Name: Valutazione dellimpatto di esposizione ripetuta di organotipica 3D bronchiali e nasali coltura tissutale modelli di Whole fumo di sigaretta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Scopri come valutare l'impatto del fumo di sigaretta su modelli tissutali 3D bronchiali e nasali. Questo metodo utilizza colture all'interfaccia aria-liquido e analisi transcriptomiche per studiare la tossicologia respiratoria.

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Gli autori desiderano ringraziare Maurice Smith e Marja Talikka per la loro revisione del manoscritto.

<ol><li>Pezzulo, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+air-liquid+interface+and+use+of+primary+cell+cultures+are+important+to+recapitulate+the+transcriptional+profile+of+in+vivo+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiolog%22%5BJournal%5D)">The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biolog%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+airway+epithelium+air%E2%80%93liquid+cultures+represent+the+in+vivo+airway+epithelium+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome.</a> American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465(2011).</li>
<li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biolog%22%5BJournal%5D)">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).</li>
<li>Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components%3A+nicotine%2C+cadmium%2C+formaldehyde+and+urethane%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicolog. 244, 66-76 (2008).</li>
<li>Mathis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bronchial+epithelial+cells+exposed+in+vitro+to+cigarette+smoke+at+the+air-liquid+interface+resemble+bronchial+epithelium+from+human+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physio%22%5BJournal%5D)">Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).</li>
<li>Cho, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+cytotoxicity+assay+for+assessment+of+membrane+integrity+using+a+proteolytic+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitr%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker.</a> Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).</li>
<li>Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Differentiated+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Culture+Systems+for+Asthma+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allerg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research.</a> Journal of Allerg. 2012, 11(2012).</li>
<li>Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+corrected+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+to+quantify+rapid+changes+in+paracellular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazi%22%5BJournal%5D)">Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability.</a> Pharmazi. , 19-24 (2010).</li>
<li>Chhin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beating+recovery+in+deficient+human+airway+epithelial+cells+after+lentivirus+ex+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetic%22%5BJournal%5D)">Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy.</a> PLoS genetic. 5, e1000422(2009).</li>
<li>Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+nasal+epithelial+cells+grown+as+explant+outgrowth+cultures+or+dissociated+tissue+cultures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Me%22%5BJournal%5D)">Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro.</a> Front Me. 7, 486-491 (2013).</li>
<li>Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+reproductive+toxicity+of+tobacco+smoke+and+its+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+research.+Part+C%2C+Embryo+today+%3A+review%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).</li>
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<li>Iskandar, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+approaches+evaluating+the+perturbation+of+xenobiotic+metabolism+in+response+to+cigarette+smoke+exposure+in+nasal+and+bronchial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+In%22%5BJournal%5D)">Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues.</a> Biomed Res In. 2013, 512086(2013).</li>
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<li>Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+airway+ciliary+beat+frequency+by+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiolog%22%5BJournal%5D)">Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH.</a> The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+between+smoking-related+gene+expression+in+nasal+and+bronchial+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+genomic%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium.</a> Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).</li>
</ol>

Questo studio è stato finanziato da Philip Morris International.

Qui, abbiamo dimostrato l&#39;applicabilità bronchiale organotipica umana e modelli tessuti nasali per valutare l&#39;impatto di esposizione ripetuta CS. In alternativa alla sperimentazione animale, un certo numero di sistemi di esposizione sono stati sviluppati per le valutazioni tossicologiche dell&#39;esposizione aerosol in vitro (ad es., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Questi moduli di esposizione possono anche essere utilizzati per una valutazione tossicologica di inquinanti nell&#39;aria, particelle sospese nell&#39;aria, nanoparticelle, ecc In questo studio, abbiamo utilizzato il sistema Vitrocell che può ospitare fino a 48 campioni diversi contemporaneamente, consentendo sperimentazioni su scala più ampia e bassa variabilità tra i trattamenti. Per ogni esposizione aerosol in vitro, il rischio di contaminazione coltura tissutale rimane un rischio maggiore il cui mitigazione richiede un accurato trattamento delle colture di tessuto durante gli esperimenti. Misurazione deposito di particelle in tempo reale sul microbilancia durante la eesperimento Xposure permette di monitorare che le dosi CS generati dal sistema di esposizione sono conformi alle aspettative. Per garantire la precisione della deposizione di particelle misurata, messa a punto la misura in linea correttamente prima dell&#39;esposizione è critial, ad esempio, la creazione di scala a 0. Inoltre, a causa della differenza tra le aree del microbilancia (cm 2) e la inserto coltura tissutale (0,33 cm 2), abbiamo regolato il calcolo finale alla zona dell&#39;inserto coltura: solo il 33% della deposizione sul microbilancia riflette la deposizione effettiva nell&#39;inserto cultura. Misurazione di TEER accertare funzionalità barriera a tenuta giunzione e per valutare interruzione dello strato epiteliale è una procedura relativamente facile da implementare, che abbiamo riportato qui. Tuttavia, poiché i modelli di tessuto bronchiali e nasali contengono cellule calice intervallati producono muco, lavaggio apicale deve essere eseguita prima delle meas Teermi-. Il lavaggio apicale è critica perché la presenza dello strato di muco e la variabilità del suo spessore può influenzare la misura della TEER, interferire con l&#39;impatto dell&#39;esposizione CS. Questa nozione è in accordo con quanto riportato da Hilgendorf e colleghi, in cui la permeabilità delle cellule Caco-2 è stata influenzata dalla co-coltura con la linea cellulare calice-muco produzione HT29 23. Il muco ha bisogno di essere lavato via prima della misurazione TEER, perché il lavaggio apicale destra prima dell&#39;esposizione può interferire con le risposte del tessuto a CS. Pertanto, la misura viene eseguita tre giorni prima dell&#39;esposizione, e non appena prima dell&#39;esposizione. Abbiamo dimostrato che l&#39;attività CYP1A1 / CYP1B1 potrebbe essere misurata dai modelli culturali organotipica a seguito di esposizione CS, anche se l&#39;attività è stata solo modesta aumentato del CS. Questo segnale debole può essere amplificato da una incubazione più lungo del substrato CYP1A1 / 1B1 (es., Luciferina-CEE), ad esempio per24 hr (dati non mostrati). Uno dei limiti della misurazione dell&#39;attività CYP nel presente lavoro è l&#39;assenza di normalizzazione al livello proteico CYP o per il conteggio delle cellule, che potrebbe essere preso in considerazione per studi futuri per garantire che l&#39;alterazione sull&#39;attività enzimatica non è influenzata dall&#39;alterazione sia del livello di proteina o la conta delle cellule. Abbiamo segnalato che l&#39;esposizione CS inibito l&#39;ciliare battendo sia nel nasale e modelli di tessuto bronchiale. Osservazioni analoghe sono state fatte in diversi modelli di mammiferi e non mammiferi 12. Per ciliare battendo misurazione, assicurando che i tessuti sono trattati e trattati in modo analogo è critica, per esempio se è implementata medio cambiamento, dovrebbe essere applicata per tutti i campioni. Sutto e colleghi hanno riferito che il pH colpito il ciliare mammiferi battendo frequenza 24. Così, quando si confrontano battendo frequenze tra cellule trattate con diverse compunds / miscele, pHregolazione dovrebbe essere considerata per minimizzare la variabilità della misurazione battito ciliare. Inoltre, la temperatura alla quale la misura viene condotta è anche critica come la frequenza del battito ciliare scende al diminuire della temperatura. Per ridurre al minimo la variabilità a causa di questi cambiamenti, un incubatore fase-top, attrezzate con la temperatura, CO 2, e il controllo dell&#39;umidità è stato utilizzato in questo studio. Nonostante questo, abbiamo osservato che il ciliare battendo frequenze nei tessuti bronchiali dopo l&#39;esposizione CS erano molto variabile (es., Di aumentare in un inserto e diminuire nell&#39;altro inserto), suggerendo che il battito ciliare è giusto altamente disturbato dopo l&#39;esposizione. Al contrario, abbiamo osservato l&#39;assenza di frequenze misurabili battito ciliare nel tessuto nasale dopo esposizione CS, suggerendo che la risposta del tessuto nasale è più sensibile e coerente. Ciò è in accordo con una precedente pubblicazione dimostrano che il tessuto nasale ha una capacità inferiore a disintossicarsi comerispetto bronco 25. Infine, abbiamo dimostrato che l&#39;espressione del gene profiling dal bronchiale organotipica e modelli tessuti nasali esposto al CS potrebbe dimostrare un impatto di CS sul metabolismo xenobiotico. È interessante notare che l&#39;alterazione osservata nel metabolismo xenobiotico nel bronchiale organotipica nasale modelli in vitro esposto a CS assomigliano che la situazione in vivo nei fumatori come discusso in maggior dettaglio in una pubblicazione precedente 15. Per le analisi di espressione genica, utilizzando lo strumento robotico rende possibile l&#39;analisi ad alta produttività. Inoltre, la manipolazione robotizzata automatica aumenta ulteriormente la coerenza e la precisione dei risultati di espressione genica. Tuttavia, veloce raccolta dei campioni di tessuto è stato fondamentale per evitare la degradazione dell&#39;RNA durante l&#39;estrazione di RNA. Il trattamento RNA e approcci trascrittomiche qui descritte possono anche essere applicati a campioni di tessuto in vivo.

I polmoni sono direttamente e costantemente esposti all'aria inalata che può contenere diverse sostanze tossiche come inquinanti e costituenti del fumo di sigaretta (CS). Lo studio dell'impatto dell'esposizione a tali sostanze tossiche sui tessuti respiratori è più informativo se fatto in un modo che assomiglia all'esposizione in vivo. Rispetto alle classiche colture cellulari immerse in 2D (ad esempio, cellule epiteliali bronchiali umane normali (NHBE)), i modelli di tessuto organotipico 3D ricapitolano meglio gli aspetti morfologici, fisiologici e molecolari dell'epitelio delle vie aeree umane in vivo1,2: i modelli di tessuto 3D contengono la diversità dei tipi di cellule osservati in vivo, comprese le cellule epiteliali differenziate, le cellule ciliate e non ciliate, le cellule caliciformi e le cellule basali. Hanno giunzioni strette funzionali e mostrano un fenotipo mucociliare 1-3. Inoltre, le colture possono essere coltivate su una membrana porosa permeabile, in un'interfaccia aria-liquido, che consente un'esposizione diretta all'aerosol sul lato apicale (mentre il lato basolaterale è immerso nel terreno di coltura) 3-5. Dvorak e colleghi hanno riferito che i profili di espressione genica dei modelli di tessuto bronchiale erano simili a quelli ottenuti dagli spazzolamenti bronchiali umani 3. Inoltre, Mathis e colleghi hanno dimostrato che le risposte di questi modelli tissutali alla CS erano simili alle differenze osservate tra le cellule epiteliali bronchiali ottenute dai fumatori e le cellule ottenute dai non fumatori 6. Infine, poiché i modelli di tessuto bronchiale potrebbero essere coltivati per un massimo di diversi mesi 4,5, potrebbero potenzialmente essere utilizzati per esaminare gli effetti dell'esposizione a lungo termine degli elementi in esame. 
Le valutazioni di citotossicità sono parametri comuni misurati a seguito di insulti chimici o per valutare la tossicità di specifici composti o miscele. Ad esempio, l'integrità della membrana può essere misurata mediante un saggio luminescente e consente di misurare un effetto citotossico dose-dipendente sulla coltura cellulare 7. Tuttavia, per valutare gli effetti fisiopatologici dei composti a concentrazioni subtossiche, dovrebbero essere misurati altri parametri. Ad esempio, l'integrità tissutale determinata utilizzando il test di resistenza elettrica transepiteliale (TEER) garantisce la funzionalità delle giunzioni strette e monitora la rottura dello strato epiteliale 8,9. La frequenza del battito ciliare consente anche la misurazione degli effetti correlati alla CS sui tessuti respiratori. Una frequenza di battito normale per il rivestimento delle ciglia che confina con le vie respiratorie superiori e inferiori è importante per proteggersi dalle infezioni delle vie aeree 10. Ciascuna delle cellule epiteliali colonnari ciliate dell'epitelio respiratorio ha 200-300 ciglia che battono ad una particolare frequenza per eliminare gli agenti infettivi o il particolato inalato intrappolato nel muco rilasciato dalle cellule caliciformi intervallate 11. Il CS contiene sostanze chimiche che possono inibire il battito ciliare 12, portando a una ridotta protezione delle vie respiratorie. Questo lavoro mostra che il battito ciliare può essere misurato in modelli di tessuto organotipico. Questo approccio consente di valutare se le cellule epiteliali mostrano la loro normale funzione nella coltura tissutale organotipica. La CS attiva anche le risposte del metabolismo degli xenobiotici nel tratto respiratorio per metabolizzare i costituenti del fumo di tabacco 13. È possibile misurare l'attività degli enzimi di fase I per il metabolismo degli xenobiotici, CYP1A1 e CYP1B1, dei modelli tissutali. Inoltre, come precedentemente riportato, l'espressione genica globale può essere misurata nei modelli organotipici di tessuto bronchiale 6,14,15. Per valutare l'impatto della CS sul metabolismo degli xenobiotici 15, viene sfruttato un approccio di biologia dei sistemi basati su reti e dati trascrittomici. 
Le metodologie utilizzate per esporre modelli organotipici di tessuto bronchiale e nasale 3D al CS tradizionale utilizzando un sistema di esposizione in vitro e per misurare le risposte tissutali a questa esposizione rispetto all'esposizione all'aria fresca (controllo) sono descritte qui.

<table><tbody><tr><td>MucilAir-fibroblasti umani-bronchia</td><td>Epithelix S&aacute; rl, Ginevra, Svizzera</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>MucilAir Culture Medium</td><td>Epithelix S&aacute; rl, Ginevra, Svizzera</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>VITROCELL</td><td>VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germania</td><td>http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=</td><td></td></tr><tr><td>3R4F riferimento sigaretta</td><td>Università del Kentucky</td><td>http://www2.ca.uky.edu/refcig/</td><td></td></tr> <tr><td>30-port carosello macchina per fumare SM2000</td><td>Philip Morris, Int.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera CiliaMetrix e software</td><td>La Haute & Eacute; cole de Gestion (HESGE), Ginevra, Svizzera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Leica DMIL&nbsp;</td><td>Leica, Heerbrugg, Svizzera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa a LED</td><td>Titan Tool Supplies, Buffalo, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo a bacchetta STX-2</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/</td><td></td></tr> <tr><td>EVOMXTM Voltohmmetro epiteliale</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/</td><td></td></tr> <tr><td>Reagente per la rilevazione della luciferina&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumento Lyser MagNA</td><td>Cloroformio Roche</td><td>http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>9001882</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nano Scientific Thermo Scientific</td><td>http://www.nanodrop.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Bioanalizzatore Agilent 2100&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix GeneChip Elevata produttività 3' Kit IVT Express</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit</td><td></td></tr><tr><td>Scanner 3000 7G&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione dell&#39;impatto di esposizione ripetuta di organotipica 3d bronchiali e nasali coltura tissutale modelli di whole fumo di sigaretta

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Il fumo di sigaretta (CS) ha un impatto importante sulla biologia polmonare e può provocare lo sviluppo di malattie polmonari come la broncopneumopatia cronica ostruttiva o il cancro ai polmoni. Per comprendere i meccanismi alla base dello sviluppo della malattia, sarebbe importante esaminare l'impatto dell'esposizione alla CS direttamente sui tessuti polmonari. Tuttavia, questo approccio è difficile da implementare negli studi epidemiologici perché il campionamento del tessuto polmonare è complesso e invasivo. In alternativa, i modelli di coltura tissutale possono facilitare la valutazione degli impatti dell'esposizione sul tessuto polmonare. Le colture cellulari 2D sommerse, come le normali colture cellulari di epitelio bronchiale umano (NHBE), sono state tradizionalmente utilizzate per questo scopo. Tuttavia, non possono essere esposti direttamente al fumo in modo analogo alla situazione di esposizione in vivo. I modelli di coltura tissutale 3D sviluppati di recente riflettono meglio la situazione in vivo perché possono essere coltivati all'interfaccia aria-liquido (ALI). I loro lati basali sono immersi nel terreno di coltura; mentre i loro lati apicali sono esposti all'aria. Inoltre, le colture di tessuti organotipici che contengono diversi tipi di cellule, rappresentano meglio la fisiologia del tessuto in vivo. In questo lavoro, viene dimostrato l'utilizzo di un sistema di esposizione in vitro per esporre modelli di tessuto bronchiale e nasale organotipico umano alla CS tradizionale. La frequenza di battito ciliare e l'attività del citocromo P450 (CYP) 1A1/1B1 sono state misurate per valutare gli impatti funzionali del CS sui tessuti. Inoltre, per esaminare le alterazioni indotte da CS a livello molecolare, sono stati generati profili di espressione genica dai tessuti dopo l'esposizione. Un leggero aumento dell'attività del CYP1A1/1B1 è stato osservato nei tessuti esposti al CS rispetto ai tessuti esposti all'aria. Un approccio di biologia dei sistemi basato su reti e trascrittomica era sufficientemente robusto per dimostrare alterazioni del metabolismo xenobiotico indotte da CS che erano simili a quelle osservate nelle cellule epiteliali bronchiali e nasali ottenute dai fumatori.

Nei risultati di seguito descritti, i tessuti organotipica erano cellule primarie umane epiteliali isolati da sani, non fumatori, i donatori caucasici e sono state ricostituite usando fibroblasti 15. Bronchiale 3D e modelli di tessuto nasale In bronchiale vitro e modelli organotipica nasali assomigliare a livello cellulare epitelio respiratorio umano (Figura 2). L&#39;esposizione CS Bronchiale Organotipica e modelli tessuti nasali possono essere ripetutamente esposti ad integrare CS all&#39;interfaccia aria-liquido. La procedura sperimentale esposizione al fumo utilizzato per i risultati qui illustrati sono illustrati nella figura 1. Registrazione del battito ciliare Cilia pestaggio è stato registrato nei tessuti esposti ad aria come illustrato nel video. L&#39;esposizione CS è stata associata con una riduzione della frequenza ciliare pestaggio: il picco più forte osservata intorno4 Hz nel sham esposti e prima esposizione non si osserva più dopo l&#39;esposizione CS (Figura 3). Questa frequenza ridotta renderebbe le ciglia battendo meno efficiente per rimuovere muco e agenti infettivi 22. Misura di TEER e CYP1A1 / attività 1B1 TEER è stata misurata 48 ore dopo l&#39;ultima esposizione per assicurare il tessuto è ancora funzionante. CYP1A1 / 1B1 attività è stata anche misurata 48 ore dopo la fine dell&#39;esposizione come illustrato in figura 1. I valori TEER nei tessuti CS-esposti non erano significativamente differenti rispetto ai tessuti-aria esposto conferma che non vi è alcun grave effetto citotossico di fumo a questa concentrazione. Al 48 h post-esposizione, CYP1A1 / 1B1 attività dei tessuti era leggermente aumentato, indicando un modesto aumento di tessuto meccanismo di difesa dopo l&#39;esposizione (Figura 4). Profili di espressione genica e sistemi basati sulla rete biapproccio ology per studiare l&#39;impatto dell&#39;esposizione CS sulla alterazione del metabolismo xenobiotici I tessuti sono stati raccolti in 48 h post-esposizione punti di tempo. Successivamente, l&#39;analisi microarray è stata condotta per generare profili di espressione genica del CS e tessuti-aria esposti. Impatto dell&#39;esposizione CS sul metabolismo xenobiotico è stato studiato con un approccio di biologia dei sistemi network-based sfruttato dai profili di espressione genica e, come riferito in precedenza 15. Usando un approccio di biologia dei sistemi basati sulla rete mostra che CS impatti esposizione a livello dei nodi di backbone nel modello di rete Metabolism Xenobiotic erano ben correlati fra in vitro e in vivo set di dati (Figura 5). Al contrario, a livello di ogni singolo cambiamenti di espressione genica, correlazioni poveri sono stati osservati tra in vitro (CS-esposto vs. aria esposto) e in vivo (fumatori vs fumatori). Figura 1. Procedura schematica della esposizione ripetuta di CS ai modelli di tessuto bronchiale organotipica Abbreviazioni:. CYP, del citocromo P450; CS, fumo di sigaretta; TEER, transepiteliale resistenza elettrica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig2.jpg" /> Figura 2. Organotipica bronchiali e nasali modelli di coltura di tessuti epiteliali. Fumetto illustra bronchiali (A) e nasale (B) dell&#39;inserto coltura tissutale all&#39;interfaccia aria-liquido. I modelli in vitro contenevano cellule ciliate mostrati nello strato apicale delle cellule colorate ematossilina e eosina (C per bronchiale, D per nasale) come riportato in precedenza 15. I modelli sono stati co-coltura con fibroblasti che sono importanti<html> per la crescita e la differenziazione delle cellule epiteliali (indicato dalle frecce). La colorazione dei marcatori lignaggio delle vie aeree: p63 (E per bronchiale, F per nasale) e MUC5AC (G per bronchiale, H per nasale) sono indicati come riportato in precedenza 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig3.jpg" /> Figura 3. Cilia Vincere Frequency. Cilia frequenza battito (CBF) è stata misurata in aria a vista e nella cultura, prima e dopo l&#39;esposizione. Diminuzione CBF è stato visto dopo l&#39;esposizione CS (risultati rappresentativi di due inserti sono mostrati come replicare 1 (R1) e replicano 2 (R2)). annuncio / 52325 / 52325fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Misura del CYP1A1 / attività CYP1B1 e TEER. Pannelli sinistra indicano l&#39;attività di CYP1A1 / CYP1B1 nel bronchiale (A) e nasale (B) modelli di tessuto. Pannelli destra indicano la misura TEER nella bronchiale (C) e nasale (D) modelli di tessuto. Sono mostrati mezzi ± SD. Abbreviazioni: CS, fumo di sigaretta; CYP, citocromo P450; TEER, transepiteliale resistenza elettrica; RLU, unità luminescense relativa. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig5.jpg" /> Figura 5. sistemi basati Network approccio biologico per la valutazione di impatto dell&#39;esposizione CS nel contesto del metabolismo xenobiotico. I cambiamenti dei livelli di espressione genica sono stati usati per calcolare l&#39;attivazione del nodo di backbone del modello di rete Xenobiotic metabolismo (A) </<html> strong&gt; come riportato in una pubblicazione precedente 15. La figura a destra illustra il concetto di quantificazione dei nodi di backbone, noto anche come &quot;valore backbone di rete differenziale,&quot; utilizzando l&#39;approccio NPA. I ovali blu rappresentano l&#39;attività dei nodi di backbone (ie., Lo strato funzionale) e le sfere verdi rappresentano l&#39;espressione di geni (ie., Lo strato trascrizionale). Impatti di esposizione CS nei tessuti bronchiali organotipiche (in vitro, CS-esposto contro-air esposto) alla 48 ore di post-esposizione sono stati confrontati con quelli di fumo sulla epiteliali bronchiali umane raccolte da broncoscopia e nasale epiteliale dal burshing turbinati inferiori (GSE16008 ) (in vivo, i fumatori vs fumatori) (B). Inserti, correlazione della espressione genica cambia tra la in vitro e in vivo dataset. Abbreviazioni: CS, fumo di sigaretta; NPA, perturbazione di ampiezza di rete.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Lo scopo di questo protocollo è quello di esporre modelli organotipici di tessuto bronchiale e nasale 3D umano al fumo di sigaretta (CS) tradizionale all'interfaccia aria-liquido. L'impatto della CS sui tessuti viene quindi studiato utilizzando un saggio di attività del citocromo P450, una misurazione del battito delle ciglia e un approccio di biologia dei sistemi.

Valutazione dell&#39;impatto di esposizione ripetuta di organotipica 3D bronchiali e nasali coltura tissutale modelli di Whole fumo di sigaretta

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare l'impatto dell'esposizione ripetuta di modelli di coltura organotipica 3D di tessuto bronchiale e nasale al fumo di sigaretta intero. Ciò si ottiene coltivando prima modelli di coltura di tessuto organotipico, bronchiale e nasale all'interfaccia aria-liquido. Il secondo passo consiste nel generare aerosol con una macchina per fumare ed esporre le colture di tessuti secondo il disegno sperimentale in un sistema di esposizione.Successivamente, l'impatto dell'esposizione viene valutato misurando la frequenza di battito ciliare e l'integrità dei tessuti della coltura. Il passaggio finale consiste nel misurare gli scambi di trascrittoma indotti dall'aerosol utilizzando la tecnologia dei microarray. In definitiva, un approccio di biologia dei sistemi basato su reti ha mostrato l'impatto del fumo di sigaretta intero sulla coltura tissutale.Il vantaggio principale di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti in tossicologia respiratoria è che gli approcci sono allineati con i requisiti delle agenzie di regolamentazione per trovare alternative ai test sugli animali, consentono la valutazione degli effetti dell'esposizione a breve termine al fumo di sigaretta sulle cellule cresciute all'interfaccia illiquida, imitando le condizioni che si verificano nel tratto respiratorio umano. Per iniziare l'esperimento, aggiungere 0,7 millilitri di terreno di coltura preriscaldato a ciascun pozzetto di una piastra sterile a 24 pozzetti. Quindi, rimuovere l'imballaggio in tessuto e trasferire gli inserti per coltura tissutale sulla piastra a 24 pozzetti appena preparata.Mantenere la coltura tissutale in un incubatore e sostituire il terreno ogni due giorni durante il cambio del terreno. Esamina i tessuti al microscopio ottico per assicurarti che siano privi di contaminazioni e che non vi siano perdite di fluidi. Tre giorni prima degli esperimenti di esposizione, lavare il lato apicale della coltura tissutale con 200 microlitri di terreno di coltura.Successivamente, preriscaldare la camera climatica del sistema in vitro e il modulo di base di coltivazione a 37 gradi Celsius. Dopo che è stato riscaldato, riempire il modulo di base della coltivazione con 17,5 millilitri di terreno per fila. Rimuovere i tessuti dall'incubatore e trasferire gli inserti di coltura tissutale dalla piastra di coltura al modulo base di coltura del sistema di esposizione in vitro.Quindi coprire il modulo di base della coltivazione con un coperchio di vetro. Trasferire i tessuti nella camera climatica per l'esposizione al fumo di sigaretta tradizionale. Genera fumo di sigaretta utilizzando una macchina per fumatori a carosello calibrata a 30 porte.Fumare le sigarette a una lunghezza standard ma di circa 35 millimetri a 55 millilitri. Sbuffare per due secondi, due volte al minuto e otto secondi di tempo di scarico della pompa. Il fumo di sigaretta tradizionale generato viene accumulato e rilasciato nel sistema di esposizione in vitro.Esporre i fazzoletti per sei o sette minuti. Dopo aver trasferito i tessuti su una piastra di coltura, rimetterli nell'incubatore per un'ora. Rimuovere le piastre di coltura tissutale dall'incubatore e lasciarle sotto la cappa a temperatura ambiente per 30 minuti per stabilizzare la battitura CLIA.Dopo la stabilizzazione, osservare i tessuti al microscopio ottico collegato al software cliometrico. Successivamente, registrare la frequenza del battito ciliare, misurando la frequenza ogni tre secondi per un minuto, 48 ore. Dopo l'esposizione, aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura al lato apicale dei tessuti epiteliali bronchiali umani e misurare la resistenza dei tessuti inserendo un elettrodo a bacchetta nel terreno basale e nel terreno appena aggiunto sul lato apicale della coltura tissutale senza toccare il tessuto.Dopo le misurazioni, rimuovere delicatamente il terreno dal lato apicale delle colture tissutali utilizzando una pipetta per pasta collegata a una pompa a vuoto e rimettere i tessuti nell'incubatore. Per misurare l'attività enzimatica del citocromo P 4 50, preparare una nuova piastra con Lucifer e substrato CEE precedentemente preparati, trasferire gli inserti in quel coperchio della piastra e incubare gli inserti tissutali durante la notte. Dopo l'incubazione, trasferire 50 microlitri di terreno di coltura da ciascun inserto tissutale in una piastra luminometrica bianca opaca a 96 pozzetti a temperatura ambiente.Quindi aggiungere 50 microlitri di reagente di rilevamento Lucifer a ciascun pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti. Una volta terminata l'incubazione, misurare la luminescenza con il luminometro. Raccogliere la piastra di inserti di tessuto organotipico 3D dall'incubatore e lavare ogni inserto sulla piastra tre volte con PBS freddo e aspirare il PBS con una pipetta passata tra un lavaggio e l'altro.Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare il PBS e coprire la piastra per evitare che l'inserto si asciughi. Quindi, ritagliare la membrana dell'inserto per ogni inserto dalla piastra fino a quando la membrana non si appoggia sulla lama. Trasferire il fazzoletto dalla lama al tubo di omogeneizzazione e avvitare il coperchio sul tubo.Quindi agitarlo, agitarlo a vortice e metterlo su ghiaccio secco. Scongelare e macinare i campioni con lo strumento di omogeneizzazione a 6.000 giri/min per 45 secondi. Lasciare agire per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere 140 microlitri di cloroformio al campione e agitare nuovamente per 15 secondi.Trasferire l'intero campione dalla provetta omogeneizzatrice a una provetta ad aggancio di fase. Posizionarlo su un thermo shaker e agitarlo per due minuti a 1400 RPM a temperatura ambiente. Quindi lasciare agire per due minuti a temperatura ambiente.Una volta completata l'agitazione, centrifugare la provetta per 15 minuti a quattro gradi Celsius a 12.000 G.Trasferire il surnatante in una nuova provetta da due millilitri. Seguire con il lavaggio, la sospensione e la purificazione con precipitazione dell'RNA. Una volta estratti, gli RNA vengono sottoposti a controllo di qualità.Per valutare la quantità e l'integrità, preparare il sistema di manipolazione dei liquidi e la sintesi target. Posizionare l'RNA estratto. Le piastre e tutti i reagenti necessari e le usura di laboratorio nel robot.Le prime concentrazioni di RNA saranno normalizzate. Quindi il mazzo verrà cambiato per i passaggi successivi, dall'amplificazione all'etichettatura, alla purificazione e alla frammentazione. Successivamente, la miscela di ibridazione viene aggiunta a 33 microlitri di RNA A frammentato ed etichettato, denaturare i campioni e pre-bagnare l'array con 200 microlitri di pre-ibridazione.Miscela del kit di lavaggio e colorazione per l'ibridazione. Quindi posizionare il chip nel forno di ibridazione impostato a 45 gradi Celsius e 60 RPM per 10 minuti. Rimuovere il tampone di pre-ibridazione e caricare 200 microlitri di campione.Incubare l'array per 16 ore a 45 gradi Celsius e 60 giri/min in forno. Aspirare il cocktail dal chip e riempire il microarray con 250 microlitri di tampone di lavaggio. Apri il software ed esegui fluidics dalla barra dei menu del software.Seleziona il modulo di interesse e i primi quattro 50 programmi per ogni modulo. Assegna il chip giusto a ciascun modulo scansionando il codice a barre del chip e posiziona i chip nel sistema fluidico. Infine, assicurati che lo scanner sia caldo.Quindi caricare il chip nel caricatore automatico dello scanner ed eseguire la scansione del microarray. La frequenza di battimento CELIA o CBF del tessuto nasale è stata misurata prima e dopo l'esposizione all'aria o al fumo di sigaretta o cs. Il CBF e il tessuto nasale erano più lenti dopo l'esposizione a cs.Una minore frequenza di battito del CLIA riduce l'efficienza nella rimozione del muco e degli agenti infettivi. Sono state condotte analisi di microarray per studiare gli impatti dell'esposizione alla CS in modelli di tessuto organotipico, bronchiale e nasale. 48 ore dopo l'esposizione.Questo impatto della CS in vitro è stato confrontato con l'impatto del fumo sul tessuto epiteliale bronchiale umano raccolto rispettivamente mediante broncoscopia e spazzolamento epiteliale nasale. La biologia dei sistemi basata su reti mostra una correlazione positiva tra i nodi dorsali dei set di dati in vivo e in vitro. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare che si tratta di un'area di ricerca in via di sviluppo.Ci sono due componenti chiave da un lato, una piattaforma di esposizione all'aerosol ben caratterizzata, e dall'altro lato, un sistema sperimentale rilevante che può consistere in un modello di coltura tissutale tridimensionale che imita al meglio l'architettura specifica, i segnali biochimici e meccanici, nonché l'interazione cellula-cellula del microambiente rilevante per il tessuto o l'organo bersaglio. Sotto inchiesta.

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