rate più elevati. Assicurarsi che un marcatore di calibrazione radiopaco sia posizionato in modo appropriato sulla telecamera del fluoroscopio in modo che sia visibile sul monitor durante l'intero test. Questo passaggio è necessario per consentire la calibrazione delle misure di lunghezza per ridurre lo stress dovuto alla manipolazione.

Osservare la gabbia fino a quando un topo non entra liberamente nella camera di osservazione. Una volta entrato, sollevare la camera dalla gabbia e fissare delicatamente il secondo tappo terminale. Con test ripetuti, i topi possono essere facilmente persuasi a entrare nella camera quando viene posizionata di fronte a loro all'interno della gabbia o quando sono sospesi per la coda sopra l'apertura della camera.

Posizionare la camera di osservazione all'interno della macchina per fluoroscopia per iniziare il test VFSS sul piano laterale. Quindi, utilizzare un sistema di erogazione a siringa per riempire la ciotola del piolo con una soluzione di ioesolo aromatizzata al cioccolato. Avviare la registrazione della videofluoroscopia.

Quando il mouse inizia a bere durante il test, utilizzare la piattaforma elevatrice telecomandata per regolare la posizione della camera di osservazione in modo che il meccanismo di deglutizione sia visibile nel campo visivo. Metti in pausa la registrazione ogni volta che il mouse si allontana dalla ciotola del piolo per ridurre al minimo la durata dell'esposizione alle radiazioni. Riprendi la registrazione quando il mouse torna alla ciotola del piolo, riempi la ciotola del piolo secondo necessità.

L'obiettivo è quello di registrare diversi lunghi periodi di consumo continuo, che è tipico per la maggior parte dei topi. Entro i primi due minuti dal test, interrompere il test se il topo non beve entro cinque minuti, riportare i topi non conformi nella gabbia domestica per ripetere il test in un momento successivo lo stesso giorno. Non superare una regolazione dell'acqua di 24 ore.

Quando si testano più topi dalla stessa gabbia domestica. Pulisci la ciotola del piolo e il tubo con un tovagliolo di carta asciutto tra i topi. Tagliare la punta del tubo in PE secondo necessità.

Se masticato durante il test, pulire la camera di osservazione secondo necessità per rimuovere eventuali schizzi di ioesolo sulle pareti della camera. Sciacquare la camera con acqua di rubinetto e asciugarla con un tovagliolo di carta. Utilizzare un programma software di editing video che consenta l'analisi fotogramma per fotogramma delle registrazioni video in fluoroscopia.

Per quantificare i parametri di deglutizione di interesse, almeno due revisori addestrati dovrebbero analizzare ogni video in cieco. Il revisore principale visualizza ogni video per identificare e analizzare da tre a cinque lunghi periodi di bevute. Questo criterio si basa su studi non radiografici pubblicati sulla deglutizione che dimostrano che questo parametro è sufficiente per l'analisi statistica.

Il revisore secondario analizza quindi in modo indipendente le tre o cinque misure per parametro di deglutizione per ciascun topo che sono state inizialmente identificate e analizzate dal revisore primario. Le discrepanze dei revisori vengono quindi identificate per ciascun mouse e rianalizzate fino a raggiungere il 100% di consenso. I valori indiscussi per ogni parametro di deglutizione vengono quindi mediati per ottenere il valore medio per ogni topo.

Quando si ottengono meno di tre misure per un parametro di deglutizione, inserire un valore mancante nel database statistico per tale misura. Questi esempi sono stati ottenuti utilizzando una posizione del sistema di fluoroscopia a bassa energia. Uno consente la visualizzazione dell'intera testa e della regione toracica prossimale.

Il punto di innesco della deglutizione è centrato all'interno del campo visivo. La posizione due consente la visualizzazione dal punto di innesco della deglutizione alla giunzione gastroesofagea. Si noti che il bolo passa attraverso l'esofago distale anche con l'impostazione di ingrandimento più bassa.

Le strutture ossee della testa e del collo sono facilmente visibili utilizzando il sistema di fluoroscopia a bassa energia. Le strutture anatomiche vengono esaminate anche a un ingrandimento maggiore per consentire la quantificazione di diversi parametri aggiuntivi della deglutizione. Questa figura mostra risultati preliminari rappresentativi per due parametri di deglutizione VFSS, la velocità di deglutizione e la frequenza di deglutizione tra la deglutizione era significativamente più lenta per i topi SOD one rispetto all'età di C 57.

L'intervallo di deglutizione tra i topi e i controlli non era significativamente diverso tra i gruppi. Una volta padroneggiata, l'acquisizione video può essere completata in poco meno di due minuti per massa, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare la soluzione di prova al gusto di cioccolato entro poche ore dalla preparazione per evitare cambiamenti di viscosità e appetibilità che possono portare a comportamenti di evitamento.

Questa nuova tecnica sta aprendo la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare i comportamenti naturali di alimentazione e deglutizione in roditori sani e modelli di malattia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire con successo il test VFSS di roditori che si comportano liberamente Per quantificare i comportamenti alimentari tipici e la funzione di deglutizione, non dimenticare che lavorare con apparecchiature che emettono radiazioni può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni contro le radiazioni per tempo, distanza e schermatura devono essere sempre seguite durante l'esecuzione di questa procedura.