Name: Real-time Elettrofisiologia: utilizzando protocolli a circuito chiuso per sonda neuronali Dynamics and Beyond (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Impara la tecnica di dynamic clamp in vitro su neuroni corticali utilizzando il software LCG. Questo metodo automatizza i protocolli elettrofisiologici per caratterizzare le cellule piramidali e simulare eventi sinaptici eccitatori e inibitori.

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Sostegno finanziario da parte della Flanders Research Foundation FWO (contratto n. 12C9112N a DL), del 7° Programma Quadro della Commissione Europea (Rete Marie Curie "C7", contratto n. 238214; Si ringrazia il progetto ICT Future Emerging Technology "ENLIGHTENMENT", contratto n. 306502), il programma Interuniversity Attraction Poles avviato dall'Ufficio belga per le politiche scientifiche (contratto n. IUAP-VII/20) e l'Università di Anversa.

Il protocollo qui descritto è conforme con le raccomandazioni e le linee guida del Comitato Etico del Dipartimento di Scienze Biomediche dell&#39;Università di Anversa. Questo protocollo richiede la preparazione di materiale non senziente dal cervello espiantato di giovani ratti Wistar, ottenuto con tecniche di eutanasia umane approvati. 1. apparecchiature Preparazione <ol><li> Installare e configurare l&#39;acquisizione dei dati e del sistema di stimolazione. <ol><li> Utilizzare un personal computer (PC) dotato di acquisizione dati (DAQ) scheda supportata dal Comedi per registrare i segnali e inviare tensioni di controllo analogici all&#39;amplificatore elettrofisiologico. NOTA: Comedi un modulo su Linux e la biblioteca che supporta una moltitudine di schede DAQ dai produttori più comuni: visita http://www.comedi.org per ulteriori informazioni. </li><li> In caso di un patch clamp amplificatore controllato da computer è in uso, impiegare un secondo PC oltre a quello dedicato all&#39;amplificatorecontrollo. NOTA: Mentre quest&#39;ultimo può eseguire un sistema operativo convenzionale, il PC supplementare sarà operativo in tempo reale per mezzo di un sistema operativo speciale. In queste condizioni, è conveniente utilizzare un unico monitor, mouse e tastiera collegata al PC supplementare, mentre il collegamento mediante un&#39;applicazione desktop remoto al PC dedicato. </li><li> Scaricare l&#39;immagine ISO del Live CD che contiene un sistema operativo Linux real-time con LCG preinstallato da http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso e masterizzarlo su un disco CD o chiavetta USB &quot; . </li><li> È sufficiente inserire il CD nel lettore del PC contenente la scheda DAQ e avviarlo. In alternativa, installare LCG dalla repository fonte online su un PC con il sistema operativo Linux (ad esempio, Debian o Ubuntu). Consultare il manuale on-line per i dettagli sulla procedura di installazione. Il manuale è disponibile online all&#39;indirizzo http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf. </li><li> Boot da CD live: this caricherà automaticamente un sistema completamente configurato. Per fare questo, inserire il Live CD LCG nel drive CD-ROM del computer e avviare il sistema da CD; selezionare il kernel in tempo reale (opzione di default) non appena viene visualizzato il menu di avvio e attendere che il sistema di inizializzazione. </li><li> Calibrare la scheda DAQ digitando al prompt dei comandi: sudo comedi_calibrate o sudo comedi_soft_calibrate a seconda che il bordo di acquisizione dati supporta hardware o software di calibrazione, rispettivamente (utilizzare il comando sudo comedi_board_info per ottenere informazioni sulla scheda). </li><li> Impostare analogico-digitale e digitale-analogici fattori di conversione appropriato: questo richiede avere accesso al manuale dell&#39;amplificatore elettrofisiologico cellulare, e in particolare alle sue specifiche sui suoi fattori di conversione. </li><li> Utilizzare un editor di testo per specificare i valori numerici appropriati nel file /home/user/.lcg-env, per le variabili di ambiente AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC. NOTA: Questi rappresentano l&#39;ingresso (AI) e di uscita (AO) guadagni per pinza (CC) e morsetto di tensione (VC) le modalità ed i fattori di conversione tra i comandi di tensione forniti dal computer e l&#39;attuale o tensioni generata dall&#39;amplificatore rispettivamente. </li><li> In alternativa, utilizzare lo script fornito LCG (LCG-trovare-conversione-fattori), per trovare i fattori di conversione del proprio sistema. NOTA: I valori calcolati da LCG-trovare-conversione-fattori sono ipotesi, che in alcuni casi sono necessarie per essere numericamente troncati o arrotondati per riflettere i valori esatti dei fattori di conversione. </li><li> Per utilizzare LCG-trovare-conversione-fattori, avviare collegando la &#39;cella modello&#39; che spesso viene acquistato con l&#39;amplificatore al corrispondente headstage. Quindi, aprire un terminale sulla macchina Linux in cui si esegue il CD Live e scrivete il seguente comando al prompt della shell: lcg-trovare-conversione-fattori -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env NOTA: In entrambi i casi (ad esempio, la modifica manuale del /home/user/.lcg-env o l&#39;utilizzo di LCG-trovare-conversione-fattori), chiudere e aprire il terminale per le modifiche abbiano effetto. </li><li> Se si utilizzano più headstages, impostare i fattori di conversione agli stessi valori in tutti i canali; se ciò non fosse possibile, consultare il manuale online LCG per capire come utilizzare più fattori di conversione in LCG-stimolo o come produrre i file di configurazione che si adattano meglio le esigenze dell&#39;utente. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di acuta cerebrale porzioni dal corteccia somatosensoriale <ol><li> Preparazione di soluzioni per elettrofisiologia. <ol><li> Preparare fluido cerebrospinale artificiale (ACSF) mescolando (in mM) 125 NaCl, KCl 2,5, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 25 glucosio, 2 CaCl 2, 1 e MgCl 2. Preparare 10x soluzioni madre per ridurre latempo di preparazione nel giorno dell&#39;esperimento. Preparare 2 L, di cui uno sarà usato per la preparazione delle fette e l&#39;altra per la registrazione. </li><li> Saturare il ACSF con 95% O 2 e 5% CO 2 per almeno 30 minuti prima dell&#39;inizio della procedura. </li><li> Per le registrazioni corrente con la pinza, utilizzare una soluzione intracellulare (ICS) contenente (in mm) 115 K-gluconato, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Preparare la soluzione in ghiaccio e filtrarla prima dell&#39;inizio delle registrazioni per eliminare il rischio di intasamento della pipetta. </li></ol></li><li> L&#39;estrazione del cervello. <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale ponendo l&#39;animale in una camera di induzione con 4% isoflurano e rapidamente decapitarlo usando una ghigliottina o grandi forbici. </li><li> Tagliare la pelle lungo la linea mediana e farlo scorrere per le orecchie. </li><li> Utilizzando un bel paio di forbici tagliare cranio lungo la linea mediana. Mantenere la lama il più vicino possibile the superficie in modo da minimizzare i danni al cervello sottostante. Aprire il cranio con un paio di pinzette, utilizzare una spatola per tagliare il nervo ottico e il tronco encefalico e delicatamente cadere il cervello in ACSF ghiacciata. </li><li> Separare il cervelletto e le due emisferi con un bisturi (lama 24). </li><li> Rimuovere l&#39;acqua in eccesso da uno dei due emisferi e la colla su una piattaforma inclinata con una goccia di colla. Aggiungere rapidamente alcune gocce di ACSF il cervello e trasferirlo alla camera vibratome. NOTA: Quando si prepara fette sagittali, l&#39;angolo della piattaforma è importante per evitare di danneggiare i dendriti delle cellule piramidali durante la procedura di taglio. </li></ol></li><li> Preparazione delle fette. <ol><li> Posizionare la lama sopra il cervello ed eliminare i primi 2,5-3 mm. Regolare la velocità e la frequenza di limitare i danni alla superficie della fetta, mentre allo stesso tempo minimizzando il tempo richiesto per la procedura di taglio. </li><li> Impostare lo spessore di 300 μm e iniziare affettare. Una volta che la lama ha oltrepassato la corteccia, utilizzare una lama di rasoio o con un ago piegato tagliare sopra l&#39;ippocampo e ai bordi dell&#39;area corticale di interesse. </li><li> Mettere le fette in una camera di incubazione più ben tenute a 32-34 ° C. </li><li> Ritrarre la lama e ripetere i punti 2.3.2 e 2.3.3 fino a 5-8 fette sono tagliate. I migliori fette di solito sono quelli in cui i vasi sanguigni sono parallele alla superficie. </li><li> Incubare le fette per 30 minuti dopo l&#39;ultima fetta viene posto nella camera. </li></ol></li></ol> 3. patch-clamp registrazioni da Layer 5 piramidali neuroni <ol><li> Mettere una fetta nella camera di registrazione e la ricerca di cellule sane. Queste cellule hanno solitamente minore contrasto, un aspetto liscio e non sono gonfiate. </li><li> Controllare la fetta al microscopio con lente di ingrandimento 40X e la ricerca di cellule in strato 5, situato a circa 600 a 1000 micron dalla superficie del cervello. </li&gt; <li> Una volta che un cellulare adeguata viene trovato, carico un terzo del micropipetta con ICS e inserirlo nella headstage. </li><li> Sul personal computer che esegue il live CD o il sistema operativo pre-configurato Linux, avviare una shell di comando (per esempio, bash), e al suo prompt il comando LCG-zero. Questo assicura che la scheda DAQ non guida l&#39;amplificatore. </li><li> Applicare 30 - 50 mbar di pressione positiva premendo sul pistone di una siringa comune, connesso con un tubo al titolare pipetta e, con l&#39;aiuto del microscopio, posizionare la pipetta circa 100 micron sopra la fetta. NOTA: Posizionare la pipetta in una posizione che consente un percorso diretto alla cella di destinazione, preferibilmente utilizzando la modalità di approccio micromanipolatore. </li><li> Agendo sui comandi dell&#39;amplificatore elettrofisiologia, regolare la pipetta offset e uscita un impulso di prova (10 mV) in modalità voltage clamp. </li><li> Ridurre la pressione a 10 - 30 mbar (a seconda delle dimensioni pipetta) ritirando ilpistone della siringa; avvicinare delicatamente la cella e controllare la formazione di una fossetta osservando l&#39;immagine sul monitor telecamera. Monitorare l&#39;impulso di prova per un aumento di resistenza in ogni momento, osservando la forma d&#39;onda corrente visualizzata sull&#39;oscilloscopio collegato all&#39;amplificatore elettrofisiologia (in alternativa è possibile utilizzare il LCG-seal-test comando per monitorare la resistenza pipetta). </li><li> Rilasciare la pressione e, se necessario applicare una leggera pressione negativa alla pipetta per aiutare la formazione della guarnizione quando si nota un aumento della resistenza pipetta e la formazione di un &#39;fossetta&#39; sulla cella. </li><li> Mentre le forme di tenuta, gradualmente diminuire il potenziale tenendo a -70 mV. </li><li> Una volta ottenuto un sigillo gigaohm, assicurarsi che la corrente di mantenimento è compresa tra 0 - 30 pA. Applicare brevi impulsi di pressione negativa (aspirazione) per rompere la membrana e stabilire la cellula intera configurazione. In alternativa, è possibile iniettare impulsi forti e brevi di tensione ( <em&gt; cioè, utilizzando il comando &#39;ZAP&#39; sull&#39;amplificatore o tiene la cella molto negativo) alla rottura della membrana, a seconda della preparazione e pipetta di vetro usato. </li><li> Passare alla modalità pinza e verificare che il potenziale di membrana è tipico di una cellula sana. Per neuroni piramidali corticali utilizzando una soluzione basata su potassio gluconato, questo valore è di solito tra -65 e -75 mV. </li></ol> 4. Caratterizzazione semiautomatica delle Proprietà risposta elettrica di un neurone <ol><li> Creare una directory per memorizzare i dati dell&#39;utente. Per fare questo l&#39;impiego di uno script incluso nel LCG live CD che crea cartelle in base alla data. Per usarlo, digitare al prompt dei comandi cd ~ / esperimenti LCG-creare-esperimento-folder -s psp, in_vivo_like Questo creerà una cartella in cui verranno salvati i dati per tale cella (e un &#39;psp&#39; e &#39;in_vivo_like&#39; sottocartelle) e si stamperà il suo nome al terminalefinestra; è anche possibile memorizzare informazioni aggiuntive quali la resistenza pipetta e tipo cellulare utilizzando questo script. </li><li> Cambiare la directory nella cartella appena creata utilizzando il comando cd ~ / &lt;nomecartella&gt; Il nome della cartella è quella visualizzata dal comando LCG-creare-esperimento-cartella e avrà il timestamp del giorno corrente (cioè, anno-mese-giorno), come in 20140331A01. </li><li> Assicurarsi che l&#39;amplificatore è impostato per operare in modalità pinza, che i cavi siano collegati e il comando di tensione esterna dell&#39;amplificatore, se presente, è abilitato. </li><li> Digitare il comando LCG-ecodeat prompt dei comandi. Ciò richiede una serie di comandi (cioè LCG-ap, LCG-vi, LCG-ramp, LCG-tau e LCG-gradini), usato per caratterizzare le proprietà di risposta di base della cellula. LCG-ecode richiede che l&#39;utente specifica due parametri: l&#39;ampiezza del 1 ms lungo impulso di corrente utilizzato per sollecitare un singolo picco nella cella, e l&#39;ampiezza massima della memoria RAM attualep iniettata nella cellula per trovare la sua reobase. Utilizzare la seguente sintassi dei comandi: LCG-ecode --pulse ampiezza X --ramp ampiezza Y con una scelta dei valori X e Y (in pA) che sono sufficienti per il fuoco cellulare in risposta ad un 1 ms impulso lungo e un&#39;iniezione di corrente costante, rispettivamente. NOTA: Questi protocolli richiedono di eseguire la stima numerica del &#39;elettrodo kernel&#39; per utilizzare Active elettrodo di compensazione (AEC) 15. Una iniezione di corrente rumorosa viene utilizzato per stimare il kernel e all&#39;utente viene richiesto di confermare il numero di campioni che compongono il kernel. Vedere 15 per informazioni dettagliate sul significato del kernel dell&#39;elettrodo e come scegliere il numero di campioni del kernel. </li></ol> 5. L&#39;iniezione di conduttanza attraverso simulate Sinapsi e Simulazione di In Vivo -come Background Attività <ol><li> Iniezione di simulati eccitatori potenziali post-sinaptici <ol><li>Passare alla directory in cui si desidera salvare il prossimo esperimento, digitando il seguente comando al prompt dei comandi della shell: cd psp / 01 </li><li> Copiare un file di configurazione LCG nella directory corrente e aprirlo con un editor di testo (Nano in questo esempio) digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell (questo file di configurazione di esempio è incluso nel codice sorgente e il cd live) : cp ~ / local / src / LCG / configurazioni / epsp.xml nano epsp.xml NOTA: Questo è semplicemente un file di testo con diverse entità collegate tra loro. Per maggiori dettagli si veda la sezione risultati rappresentativi. </li><li> Se necessario, modificare il inputChannel, outputChannel, il inputConversionFactor e outputConversionFactor in questo file in modo che corrisponda la configurazione dell&#39;utente. </li><li> Calcolare il kernel elettrodo necessaria per effettuare la compensazione elettrodo attivo &#39;il metodo utilizzato da LCG effettuare elettrodo singolo morsetto dinamico&#39; eseguendo il command LCG-kernel Ciò richiederà il numero di punti nel kernel. Ancora una volta, selezionare un numero in modo che il kernel dell&#39;elettrodo copre l&#39;estremità della coda di decadimento esponenziale. </li><li> Eseguire l&#39;esperimento morsetto dinamico usando il comando LCG-esperimento epsp.xml -c </li><li> Elencare i file e visualizzare i risultati utilizzando il comando ls -l LCG-plot--f file scorso </li></ol></li><li> Iniezione di simulati inibitori potenziali post-sinaptici <ol><li> Creare una cartella e copiare il file epsp.xml per digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell: mkdir ../02 cp epsp.xml ../02/ipsp.xml cd ../02 </li><li> Modificare il file di configurazione utilizzando un editor di testo: cambiare il potenziale di inversione sinaptica e salire e tempo di decadimento costanti del Exp2Synapse modello di sinapsi al seguente: parametri&gt; &lt;E&gt; -80 &lt;/ E&gt; &lt;TauRise&gt; 0.8e-3 &lt;/ tauRise&gt; &lt;TauDecay&gt; 10e-3 &lt;/ tauDecay&gt; &lt;parametri&gt; Chiudere l&#39;editor di testo. </li><li> Calcola il kernel elettrodi ed eseguire l&#39;esperimento, come in 5.1, digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell: LCG-kernel LCG-esperimento ipsp.xml -c </li><li> Elencare i file e visualizzare i risultati, digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell: ls -l LCG-plot--f file &lt;filename.h5&gt; </li></ol></li><li> Simulazione in vivo -come attività di fondo: <ol><li> Passare alla directory in cui si desidera salvare il seguente esperimento, come precedentemente indicato, digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell: cd ../../in_vivo_like/01 </li><li> Copiare il file di configurazione dalla directory di origine LCG, digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell: cp ~ / local / src / LCG / configurazioni / in_vivo_like.xml nano in_vivo_like.xml <br /&gt; Nota: Questo file è semplicemente la concatenazione dei precedenti; due processi Poisson punti che generano treni di impulsi, che a loro volta alimentano sinapsi inibitorie ed eccitatorie modello, generano l&#39;attività di fondo. </li><li> Regolare i parametri di configurazione DAQ per il setup degli utenti, come descritto in 5.1.3 e uscire dall&#39;editor. </li><li> Calcola il kernel elettrodi ed eseguire l&#39;esperimento, come in 5.1, digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell: LCG-kernel LCG-esperimento in_vivo_like.xml -c -n 10 -i 3 I &#39;-n 10&#39; e &#39;-i 3&#39; interruttori indicano che la stimolazione deve essere ripetuta 10 volte ad intervalli di tre secondi. </li><li> Visualizzare le tracce prime utilizzando il seguente comando al prompt dei comandi della shell: LCG-plot--f file tutto </li></ol></li></ol>

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<li>Gold, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGold%2C+R+%22The+Axon+Guide+for+Electrophysiolog.%2C+%26+Biophysics+Laboratory+Techniques..%22">The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques..</a>. , (2007).</li>
<li>Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+spike+timing+in+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reliability of spike timing in neocortical neurons.</a> Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).</li>
<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+threshold+of+hippocampal+pyramidal+cells+in+vivo+is+increased+by+recent+spiking+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity.</a> Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).</li>
<li>Koch, C., Segev, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoch%2C+C+%22Methods+in+Neuronal+Modeling%3A+From+Synapses+to+Networks%22">Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks</a>. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).</li>
<li>Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disynaptic+inhibition+between+neocortical+pyramidal+cells+mediated+by+Martinotti+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells.</a> Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).</li>
<li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+bursts+self-inhibit+and+correlate+the+pyramidal+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network.</a> PLoS biology. 8 (9), (2010).</li>
<li>Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+networks+with+dynamic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+computation%22%5BJournal%5D)">Neural networks with dynamic synapses.</a> Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo testo un protocollo completo per la realizzazione di tempo reale, ad anello chiuso monocellulari esperimenti elettrofisiologici è stata descritta, con la tecnica patch clamp e strumenti software recentemente sviluppato chiamato LCG. Per ottimizzare la qualità delle registrazioni è fondamentale che il sistema di registrazione sia correttamente messa a terra, schermato e vibrazioni: questo garantisce l&#39;accesso stabile e duratura whole-cell alla cella, che, insieme con la possibilità di automatizzare intere s...

<html> Negli ultimi anni, elettrofisiologia cellulare è evoluto dal paradigma tradizionale anello aperto impiegata in esperimenti di tensione e corrente clamp protocolli a circuito chiuso moderni. La tecnica a circuito chiuso più noto è forse il morsetto dinamica 6,7, che ha permesso l&#39;iniezione sintetica dei canali ionici artificiali voltaggio-dipendenti per determinare il potenziale di membrana neuronale 8, lo studio approfondito degli effetti della non-deterministico sfarfallio on canali ionici sulla dinamica di risposta neuronale 9, così come la ricreazione in vitro di realistico in vivo- come attività di fondo sinaptica 10. Altri paradigmi a circuito chiuso che sono stati proposti includono il morsetto reattiva 11, per studiare in vitro la produzione di attività persistente di auto-sostenuta, e la risposta serrare 4,12, per studiare i meccanismi cellulari alla base eccitabilità neuronale. ontent &quot;&gt; Qui si descrive un quadro potente che permette l&#39;applicazione di una serie di anello chiuso protocolli elettrofisiologici nel contesto di cellule intere registrazioni di patch clamp effettuate in fettine di cervello acuto. Mostriamo come registrare potenziale di membrana somatica mediante registrazioni di patch clamp in neuroni piramidali della corteccia somatosensoriale di ratti giovani e di applicare tre diversi protocolli a circuito chiuso con LCG, un software toolbox basato su riga di comando sviluppato nel laboratorio di Neurobiologia e Teorica Neuroengineering. Brevemente, i protocolli descritti sono, in primo luogo l&#39;iniezione automatica di una serie di forme d&#39;onda di corrente morsetto stimolo, rilevanti per la caratterizzazione di un grande insieme di proprietà di membrana attiva e passiva. Questi sono stati suggeriti per catturare il fenotipo elettrofisiologico di una cella in termini di proprietà di risposta ad una serie di forme d&#39;onda stereotipata stimolo. Conosciuta come la e-codice di un cellulare (ad esempio, vedere &amp; #160; 13,14), una raccolta di risposte elettriche è utilizzato da diversi laboratori di classificare oggettivamente neuroni sulla base delle loro proprietà elettriche. Questo include l&#39;analisi del rapporto di trasferimento ingresso-uscita stazionario (curva fI), con una tecnica innovativa che coinvolge il circuito chiuso, controllo in tempo reale della frequenza di scarica attraverso un (PID) regolatore proporzionale-integrale-derivativo , secondo la ricreazione realistica in vivo -come sfondo sinaptica in preparati in vitro 10 e, terzo collegamento artificiale in tempo reale dei due neuroni piramidali registrati simultaneamente mediante un interneuroni GABAergico virtuale, che viene simulato dal computer. Inoltre, LCG implementa la tecnica nota come attivo elettrodo di compensazione (AEC) 15, che consente di implementare protocolli clamp dinamico utilizzando un singolo elettrodo. Questo consente di compensare gli effetti indesiderati (unrtifacts) dell&#39;elettrodo di registrazione che sorgono quando viene utilizzato per la distribuzione di stimoli intracellulari. Il metodo si basa su una stima non parametrica delle proprietà elettriche equivalenti del circuito di registrazione. Le tecniche e protocolli sperimentali descritti nel presente documento possono essere facilmente applicati in convenzionale tensione a circuito aperto e gli esperimenti clamp attuali e possono essere estesi ad altri preparati, come extracellulare 4,16 o registrazioni intracellulari in vivo 17,18. L&#39;attento assemblaggio del setup per patch clamp cellula intera elettrofisiologia è un passo molto importante per la stabilità, registrazioni di alta qualità. Nel seguito si assume che un tale apparato sperimentale è già disponibile per lo sperimentatore, e focalizziamo la nostra attenzione sulla descrizione dell&#39;utilizzo di LCG. Il lettore è puntato a 19-22 per ulteriori suggerimenti circa l&#39;ottimizzazione e il debugging.

<table><tbody><tr><td>Affettatrice per tessuti</td><td>Leica</td><td>VT-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per pipette</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>WPI</td><td>1B150F-4</td><td>1,5/0,84 mm OD/ID, con filamento</td></tr><tr><td>Tabella di isolamento dalle vibrazioni</td><td>Microscopio serie</td><td></td>TMC <td>20</td></tr><tr><td>Leica</td><td></td><td>DMLFS</td><td>40X Manipolatori con obiettivo a immersione</td></tr><tr><td></td><td>Scientifica</td><td>Amplificatori PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Axon</td><td>Instruments</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Scheda di acquisizione dati</td> controllata da computer <td>National Instruments</td><td>PCI-6229</td><td>Supportato da Comedi Linux Driver</td></tr><tr><td>Computer desktop</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010 Tower</td><td>Sistema operativo: oscilloscopi Linux in tempo reale</td></tr><tr><td>Tektronix</td><td></td><td>TDS-1002</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Pompa</td><td>Gibson</td><td>MINIPULS3</td><td>Utilizzato con la testa della pompa R4 (F117606)Regolatore</td></tr> di <tr><td>temperatura</td><td>Sistemi multicanale</td><td>TC02</td><td>PH01 Cannula di perfusione</td></tr><tr><td>Manometro</td><td>Testo</td><td>510</td><td>Incubatore opzionale</td></tr><tr><td></td><td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>ACSF, ICS</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>K-gluconato</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td>ICS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Na2-Fosfocreatina</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td>ICS</td></tr></tbody></table>

real-time elettrofisiologia: utilizzando protocolli a circuito chiuso per sonda neuronali dynamics and beyond

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Neuroscienza sperimentale è testimone un crescente interesse per lo sviluppo e l&#39;applicazione di nuove e, protocolli a circuito chiuso spesso complessi, in cui lo stimolo applicato dipende in tempo reale sulla risposta del sistema. Recenti applicazioni vanno dalla realizzazione di sistemi di realtà virtuale per lo studio di risposte motorie, sia in topi 1 e in zebrafish 2, per il controllo delle crisi epilettiche seguenti ictus corticale utilizzando optogenetics 3. Uno dei principali vantaggi di tecniche anello chiuso risiede nella capacità di sondare superiori proprietà dimensionali che non sono direttamente accessibili o che dipendono da più variabili, quali eccitabilità neuronale 4 e affidabilità, mentre allo stesso tempo, massimizzando il sperimentale. In questo contributo e nel contesto di elettrofisiologia cellulare, descriviamo come applicare una varietà di protocolli a circuito chiuso per lo studio delle proprietà di risposta di piramidale neuroni corticali, recorded intracellulare con la tecnica del patch clamp in fettine di cervello acuto dalla corteccia somatosensoriale di ratti giovani. Poiché nessun source disponibile in commercio o aperto fornisce tutte le caratteristiche richieste per l&#39;esecuzione in modo efficiente gli esperimenti descritti qui, un nuovo toolbox software chiamato LCG 5 è stato sviluppato, la cui struttura modulare massimizza il riutilizzo del codice informatico e facilita l&#39;implementazione di nuovi paradigmi sperimentali. Le forme d&#39;onda di stimolazione vengono specificati utilizzando un compatto meta-descrizione e protocolli sperimentali complete sono descritte nei file di configurazione basati su testo. Inoltre, LCG ha una interfaccia a riga di comando che è adatto per la ripetizione delle prove e l&#39;automazione di protocolli sperimentali.

Nelle sezioni precedenti, abbiamo descritto come utilizzare il software LCG casella degli strumenti per caratterizzare le proprietà elettrofisiologiche delle cellule piramidali L5 e di ricreare in vivo -come attività sinaptica in un preparato fetta. L&#39;uso di una riga di comando e protocollo semi-automatizzato favorire la riproducibilità e l&#39;efficienza di questo esperimento, che può avere un forte impatto sul rendimento e la qualità dei dati prodotti. Inoltre, poiché i dati vengono salvati in modo coeren...

I protocolli a circuito chiuso stanno diventando sempre più diffusi nell'elettrofisiologia moderna. Presentiamo un modo semplice, versatile ed economico per eseguire protocolli elettrofisiologici complessi in neuroni piramidali corticali in vitro, utilizzando un computer desktop e una scheda di acquisizione digitale.

Real-time Elettrofisiologia: utilizzando protocolli a circuito chiuso per sonda neuronali Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è eseguire una tecnica di "clamp dinamico in vitro" su neuroni corticali utilizzando il pacchetto software liberamente disponibile LCG. Questo obiettivo viene raggiunto preparando sezioni del cervello della corteccia somatosensoriale del ratto per effettuare registrazioni mediante "patch clamp" sulle cellule parametrali. Come secondo passaggio, viene applicata una serie di protocolli elettrofisiologici automatizzati alla cellula registrata, ottenendo una caratterizzazione standard della cellula che risulterà utile per analisi successive e confronti tra diversi tipi cellulari.Successivamente, viene simulata l'iniezione di eventi sinaptici eccitatori e inibitori. Al fine di ricreare lo stato di alta conduttanza sperimentato dai neuroni della neocorteccia in vivo, i risultati mostrano come l'iniezione sinaptica di fondo moduli il guadagno delle cellule corticali. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è la possibilità di integrare registrazioni sperimentali in flussi di lavoro più complessi, utilizzando, ad esempio, il risultato di un protocollo sperimentale come ingresso per un altro protocollo.Questo metodo può contribuire a standardizzare i protocolli elettrofisiologici, accelerare l'analisi dei dati e aprire la strada alla condivisione dei dati tra laboratori. Sebbene questo metodo sia stato inizialmente sviluppato per registrazioni patch-clamp in vitro su larga scala, può essere utilizzato convenientemente anche per altre preparazioni sperimentali e protocolli, come registrazioni patch-clamp in vivo o registrazioni con microarray. Dopo aver estratto il cervello del ratto, scartare il cervelletto e separare i due emisferi lungo la linea mediana utilizzando un bisturi, rimuovere il liquido in eccesso da uno degli emisferi e incollarlo su una piattaforma inclinata con una goccia di colla cianoacrilica.Quindi aggiungere rapidamente alcune gocce di un CSF sul cervello e trasferirlo nella camera Vibram. Rimuovere i primi 2,5-3 millimetri di tessuto cerebrale con una lama. Successivamente, regolare la velocità e la frequenza di taglio per limitare i danni alla superficie della sezione.Successivamente, impostare lo spessore a 300 micrometri e iniziare a tagliare. Una volta che la lama ha superato la corteccia, utilizzare una lametta o un ago piegato per effettuare un taglio al di sopra dell'ippocampo e ai margini dell'area corticale di interesse. Dopodiché, trasferire le sezioni in una camera di incubazione multi-pozzetto a 36 gradi Celsius.In questa procedura, posizionare una sezione nella camera di registrazione con l'obiettivo a 40x. Cercare cellule sane nello strato cinque tra 600 e 1000 micrometri sotto la superficie del cervello. Queste cellule di solito presentano un contrasto ridotto, un aspetto liscio e non sono gonfie.Una volta individuata una cellula sana, caricare un terzo della micropipetta con soluzione intracellulare. Successivamente, posizionarla nella testata in un sistema operativo Linux preconfigurato. Lanciare un comando.Shell aggiunge il suo prompt. Digitare questo comando per assicurarsi che la scheda di acquisizione dati non stia pilotando l'amplificatore. Quindi applicare una pressione positiva compresa tra 30 e 50 millibar premendo il pistone della siringa, che è collegata al supporto per pipetta.Successivamente, posizionare la pipetta a circa 100 micrometri sopra la sezione e spostare la pipetta verso la cellula bersaglio utilizzando la modalità di avvicinamento del micromanipolatore. Dopodiché, regolare l'offset della pipetta sull'amplificatore di elettrofisiologia ed emettere un impulso di prova di 10 millivolt in modalità clamp di tensione. Utilizzare il comando LCG SEAL test per monitorare la resistenza della pipetta, quindi ridurre la pressione a 10-30 millibar ritirando il pistone della siringa.Avvicinarsi delicatamente alla cellula e verificare la formazione di una fossetta osservando l'immagine sul monitor della telecamera. Allo stesso tempo, monitorare l'aumento della resistenza indotto dal potenziale di prova osservando l'andamento della corrente visualizzato sul monitor. Quando si verifica un aumento della resistenza della pipetta e la formazione di una fossetta sulla cellula, rilasciare immediatamente la pressione ed applicare una leggera pressione negativa alla pipetta per favorire la formazione del sigillo.Nel frattempo, ridurre gradualmente il potenziale di clamping a meno 70 millivolt. Applicare una leggera aspirazione per rompere la membrana cellulare e stabilire la configurazione in intera cellula. Successivamente, caratterizzare la cellula in base alle sue proprietà elettriche.Utilizzando il comando LCGE code. Qui è riportato il potenziale d'azione medio di un neurone parametale del quinto strato con un valore di soglia di -50,5 millivolt. Questa figura mostra la misurazione delle risposte passive alle correnti iperpolarizzanti.L'identificazione delle proprietà attive di base della cellula rivela che la cellula è un neurone a scarica regolare e che vi è una minima adattamento all'iniezione di potenziali postsinaptici eccitatori simulati; modificare la directory in cui verrà salvato il prossimo esperimento digitando questo comando sul prompt dei comandi della shell. Invece di agire sui controlli hardware convenzionali dell'amplificatore, per applicare il bilanciamento del ponte e la compensazione della capacità stimare il kernel dell'elettrodo necessario per eseguire la compensazione attiva dell'elettrodo emettendo questo comando.Il kernel completo è la somma di due componenti: un kernel dell'elettrodo rapido e un kernel della membrana più lento, che genera la coda esponenziale osservata nel kernel completo. Il primo costituisce un modello non parametrico della pipetta. Iniettando corrente per separare i kernel della membrana e dell'elettrodo, il comando kernel LCG chiederà all'utente il numero di punti che compongono il kernel dell'elettrodo rapido. Successivamente, selezionare un numero tale per cui il kernel dell'elettrodo copra la fine della coda di decadimento esponenziale.Eseguire quindi l'esperimento di clampaggio dinamico utilizzando questo comando. Infine, visualizzare i risultati. Di seguito è riportata la riproduzione di un'attività simile a quella in vivo mediante clampaggio dinamico.I tracciati rossi e blu rappresentano rispettivamente la simulazione di sinapsi eccitatorie e inibitorie. Qui di seguito sono riportati i tracciati di tensione registrati da un neurone parametale L5, sottoposto a un bombardamento di correnti postsinaptiche eccitatorie o inibitorie. Le corrispondenti correnti eccitatorie, inibitorie e totali iniettate nella cellula sono mostrate nel grafico.Il grafico raster degli impulsi generati in 20 prove mostra che il neurone può essere estremamente affidabile e preciso in risposta allo stesso stimolo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti con lampada dinamica utilizzando il software toolbox LCG gratuitamente disponibile. Questa procedura può essere estesa ad altri protocolli a ciclo chiuso per indagare una vasta gamma di argomenti, che vanno dall'eccitabilità neuronale alle interazioni complesse delle reti.

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Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

In questo articolo, viene presentato un quadro sperimentale per eseguire esperimenti a circuito chiuso, in cui l'elaborazione delle informazioni (cioè codifica e decodifica) e l'apprendimento di assemblaggi neuronali vengono studiati durante l'interazione continua con un corpo robotico.

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