Adattamento umani videofluoroscopia Rondine metodi di studio per individuare e caratterizzare disfagia in modelli di malattia Murine
1 marzo 2015
Questo studio adattato con successo videofluoroscopia deglutizione studio (VFSS) metodi umani per l'utilizzo con modelli di malattia murini al fine di facilitare la ricerca traslazionale disfagia.
L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la funzione di deglutizione nei roditori che si comportano liberamente, indicato prima come studio video fluoroscopico della deglutizione o VFSS. Una camera di alimentazione è costruita per confinare i roditori in un piccolo spazio durante i test. Il secondo passo consiste nell'eseguire il condizionamento comportamentale con una soluzione di test per garantire la massima partecipazione.
Il passo successivo è quello di condurre il test VFSS con i topi precondizionati. Infine, i video vengono sottoposti ad analisi fotogramma per fotogramma per quantificare i parametri di deglutizione. In definitiva, questo nuovo strumento di valutazione può essere utilizzato per rilevare e caratterizzare la disfagia in modelli di malattia speculari e fornire biomarcatori funzionali da utilizzare negli studi preclinici.
All'inizio abbiamo avuto l'idea di utilizzare le camere di osservazione perché i test VFSS sugli esseri umani sono volontari e senza restrizioni, e volevamo imitare da vicino la procedura clinica umana. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a metodi simili esistenti è che suscita rapidamente comportamenti alimentari volontari nei roditori per consentire test rapidi di tutte le fasi della deglutizione. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con l'analisi video perché i movimenti piccoli e rapidi della deglutizione e dei topi sono difficili da discernere.
Inizia assemblando le camere di osservazione, quindi assembla un sistema di erogazione della siringa per erogare la soluzione alle ciotole dei pioli durante il test. Una volta assemblata, posizionare la camera di osservazione su un sollevatore a forbice motorizzato per il posizionamento a distanza. Il vantaggio principale della piattaforma elevatrice a forbice telecomandata è una maggiore sicurezza dalle radiazioni per i ricercatori, pur mantenendo i roditori che si comportano liberamente nel campo visivo della fluoroscopia.
Preparare i topi abituandoli alla camera di osservazione e sottoponendoli a un periodo di regolazione dell'acqua durante la notte. Quando è pronto per il test, rimuovere la camera dalla gabbia e pulirla accuratamente. Utilizzare un pennarello cancellabile a secco per etichettare ogni tubo pulito prima di rimetterlo nella gabbia di casa.
Quindi, preparare la soluzione di iohexol aromatizzata al cioccolato per impostare l'ambiente di fluoroscopia. Utilizzare una camera di osservazione di riserva e una ciotola a pioli per determinare l'altezza e la posizione ottimali all'interno del fascio del fluoroscopio che consente la visualizzazione del consumo sul piano laterale. Impostare la frequenza dei fotogrammi della fluoroscopia su 30 fotogrammi al secondo.
Se disponibili, è possibile utilizzare frame rate più elevati. Assicurarsi che un marcatore di calibrazione radiopaco sia posizionato in modo appropriato sulla telecamera del fluoroscopio in modo che sia visibile sul monitor durante l'intero test. Questo passaggio è necessario per consentire la calibrazione delle misure di lunghezza per ridurre lo stress dovuto alla manipolazione.
Osservare la gabbia fino a quando un topo non entra liberamente nella camera di osservazione. Una volta entrato, sollevare la camera dalla gabbia e fissare delicatamente il secondo tappo terminale. Con test ripetuti, i topi possono essere facilmente persuasi a entrare nella camera quando viene posizionata di fronte a loro all'interno della gabbia o quando sono sospesi per la coda sopra l'apertura della camera.
Posizionare la camera di osservazione all'interno della macchina per fluoroscopia per iniziare il test VFSS sul piano laterale. Quindi, utilizzare un sistema di erogazione a siringa per riempire la ciotola del piolo con una soluzione di ioesolo aromatizzata al cioccolato. Avviare la registrazione della videofluoroscopia.
Quando il mouse inizia a bere durante il test, utilizzare la piattaforma elevatrice telecomandata per regolare la posizione della camera di osservazione in modo che il meccanismo di deglutizione sia visibile nel campo visivo. Metti in pausa la registrazione ogni volta che il mouse si allontana dalla ciotola del piolo per ridurre al minimo la durata dell'esposizione alle radiazioni. Riprendi la registrazione quando il mouse torna alla ciotola del piolo, riempi la ciotola del piolo secondo necessità.
L'obiettivo è quello di registrare diversi lunghi periodi di consumo continuo, che è tipico per la maggior parte dei topi. Entro i primi due minuti dal test, interrompere il test se il topo non beve entro cinque minuti, riportare i topi non conformi nella gabbia domestica per ripetere il test in un momento successivo lo stesso giorno. Non superare una regolazione dell'acqua di 24 ore.
Quando si testano più topi dalla stessa gabbia domestica. Pulisci la ciotola del piolo e il tubo con un tovagliolo di carta asciutto tra i topi. Tagliare la punta del tubo in PE secondo necessità.
Se masticato durante il test, pulire la camera di osservazione secondo necessità per rimuovere eventuali schizzi di ioesolo sulle pareti della camera. Sciacquare la camera con acqua di rubinetto e asciugarla con un tovagliolo di carta. Utilizzare un programma software di editing video che consenta l'analisi fotogramma per fotogramma delle registrazioni video in fluoroscopia.
Per quantificare i parametri di deglutizione di interesse, almeno due revisori addestrati dovrebbero analizzare ogni video in cieco. Il revisore principale visualizza ogni video per identificare e analizzare da tre a cinque lunghi periodi di bevute. Questo criterio si basa su studi non radiografici pubblicati sulla deglutizione che dimostrano che questo parametro è sufficiente per l'analisi statistica.
Il revisore secondario analizza quindi in modo indipendente le tre o cinque misure per parametro di deglutizione per ciascun topo che sono state inizialmente identificate e analizzate dal revisore primario. Le discrepanze dei revisori vengono quindi identificate per ciascun mouse e rianalizzate fino a raggiungere il 100% di consenso. I valori indiscussi per ogni parametro di deglutizione vengono quindi mediati per ottenere il valore medio per ogni topo.
Quando si ottengono meno di tre misure per un parametro di deglutizione, inserire un valore mancante nel database statistico per tale misura. Questi esempi sono stati ottenuti utilizzando una posizione del sistema di fluoroscopia a bassa energia. Uno consente la visualizzazione dell'intera testa e della regione toracica prossimale.
Il punto di innesco della deglutizione è centrato all'interno del campo visivo. La posizione due consente la visualizzazione dal punto di innesco della deglutizione alla giunzione gastroesofagea. Si noti che il bolo passa attraverso l'esofago distale anche con l'impostazione di ingrandimento più bassa.
Le strutture ossee della testa e del collo sono facilmente visibili utilizzando il sistema di fluoroscopia a bassa energia. Le strutture anatomiche vengono esaminate anche a un ingrandimento maggiore per consentire la quantificazione di diversi parametri aggiuntivi della deglutizione. Questa figura mostra risultati preliminari rappresentativi per due parametri di deglutizione VFSS, la velocità di deglutizione e la frequenza di deglutizione tra la deglutizione era significativamente più lenta per i topi SOD one rispetto all'età di C 57.
L'intervallo di deglutizione tra i topi e i controlli non era significativamente diverso tra i gruppi. Una volta padroneggiata, l'acquisizione video può essere completata in poco meno di due minuti per massa, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare la soluzione di prova al gusto di cioccolato entro poche ore dalla preparazione per evitare cambiamenti di viscosità e appetibilità che possono portare a comportamenti di evitamento.
Questa nuova tecnica sta aprendo la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare i comportamenti naturali di alimentazione e deglutizione in roditori sani e modelli di malattia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire con successo il test VFSS di roditori che si comportano liberamente Per quantificare i comportamenti alimentari tipici e la funzione di deglutizione, non dimenticare che lavorare con apparecchiature che emettono radiazioni può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni contro le radiazioni per tempo, distanza e schermatura devono essere sempre seguite durante l'esecuzione di questa procedura.
Panoramica
Questo studio ha adattato con successo i metodi umani di studio della deglutizione mediante videofluoroscopia (VFSS) per l'uso con modelli murini di malattia, facilitando la ricerca traslazionale sulla disfagia. La procedura mira a valutare la funzione deglutitoria in roditori liberi di comportarsi naturalmente, imitando da vicino le pratiche cliniche umane.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Analisi Comportamentale
- Ricerca Translazionale
Sfondo
- La VFSS è un metodo standard per la valutazione della deglutizione nell'uomo.
- Questo studio mira a riprodurre le tecniche di VFSS in modelli rodentici.
- Il metodo consente l'osservazione di comportamenti alimentari volontari.
- Fornisce una piattaforma per rilevare la disfagia in modelli di malattia.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per lo studio della deglutizione nei roditori.
- Creare biomarcatori funzionali per prove precliniche.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi della disfagia nei modelli di malattia.
Metodi Utilizzati
- Costruzione di una camera di alimentazione per il confinamento dei roditori durante i test.
- Condizionamento comportamentale con una soluzione di prova per garantire la partecipazione.
- Analisi fotogramma per fotogramma dei video VFSS per quantificare i parametri della deglutizione.
- Utilizzo di un sollevatore a forbice telecomandato per migliorare la sicurezza radiologica.
Risultati principali
- Il metodo ha indotto con successo comportamenti alimentari volontari nei roditori.
- L'analisi quantitativa dei parametri della deglutizione è stata ottenuta mediante analisi video.
- Il consenso tra i revisori ha garantito una misurazione accurata dei parametri della deglutizione.
- La tecnica ha dimostrato un potenziale nell'identificare la disfagia in modelli murini.
Conclusioni
- Questa nuova adattamento della VFSS è efficace per lo studio della disfagia nei roditori.
- Il metodo fornisce uno strumento prezioso per la ricerca preclinica sulla disfagia.
- Studi futuri potranno basarsi su questo schema per esplorare la disfagia in vari contesti patologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'adattamento dei metodi umani dello studio videofluoroscopico della deglutizione (VFSS) a modelli murini consente la rilevazione precoce di fenotipi di disfagia in modelli preclinici di malattia, sostenendo la validazione degli obiettivi terapeutici e la riduzione del rischio meccanicistico nello sviluppo di farmaci per malattie neurodegenerative e neuromuscolari. Questo approccio fornisce biomarcatori funzionali che fungono da ponte tra saggi comportamentali e endpoint clinici, migliorando la capacità predittiva nelle decisioni relative all'identificazione dei composti promettenti e al passaggio alle fasi precliniche. Quantificando la fisiologia della deglutizione in roditori liberamente attivi, il metodo migliora la continuità traslazionale dalla fase di scoperta attraverso le fasi precliniche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche quantificando la fisiologia della deglutizione come parametro funzionale dell'integrità del tronco encefalico e dei circuiti neuromuscolari.
- Valore operativo: Permette il condizionamento comportamentale e l'alimentazione volontaria in spazi ristretti, riducendo la variabilità indotta dallo stress nella fenotipizzazione murina.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico di bersagli coinvolti nel controllo della deglutizione, come SOD1 nei modelli di SLA, collegando la manipolazione genetica a fenotipi misurabili di disfagia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi standardizzando la quantificazione dei parametri della deglutizione mediante analisi video fotogramma per fotogramma.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità del saggio attraverso un consenso tra due revisori in cieco e criteri definiti per l'assunzione di bevande.
- Valore scientifico: Evidenzia la prontezza per lo screening e la scalabilità consentendo test rapidi di più topi per sessione mediante posizionamento della camera a distanza.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Analizza la rilevanza della malattia e l'allineamento con biomarcatori traslazionali rilevando differenze specifiche del genotipo nella frequenza di deglutizione e nell'intervallo inter-deglutorio nei topi SOD1 rispetto ai controlli.
- Valore operativo: Descrive la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica fornendo parametri quantificabili di VFSS che si correlano con la progressione della malattia.
- Valore scientifico: Si concentra sul valore predittivo di riduzione del rischio identificando 13 parametri di deglutizione costantemente quantificabili mediante fluoroscopia a bassa energia, raddoppiando quasi la sensibilità di rilevamento rispetto ai sistemi ad alta energia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'Early Discovery all'Identificazione del Lead e ai lavori Preclinici, sostenendo la verifica delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi molecolari e la riduzione del rischio biologico dei bersagli che influenzano la funzione bulbare.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi biologici o la riduzione del rischio biologico quantificando la meccanica della deglutizione come indicatore della funzione dei circuiti neurali nei modelli di malattia.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio, la riproducibilità o le uscite quantitative quando supportate dall'articolo attraverso protocolli standardizzati, analisi in cieco e misurazione dei parametri basata sul consenso.
- Analisi: Evidenzia le misurazioni, i risultati o le uscite statistiche che aiutano i gruppi a confrontare diverse condizioni, inclusi la frequenza di deglutizione, l'intervallo inter-deglutorio e i tempi di transito del bolo derivati dall'analisi frame per frame dei video VFSS.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica o all'allineamento con biomarcatori solo quando la fonte lo supporta dimostrando differenze dipendenti dal genotipo nella fisiologia della deglutizione che rispecchiano gli endpoint clinici della disfagia.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, grazie a un design standardizzato della camera, protocolli per agenti di contrasto aromatizzati e un sistema di imaging controllato a distanza.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi terapeutici e riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei fenotipi mediati dal tronco encefalico.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della caratterizzazione del deglutire in coorti murine e tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, maggiore efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate, grazie all'individuazione precoce della disfagia nei percorsi preclinici.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su dati di biomarcatori funzionali ottenuti mediante VFSS in modelli di malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste nei test neurocomportamentali, nell'uso della fluoroscopia video e nell'analisi frame per frame dei video.
- Le esigenze relative a strumentazione e infrastrutture analitiche includono sistemi fluoroscopici (preferibilmente a bassa energia per immagini murine ad alta risoluzione), tavoli posizionabili a controllo remoto e software di editing video per revisioni in cieco.
- I requisiti di standardizzazione tra gruppi prevedono l'armonizzazione della progettazione della camera, della preparazione dell'agente di contrasto (ad esempio iohexol al sapore di cioccolato) e dei criteri di selezione degli episodi di assunzione orale tra diversi siti.
- Le considerazioni adattative tra diversi sistemi modello includono la regolazione delle dimensioni della camera, della gradibilità dell'agente di contrasto e dei protocolli posizionali per diverse ceppi di roditori e gravità delle malattie.
- I limiti pratici supportati dalla letteratura includono la dipendenza dal livello di energia del fluoroscopio per la rilevabilità dei parametri, con sistemi ad alta energia che permettono la quantificazione di sette parametri rispetto ai tredici ottenibili con sistemi a bassa energia.
