Real-time Elettrofisiologia: utilizzando protocolli a circuito chiuso per sonda neuronali Dynamics and Beyond

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di eseguire il clamp dinamico in vitro nei neuroni corticali utilizzando il toolbox software disponibile gratuitamente, LCG. Ciò si ottiene preparando fette di corteccia somatosensoriale di ratto per le registrazioni di patch clamp dalle cellule parametalliche. Come seconda fase, una serie di protocolli elettrofisiologici automatizzati viene applicata alla cellula registrata, che fornisce una caratterizzazione standard della cellula che sarà utile per le successive analisi e confronti tra i tipi di cellule.

Successivamente, viene simulata l'iniezione di eventi sinaptici eccitatori e inibitori. Al fine di ricreare lo stato di alta conduttività sperimentato dai neuroni neocorticali in vivo, i risultati mostrano come l'iniezione sinaptica di fondo modula il guadagno delle cellule corticali. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è la possibilità di incorporare registrazioni sperimentali in flussi di lavoro più complicati utilizzando, ad esempio, il risultato di un protocollo sperimentale come input per un altro protocollo.

Questo metodo può aiutare a standardizzare i protocolli elettrofisiologici, accelerare l'analisi dei dati e aprire la strada alla condivisione dei dati tra i laboratori. Sebbene questo metodo sia stato originariamente sviluppato per le registrazioni di patch CLA in vitro all'ingrosso, può essere utilizzato anche per altre preparazioni e protocolli sperimentali, come i patch in vivo, le registrazioni CLA o le registrazioni accelerate con micro to arrays the race. Dopo aver estratto il cervello di ratto, scartare il cervelletto e separare i due emisferi lungo la linea mediana utilizzando un bisturi, rimuovere il liquido in eccesso da uno degli emisferi e incollarlo su una piattaforma inclinata con una goccia di super colla.

Quindi aggiungi rapidamente alcune gocce di un liquido cerebrospinale sul cervello e trasferiscilo nella camera Vibram. Rimuovere i primi 2,5-3 millimetri di tessuto cerebrale con una lama. Successivamente, regolare la velocità e la frequenza di taglio per limitare i danni alla superficie della fetta.

Quindi, imposta lo spessore a 300 micrometri e inizia ad affettare. Una volta che la lama ha superato la corteccia, usa una lama di rasoio o un ago piegato per fare un taglio sopra l'ippocampo e ai bordi dell'area corticale di interesse. Successivamente, trasferire le fette in una camera di incubazione a più pozzetti a 36 gradi Celsius.

In questa procedura, posizionare una fetta nella camera di registrazione con la lente di ingrandimento 40x. Cerca cellule sane nel quinto strato e da 600 a 1000 micrometri. Sotto la superficie del cervello, queste cellule di solito hanno un contrasto inferiore, un aspetto liscio e non sono gonfie.

Una volta trovata una cellula sana, caricare un terzo della micropipetta con la soluzione intracellulare. Quindi posizionalo nella fase principale nel sistema operativo Linux preconfigurato. Avvia un comando.

Shell aggiunge il suo prompt. Digitare questo comando per assicurarsi che la scheda di acquisizione dati non stia pilotando l'amplificatore. Quindi applicare da 30 a 50 millibar di pressione positiva premendo il pistone della siringa, che è collegato al supporto della pipetta.

Quindi, posizionare la pipetta a circa 100 micrometri sopra la fetta e spostare la pipetta verso la cellula bersaglio utilizzando la modalità di avvicinamento del manipolatore microm. Successivamente, regolare l'offset della pipetta sull'amplificatore di elettrofisiologia ed emettere un impulso di prova da 10 millivolt in modalità voltage clamp. Utilizzando il comando LCG SEAL test per monitorare la resistenza della pipetta, ridurre la pressione da 10 a 30 millibar estraendo il pistone della siringa.

Avvicinarsi delicatamente alla cella e verificare la formazione di una fossetta osservando l'immagine sul monitor della videocamera. Allo stesso tempo, monitorare un aumento della resistenza evocato dall'impulso di prova osservando la forma d'onda corrente visualizzata sul monitor. Quando si verifica un aumento della resistenza della pipetta e la formazione di una fossetta sulla cellula, rilasciare immediatamente la pressione e applicare una leggera pressione negativa sulla pipetta per favorire la formazione della tenuta.

Nel frattempo, diminuire gradualmente il potenziale di tenuta a 70 millivolt negativi. Applicare un'aspirazione delicata per rompere la membrana cellulare e stabilire l'intera configurazione cellulare. Quindi caratterizzare la cella in termini di proprietà elettriche.

Utilizzando il comando LCGE code. Ecco il potenziale d'azione medio di un neurone parametallico di cinque strati patchato con una soglia di 50,5 millivolt negativi. Questa figura mostra la misura delle risposte passive alle correnti iperpolarizzanti.

L'identificazione delle proprietà attive di base della cellula rivela che la cellula è un normale neurone spiking e che c'è un adattamento minimo per iniettare potenziali eccitatori simulati e post-sinaptici nella directory in cui verrà salvato il prossimo esperimento digitando questo comando al prompt dei comandi della shell. Invece di agire sui controlli hardware convenzionali dell'amplificatore. Per applicare il bilanciamento del ponte e la compensazione della capacità, stimare il kernel dell'elettrodo necessario per eseguire la compensazione dell'elettrodo attivo emettendo questo comando.

Il kernel completo è la somma di due componenti, un kernel di elettrodi veloci e un kernel di membrana più lento che dà origine alla coda esponenziale osservata nel kernel completo. Il primo costituisce un modello non parametrico della pipetta Al momento dell'iniezione di corrente per separare i kernel della membrana e dell'elettrodo, il comando del kernel LCG richiederà all'utente il numero di punti che compongono il kernel dell'elettrodo veloce. Quindi, seleziona un numero in modo che il nucleo dell'elettrodo copra la fine della coda di decadimento esponenziale.

Quindi eseguire l'esperimento di bloccaggio dinamico utilizzando questo comando. Infine, visualizza i risultati. Ecco la ricreazione di un'attività simile a quella in vivo utilizzando il morsetto dinamico.

Tracce rosse e blu rappresentano rispettivamente la simulazione delle sinapsi eccitatorie e inibitorie. Ed ecco le tracce di tensione registrate da un neurone parametallico L cinque, che è stato sottoposto a un bombardamento di correnti post-sinaptiche eccitatorie o inibitorie. La corrispondente corrente eccitatoria, inibitoria e totale iniettata nella cellula è mostrata nel grafico.

Il grafico raster dei picchi generati in 20 prove mostra che il neurone può essere estremamente affidabile e preciso in risposta allo stesso input. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti con lampade dinamiche utilizzando la cassetta degli attrezzi software disponibile gratuitamente. LCG. Questa procedura può essere estesa ad altri protocolli a circuito chiuso per studiare un'ampia varietà di argomenti che vanno dall'eccitabilità neurale alle complesse interazioni di rete.