Name: Alta definizione Fourier Transform Infrared (FT-IR) spettroscopica Imaging di sezioni di tessuto umano verso Migliorare Patologia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Scopri l'imaging spettroscopico FT-IR ad alta definizione per la patologia su sezioni di tessuto umano. Questo metodo senza etichette rivela la biochimica intrinseca dei tessuti per migliorare la diagnosi e la prognosi delle malattie.

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Ringraziamo il Dipartimento di Patologia dell'Università dell'Illinois a Chicago per il sostegno finanziario. I servizi di istologia e imaging visibile sono stati forniti dal Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core presso l'Università dell'Illinois a Chicago, istituito con il supporto del Vice Cancelliere della Ricerca, in particolare vorremmo ringraziare Ryan Deaton e Andy Hall per la loro competenza. Vorremmo anche ringraziare Agilent Technologies, in particolare Frank Weston per il supporto e il prestito di lenti IR aggiuntive.

1. La creazione di un FT-IR Microscopio e Acquisizione tessuto Images <ol><li> Sezione di un blocco di tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina a 4 micron di spessore su un vetrino compatibile IR utilizzando un microtomo. In alternativa, la sezione azoto tessuto congelato liquido a 4 micron di spessore su un vetrino compatibile IR utilizzando un criostato. NOTA: In genere, una sezione di serie sarà anche acquisito su un vetrino e tinto con un speciale (ad esempio ematossilina e eosina (H &amp; E)) o macchia immunoistochimica. Inoltre, linee cellulari in coltura possono essere coltivate su vetrini compatibili IR. Diapositive compatibili IR possono essere diapositive riflettenti IR per la modalità di riflessione per immagini (ad esempio, mirrir scivolo, oro) o IR vetrini trasparenti per la modalità di trasmissione delle immagini (ad esempio, BaF 2, CaF 2). </li><li> Eliminare il microscopio FT-IR e spettrometro utilizzando aria secca o gas azoto secco per rimuovere l&#39;acqua dal sistema atmosferica. Attendere almeno 45 minuti prima di imaging per garantire un Purg completae. </li><li> Raffreddare sia il rivelatore FPA (a 79 K) e il rilevatore MCT interna al microscopio FT-IR usando azoto liquido. Raffreddare i rivelatori circa ogni 6 ore. ATTENZIONE! L&#39;azoto liquido è un fluido criogenico e può causare ustioni, congelamento e in spazi chiusi asfissia. </li><li> Montare il vetrino del campione sul palco microscopio per l&#39;imaging FT-IR. </li><li> Assicurarsi che la luce visibile è &quot;ON&quot; e poi o con il binocolo o il programma di cattura del campione (che fornisce una immagine visibile del tessuto in tempo reale), si concentrano sul campione. </li><li> Aprire il pacchetto software pacchetto quali risoluzioni pro e fare clic su &#39;Collect&#39;, quindi su &#39;Diagnostica&#39; e selezionare &#39;Allinea Spectrometer&#39;. Verificare che il percorso del fascio per il rilevatore interno spettrometro non sia ostruita. </li><li> Clicca su &#39;Imaging Setup&#39;. </li><li> Nella scheda &#39;Elettronica&#39;, selezionare l&#39;appropriata &#39;Speed&#39;, &#39;Under SaRapporto mpling (UDR) &#39;e&#39; Impostazioni Filtri &quot;a seconda del sistema. NOTA: In questo esempio, l&#39;impostazione è di velocità = 2,5 KHz, UDR = 4 e filtri = nessuno. </li><li> Nella scheda &#39;Ottica&#39; verificare che siano selezionate &#39;fonte Mid-IR&#39;, &#39;Open di apertura&#39; e &#39;al 100% fascio attenuatore&#39;. </li><li> Per calibrare il sistema, nella scheda &#39;Ottica&#39;, selezionare &#39;Detector&#39; come &#39;terra&#39;, &#39;Microscope Detector&#39; come &#39;sinistra&#39;, e quindi selezionare &#39;trasmittanza&#39; o &#39;Riflessione&#39; sotto &#39;mode Optics&#39; a seconda del tipo di scivolare in uso. </li><li> Fare clic su Imposta, che aprirà la finestra &#39;Lancer Control&#39;. NOTA: Per la modalità di riflessione seguire le istruzioni in 1.12 e 1.13 e per la modalità di trasmissione seguire le istruzioni a 1,14-1,16. Continuare a 1.17 sia per riflessione e trasmissione. </li><li> Per la modalità di riflessione, in &amp;# 8216; &#39;cliccare su&#39; Lancer controllo Raw &#39;. Utilizzando il joystick di controllo fase e guardare la vista dal vivo dell&#39;immagine interferogramma FT-IR (immagine in alto a destra), spostarsi in una zona pulita della diapositiva. </li><li> Regolare il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. Successivamente, spostare la fase di trovare un pezzo di tessuto con struttura, preferibilmente il bordo di un tessuto, e perfezionare la messa a fuoco dell&#39;immagine. Change &#39;Calore&#39; e opzioni &#39;di contrasto &quot;per formare un&#39;immagine di migliorare la messa a fuoco, questo non avrà alcun effetto sui dati IR. Continuare dal 1.18. </li><li> Per la modalità di trasmissione, in clic &#39;Lancer controllo&#39; su &#39;Raw&#39;. Utilizzando il joystick di controllo fase e guardare la vista dal vivo dell&#39;immagine interferogramma FT-IR (immagine in alto a destra), spostarsi in una zona pulita della diapositiva. </li><li> Regolare il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. </li><li> Regolare il fondo focalizzazione / condensatore obiettivo di aumentare il numero di conteggi al suo maximum. Vedere la forma dell&#39;immagine in basso a destra in Lancer controllo per assicurarsi che sia gaussiana aspetto e relativamente uniforme. Regolare di nuovo il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. NOTA: Se uno dei pixel dell&#39;immagine interferogramma FT-IR, a sua volta bianco, ridurre il tempo di integrazione. </li><li> Spostare la fase di trovare un pezzo di tessuto con struttura, preferibilmente il bordo di un tessuto e perfezionare la messa a fuoco dell&#39;immagine. Facoltativamente, modificare le opzioni di calore e di contrasto per contribuire a formare l&#39;immagine per migliorare la messa a fuoco, ma non avrà alcun effetto sui dati IR. </li><li> Utilizzando il joystick di controllo fase, spostarsi in una zona pulita della diapositiva. Premere il pulsante &#39;Calibra&#39;. Garantire la &#39;Out Of Range (OOR)&#39; valore è inferiore a 50 e la differenza tra il &#39;High Flux&#39; e conta &#39;basso flusso&#39; è di almeno 4.000 conteggi. </li><li> Seleziona &#39;OK&#39; due volte. Nelle schede ottiche selezionare; &#39;MCT&#39; &#39;rivelatore&#39; =, &#39;Microsfar fronte Detector &#39;=&#39; right &#39;e quindi su&#39; Setup &#39;. A questo punto ci sarà un interferogramma FT-IR sullo schermo. Clicca su &#39;Trova Centerburst&#39;. Fare clic su &#39;OK&#39;. </li><li> Nella scheda &#39;Ottica&#39;, riselezionare &#39;rivelatore&#39; = &#39;terra&#39;, &#39;Microscope Detector&#39; = &#39;sinistra&#39; e selezionare &#39;Setup&#39;. </li><li> In Lancer controllo - garantisce che l&#39;immagine è ancora in una zona pulita e fare clic su &#39;Calibra&#39; di nuovo. Fare clic su &#39;OK&#39;. </li><li> Successivamente, il ritiro immagine di sfondo FT-IR per correggere assorbanza dall&#39;atmosfera, sistema e scivolo. Vai alla scheda &#39;Elettronica&#39; e selezionare una risoluzione spettrale opportuno, tipicamente di 4 cm -1 o 8 cm -1 per tessuti. </li><li> Vai alla scheda &#39;sfondo&#39; e digitare 128 in &quot;Scansioni di co-add &#39;. Selezionare il &#39;Nuovo file ...&#39; pulsante e inserire il file di sfondo in appropriate volteer. Controllare scheda &#39;Imaging&#39; per garantire mosaicatura è 1 di 1. Fare clic su &#39;Contesto&#39;, attendere che la scansione per terminare e confermare dove salvare il file. Fare clic su una regione lo sfondo dell&#39;immagine FT-IR e controllare lo spettro. </li><li> Per fare una grande immagine mosaico del campione, selezionare la scheda &#39;Imaging&#39; e inserire il numero di X e Y cornici per le dimensioni del mosaico che si desidera acquistare. </li><li> Fare clic su &#39;Setup&#39; e in Lancer controllo utilizzare la vista a infrarossi dal vivo per trovare l&#39;area di interesse. Se prendere un mosaico, centrare il feed dal vivo nel centro della zona di interesse. Fare clic su &#39;OK&#39;. Vai alla scheda &#39;Elettronica&#39; e digitare il numero di scansioni di co-aggiungere (in genere un valore compreso tra 2 e 16 scansioni per il tessuto). Fare clic su &#39;Scan&#39;. </li><li> Controllare l&#39;immagine FT-IR raccolti sullo schermo per assicurarsi che sembra mirato. Clicca sull&#39;immagine per visualizzare uno spettro IR da quella posizione e controllare che sembra avere un segnale accettabile per il rumore. Acquire un&#39;immagine visibile del campione. </li><li> Salvare l&#39;immagine e esportarlo nel formato richiesto, come ad esempio ENVI-IDL. </li></ol> 2. Adattare un FT-IR Microscopio per capacità ad alta definizione NOTA: La maggior parte dei sistemi FT-IR sono dotati di un obiettivo di circa 15x e 0,5 apertura numerica (NA). Per l&#39;immagine in modalità ad alta definizione, un IR compatibile 36X o 74x obiettivo può essere usato per dare la diffrazione capacità di imaging limitate. <ol><li> Rimuovere obiettivo 15X del sistema svitando in senso antiorario. </li><li> Avvitare la obiettivo 36X o 74x al suo posto. Allineate l&#39;obiettivo prima dell&#39;uso. Utilizzare tubi di prolunga lente di portare l&#39;obiettivo abbastanza vicino al campione. </li><li> Collocare il tessuto sotto il nuovo obiettivo e mettere a fuoco utilizzando la luce visibile utilizzando i binocoli o programma Capture Sample. NOTA: per immagini ad alta definizione deve essere fatto in modo di trasmissione. La distanza molto ravvicinata funzionamento delObiettivi SE (1-2 mm) e molto poca profondità di fuoco richiede fuoco lentamente e con attenzione, prendendo tempo per abbassare l&#39;obiettivo senza toccare il campione. </li><li> Seguire le istruzioni 1,6-1,11. NOTA: A causa di essere molto più difficile mettere a fuoco e molto meno luce che raggiunge il sensore, il seguente protocollo è regolata sulla base di 1,14. </li><li> In modalità di trasmissione, clicca su &#39;Raw&#39;. Utilizzando il joystick di controllo fase e guardare la vista dal vivo dell&#39;immagine interferogramma FT-IR (immagine in alto a destra), passare al tessuto e concentrarsi (idealmente su un bordo). NOTA: Questo può essere difficile, quindi regolare il &#39;calore&#39; e le opzioni di &quot;contrasto&quot; per formare un&#39;immagine di migliorare la messa a fuoco (queste opzioni non hanno effetto sui dati IR). </li><li> Una volta messo a fuoco, utilizzando il joystick di controllo fase e il live view IR recarsi in una zona pulita della diapositiva. Regolare il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. Regolare il fondo di messa a fuoco dell&#39;obiettivo diaumentare il numero di conteggi al massimo. Regolare di nuovo il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. </li><li> Spostare la fase di trovare un pezzo di tessuto con struttura, preferibilmente il bordo di un tessuto, e perfezionare la messa a fuoco dell&#39;immagine. </li><li> Se mosaicatura un&#39;immagine ad alta risoluzione, regolare la fase per consentire il movimento corretto richiesto su distanze per mosaicatura precisa. Per modificare le impostazioni della distanza di scena, andare a &#39;fase Setup&#39; in Lancer controllo e regolare le impostazioni di allineamento orizzontale e verticale per consentire il corretto mosaicatura. </li><li> Utilizzando il joystick passaggio di controllo fase verso una zona pulita della diapositiva. Premere il pulsante &#39;Calibra&#39;. Garantire la Out Of Range (OOR) il valore è inferiore al 50 per entrambi 36X e 74x obiettivi. Assicurarsi che la differenza tra l&#39;alto flusso e bassi valori di flusso è almeno 1000 conteggi per l&#39;obiettivo 74x e 2.000 conteggi per l&#39;obiettivo 36X. </li><li> Continuare 1,19-1,27. Il numero di scansioni in 1.23 e1.25 dovranno essere rettificato per segnale ridotto a circa 256 scansioni per l&#39;immagine di sfondo e 16-128 scansioni per l&#39;immagine del tessuto. </li></ol> 3. visualizzare e classificare IR Datasets Spectral NOTA: In questa sezione, parleremo di come visualizzare ed estrarre i dati da immagini spettrali utilizzando l&#39;elaborazione delle immagini geospaziali e analisi software quali ENVI + IDL, ma il processo è molto simile per qualsiasi software alternativo come MATLAB, software libero come CytoSpec , o il software stesso dello sviluppatore strumento. Ci sono un paio di diverse tecniche di lavorazione spettrale che possono essere eseguite sui dati IR. <ol><li> Aprire elaborazione delle immagini geospaziali e software di analisi e caricare il file di dati a infrarossi. </li><li> Applicare un algoritmo di correzione al basale ai dati IR selezionando &quot;strumenti spettrale&quot; e scorrere verso il basso e fare clic su &quot;spettri di assorbimento&quot;. Osservare un menu pop-up e selezionare &quot;Baseline correction &quot; NOTA: la correzione della linea di base rimuoverà una pendenza spostamento della linea di base dai dati a causa di dispersione </li><li> Eseguire normalizzazione spettrale, da ratioing i dati ad un certo picco spettrale (tipicamente Amide I (1650 centimetri -1) o Amide II (1550 centimetri -1)) o area sotto una regione definita degli spettri. Fare questo selezionando &quot;Normal spettri&quot; sotto i &quot;assorbanza Spectra&quot; Opzioni del menu. NOTA: Spectral normalizzazione viene eseguita in modo che eventuali differenze di spettri sono differenze reali biochimiche e non a causa di spessore o di differenze di densità tra i campioni. </li><li> Utilizzare un algoritmo di riduzione del rumore per rimuovere il rumore dagli spettri, se necessario 28. NOTA: Ci sono diversi approcci disponibili per cui correzione al basale, la normalizzazione spettrale e riduzione del rumore possono essere raggiunti, con la maggior parte dei software con algoritmi automatizzati costruito nel In aggiunta, ci sono un numero emergente di approcci che correggerà per.aberrazioni spettrali, che sono state discusse in dettaglio 29-42; tuttavia, la comunità non è ancora d&#39;accordo su quale di questi sono necessari. </li><li> Osservare un elenco di tutte le frequenze IR raccolti all&#39;interno dell&#39;immagine (tipicamente di una gamma spettrale da 900 a 4.000 cm- 1). Istruzioni sulle frequenze corrispondenti alle specifiche biomolecole osservare un&#39;immagine del tessuto alla frequenza selezionata. <ol><li> Per esempio, cliccare su banda 1650 centimetri -1 osservare la distribuzione delle proteine ​​nel campione. Alternativamente cliccare sulla banda 1080 centimetri -1 osservare la distribuzione degli acidi nucleici nel campione. Utilizzare wavenumber 1.650 centimetri -1. </li></ol></li><li> Crea immagini aggiuntive calcolando rapporti spettrali picco di altezza, rapporti zona di punta, ecc che permetteranno per la visualizzazione di diversi componenti biomolecolari. Clicca su &quot;Strumenti spettrali &#39;e quindi selezionare&#39; Rapporti di altezza di picco &#39;o&#39; Calcola Area Immagine &#39;per creare immagini. </li><li> Scansione la sezione corrispondente tessuto adiacente che è macchiato utilizza un intero sistema di scorrimento imager separato che cattura immagini brightfield. L&#39;immagine IR Accanto, visualizzare l&#39;immagine digitale del tessuto macchiato con un programma di immagine visibile. </li><li> Fare clic destro sull&#39;immagine in una regione di interesse e selezionare &#39;profilo Z&#39;. Questo darà le informazioni spettrali al pixel selezionato. </li><li> Guardate gli spettri IR di più pixel di più classi, come ad esempio il confronto tipi di cellule, stati di malattia. Segna i pixel specifici sull&#39;immagine utilizzando il &#39;regioni di interesse&#39; (ROI) strumento. Per eseguire questa operazione, fate clic destro sull&#39;immagine e selezionare &#39;strumento ROI&#39;. Creare le classi che devono essere etichettati, ad esempio normale, displasia, e le classi di cancro. Selezionare quindi, &#39;tipo ROI&#39; - &#39;Point&#39;. Quindi selezionare la classe di selezionare pixel per e disegnare sui pixel appropriate nell&#39;immagine IR via. Ricavare la media spettri fo ciascuna delle classi con lo strumento &#39;ROI medio&#39;. </li><li> Confronta spettri derivata riportando in software grafici. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

FT-IR è una modalità emergente gratis-label di imaging biochimica di sezioni di tessuto, con la possibilità di avere un ruolo importante nel migliorare l&#39;attuale standard di diagnosi in patologia. Il gold standard attuale per la patologia richiede tessuti essere sottoposte a biopsia, fissati in formalina, inclusi in paraffina, sezionati più volte, e colorati con diversi macchie. Un patologo altamente qualificato deve valutare soggettivamente visivamente la struttura del tessuto e la morfologia cellulare per stabilire una diagnosi. Qui vi mostriamo come raccogliere immagini a infrarossi ad alta risoluzione dello stesso tipo di sezioni e discutere alcuni degli approcci computazionali per esaminare le differenze chimiche tra i tipi di cellule e stati di malattia. I passaggi critici all&#39;interno di questo protocollo sono di assicurare che i tessuti sono molto attentamente concentrati e che il sistema è ben calibrato per garantire dati spettroscopici di altissima qualità. La cura durante l&#39;installazione del sistema è particolarmente Criti<html> cal quando si lavora con gli obiettivi ad alto ingrandimento. Per facilitare la risoluzione dei problemi, il seguente elenco descrive alcuni dei potenziali difficoltà incontrate; Problema: bassa intensità IR quando l&#39;imaging in riflessione. Soluzione: Verificare l&#39;orientamento diapositiva IR come il rivestimento riflettente può essere dalla parte sbagliata della diapositiva. Problema: segnale basso / rosso segnale di avvertimento in Lancer controllo. Soluzione: rilevatori raffreddare con LN2. È richiesto azoto liquido per i rivelatori FPA per funzionare e richiede periodicamente di essere ricaricato. Problema: Velocity errori errore / movimento. Soluzione: reimpostare spettrometro e ridurre le vibrazioni. Vibrazioni causeranno lo specchio in movimento nel interferometro essere disturbato. Problema: picchi vapore acqueo in dati. Soluzione: Aumentare spurgo sul sistema e proteggere campione d&#39;aria. Problema: centerburst valido. Soluzione: Trova centerburst di nuovo. e_content &quot;&gt; Problema:. bassa differenza di flusso nella trasmissione, anche se concentrato. Soluzione Regolare condensatore basso Ciò si verifica quando la luce IR non viene focalizzato in un punto sul campione. In questo lavoro, ci siamo concentrati su come acquisire immagini ad alta definizione a infrarossi dei tessuti sia in trasmissione o in modalità trasflettanza. La natura dell&#39;imaging FT-IR, è che ci sono molteplici modifiche che possono essere fatte per l&#39;acquisizione dati, ad esempio, il tipo di substrato, tecniche di fissazione, spessore del campione, risoluzione spettrale, interferometro velocità specchio ecc L&#39;effetto di questi parametri ha stato discusso in ampi dettagli recentemente 4,5,17,51. Ci sono un certo numero di modifiche che possono essere apportate al sistema di imaging compreso l&#39;imaging in modalità ATR 10,24,26 e utilizzando approcci termici nanoscala 52,53 per consentire imaging ad alta risoluzione IR. La limitazione principale con alta risoluzione di imaging IR è che la TIUESTIONI devono essere accuratamente preparati e abbastanza sottili per IR per passare (in genere 4 di spessore micron). Inoltre, la trasmissione e riflettanza FT-IR di imaging richiede i campioni ad essere asciutta a causa della assorbanza IR dall&#39;acqua. Tuttavia, imaging FT-IR ha vantaggi significativi rispetto ad altre tecniche, in quanto può immagine molto rapidamente grandi aree di tessuto mentre derivanti ricca e dettagliata informazioni biochimiche. Altre tecniche simili che derivano informazioni biochimiche in un modo libero-label includono la spettroscopia Raman, ma il tempo di acquisizione dei dati è molto più lento di acquisire immagini. Approcci di imaging Nuovo Raman stanno emergendo tra cui diffusione stimolata Raman (SRS) e Coherent Antistokes Raman (CARS); Tuttavia, essi hanno accesso gamma spettrale limitato o di imaging singola frequenza. I progressi nella velocità di acquisizione dei dati, risoluzione spaziale, e la disponibilità di approcci computazionali sono stati di enorme valore nel fare FT-IR imagzione un approccio più fattibile per la traduzione come un nuovo strumento di imaging in patologia. I recenti progressi nella risoluzione spaziale sono stati particolarmente importanti per la patologia dei tessuti a causa di tipi di cellule non siano risolvibili con sistemi di imaging FT-IR convenzionali. Il recente articolo di Reddy et al. mostrato come modellare un sistema ideale per ottenere la risoluzione spaziale ottimale di un sistema di imaging FT-IR 5. L&#39;esempio tessuto renale presentato in questo documento dimostra l&#39;importanza di risoluzioni spaziali elevate per estrarre informazioni biochimiche dalle strutture glomerulari (Figura 3 e Figura 5). In futuro, nuovi progressi in Quantum Cascade Laser come molto luminose sorgenti di luce IR 54-57, 3D immagini spettrali 58, e innovazioni nel campo delle tecnologie su scala nanometrica IR 52,53,59,60 detengono nuovi entusiasmanti percorsi di ricerca che possono avere enormi implicazioni per il futuro di imaging dei tessuti. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Abbiamo presentato esempi di applicazioni in fegato e malattie renali in cui vi è la necessità di informazioni biochimiche aggiuntivo che può essere di valore diagnostico. La Spectral Patologia Lab presso il Dipartimento di Patologia presso la University of Illinois a Chicago si concentra sulla traduzione delle tecnologie di imaging IR per migliorare la diagnosi della malattia e migliorare la previsione della prognosi del paziente. Imaging FT-IR può superare alcuni dei limiti attuali di pratica patologia che richiedono informazioni quantitative e obiettiva. In particolare, il lavoro futuro si concentra sull&#39;identificazione aree in pratica patologia attuale, in cui le tecniche attuali non riescono a fornire un adeguato sensibilità diagnostica o fornire informazioni limitate. Esiste una chiara necessità di migliorare la pratica attuale di patologia e verso dare più informazioni al patologo sullo stato di malattia del paziente, che può essere realizzabile utilizzando ad alta definizione di immagini FT-IR.

Spettroscopia IR è stato uno strumento di analisi disponibili in qualche forma dal 1930; tuttavia, è stato solo nell&#39;ultimo decennio che l&#39;area di imaging dei tessuti con FT-IR è esploso. I progressi nella FT-IR per l&#39;imaging dei tessuti sono stati guidati in gran parte da tre sviluppi fondamentali: 1) aumento della velocità di acquisizione dei dati a causa della disponibilità di grandi Focal Plane Array (FPA) rilevatori che in genere hanno migliaia di IR rivelatori sensibili 1 , 2, 2) lo sviluppo di algoritmi di elaborazione avanzate e la potenza di calcolo per gestire grandi quantità di dati iperspettrali set 3, e 3) la modellazione di sistemi di imaging FT-IR per massimizzare la risoluzione spaziale di 4,5. Ci sono stati numerosi di alta qualità e molto ampi articoli rivedere il campo della spettroscopia FT-IR recentemente 6-16, oltre a un documento di natura protocolli che illustra le fasi per ottenere punto spettri o le mappe da tessuti 17. In questo articolo, ci concentreremo sulla protocol di ottenere immagini di tessuti utilizzando un rivelatore FPA 128 x 128 in un sistema FT-IR modificato con capacità ad alta definizione. Imaging FT-IR è stato a lungo suggerito uno strumento potenzialmente auspicabile per l&#39;imaging cellulare e tissutale dovuta alla capacità di ottenere immagini in cui ogni pixel ha una ricchezza di informazioni biochimiche. Imaging FT-IR si basa sul principio che diverse biomolecole in un campione saranno quantitativamente assorbire diverse regioni del medio infrarosso; questo consente la derivazione di un &#39;impronta digitale biochimico&#39;. Questa impronta digitale era stato dimostrato in molti studi di modificare tra i diversi tipi di cellule e stati di malattia. Diversamente pratica patologia convenzionale quando macchie e marcatori immunoistochimici devono essere utilizzati per la visualizzazione e identificare i tipi cellulari e strutture tissutali che vengono utilizzati per guidare opzioni diagnosi e trattamento, le immagini da FT-IR sono formate sulla base biochimica intrinseca del tessuto. Il techniq attualeue di tessuto colorazione per la diagnosi è in termini di tempo, distruttivo, laborioso, e richiede competenze personale di patologo, mentre FT-IR offre la possibilità di rendere questo processo rapido, non distruttivo, altamente automatizzato, e più obiettivo. Inoltre, FT-IR fornisce un nuovo percorso per ottenere ulteriori informazioni biochimiche che potrebbe non essere prontamente accessibili usando tecniche di colorazione convenzionali. Uno dei progressi più interessanti degli ultimi anni è stata la disponibilità di approcci di imaging ad alta risoluzione che può ora permettere per la visualizzazione e la caratterizzazione di tipi di cellule e strutture del tessuto che sono fondamentali per una completa diagnosi della malattia. Una di queste tecniche è Attenuated Total Reflectance (ATR) FT-IR che incorpora un obiettivo a immersione solido (SIL) di un alto indice di rifrazione, che consente per imaging ad alta risoluzione 18, con molti studi molto interessanti che mostra le sue applicazioni 19-25. Inoltre, wcome ha recentemente dimostrato che la risoluzione spaziale maggiore associato a immagini ATR può permettere per la visualizzazione e la classificazione delle cellule endoteliali e mioepiteliali nel tessuto mammario che costituiscono una componente chiave della diagnosi di cancro al seno 26. Mentre l&#39;imaging ATR è molto utile, questa tecnica richiede la SIL di entrare in contatto con il tessuto per formare immagini FT-IR; Pertanto, il suo uso è un po &#39;limitato per patologia dei tessuti in cui le grandi regioni di tessuti devono essere rapidamente ripreso. Un secondo approccio è stata dimostrata accoppiando un obiettivo ad alto ingrandimento un sistema FT-IR esistente che utilizza un sincrotrone come fonte luminosa di IR, è possibile illuminare completamente un FPA e l&#39;immagine con una dimensione di pixel effettiva di 0,54 x 0,54 micron. Questo ha permesso a noi di visualizzare strutture chiave in seno e della prostata tessuti che non erano risolvibili con sistemi convenzionali FT-IR 4. Mentre questi aumenti drammatici in immagine IR resolutio spazialen fosse emozionante, il suo uso è rimasto limitato a causa di richiedere un sincrotrone. Successivamente, un sistema ottimale creata che potrebbe anche consentire funzionalità di imaging ad alta definizione con una dimensione di pixel 1,1 x 1,1 micron, senza il requisito di una sorgente di sincrotrone bensì utilizzando una sorgente IR Globar tradizionale 5. In questo articolo, vi mostriamo come modificare un sistema di imaging esistente commerciale FT-IR per consentire la diffrazione IR limitato l&#39;imaging dei tessuti con un segnale accettabile per rumore con obiettivi multipli IR (15X, 36X, e 74x). Il formato di pixel effettivi con i tre obiettivi è 5.5 x 5.5 micron (15X), 2,2 x 2,2 micron (36X) e 1.1 x 1.1 micron (74x). Abbiamo poi diamo alcuni esempi dell&#39;importanza dei guadagni in risoluzione spaziale per la rilevazione della malattia in fegato e reni biopsie 27.

<table><tbody><tr><td>Sistema FT-IR Cary serie 600</td><td>Agilent Configurazioni</td><td>multiple&nbsp;</td><td>Esistono sistemi di imaging FT-IR alternativi</td></tr><tr><td>Obiettivo ReflX regolabile 74X/0,65 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-592</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo ReflX regolabile 36X/0,5 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-586</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino MirrIR</td><td>Kevley Technologies</td><td>CFR</td><td>Per misure in modalità di riflessione FT-IR</td></tr><tr><td>Vetrini al fluoruro di bario</td> International <td>Crystal Laboratories</td><td>Dimensioni multiple</td><td>Per misure in modalità di trasmissione FT-IR</td></tr><tr><td>Vetrini al fluoruro di calcio</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Dimensioni multiple</td><td>Per misurazioni in modalità di trasmissione FT-IR</td></tr><tr><td>Azoto secco/Gas aria secca</td><td>Fornitori di gas multipli</td><td>Dimensioni</td><td></td>multiple</tr><tr><td>Esano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Dimensioni multiple</td><td>Per la deparafinizzazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Azoto liquido Fornitori</td><td>multipli di liquidi criogenici</td> Dimensioni <td>multiple</td><td></td></tr><tr><td>Software ENVI-IDL</td><td>Exelis-Vis</td><td></td><td>Altri pacchetti software disponibili</td></tr><tr><td>Imager per vetrini interi Scanscope</td><td>(Aperio) o Nanozoomer (Hamamatsu)</td><td></td><td>Per visualizzare vetrini colorati</td></tr></tbody></table>

alta definizione fourier transform infrared (ft-ir) spettroscopica imaging di sezioni di tessuto umano verso migliorare patologia

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Alta definizione Fourier Transform Infrared (FT-IR) di imaging spettroscopico è un approccio emergente per ottenere immagini dettagliate che sono associate informazioni biochimiche. Imaging FT-IR di tessuto si basa sul principio che diverse regioni del medio infrarosso sono assorbiti dai diversi legami chimici (ad esempio, C = O, CH, NH) all&#39;interno delle cellule o tessuti che possono poi essere legati alla presenza e alla composizione di biomolecole (ad esempio, lipidi, DNA, glicogeno, proteine, collagene). In un&#39;immagine FT-IR, ogni pixel all&#39;interno dell&#39;immagine comprende un intero infrarossi (IR) dello spettro che può dare informazioni sullo stato biochimico delle cellule che possono essere sfruttati per tipo cellulare o malattia tipo di classificazione. In questo articolo, vi mostriamo: come ottenere immagini a infrarossi da tessuti umani mediante un sistema di FT-IR, come modificare la strumentazione esistente per consentire la funzionalità di imaging ad alta definizione, e come visualizzare le immagini FT-IR. Abbiamo poi presentiamo alcune applicazioni di FT-IRper patologia utilizzando il fegato ei reni come esempi. Imaging FT-IR detiene applicazioni interessanti nel fornire un percorso romanzo di ottenere informazioni biochimiche dalle cellule e tessuti in un percorso che non generi completamente libero-label verso dando nuova visione cambiamenti biomolecolari come parte di processi di malattia. Inoltre, queste informazioni biochimiche può potenzialmente consentire un&#39;analisi obiettiva e automatizzato di alcuni aspetti della diagnosi della malattia.

Imaging FT-IR consente la derivazione di immagini IR di tessuto che possono dare diversi contrasti seconda della frequenza IR di interesse. Inoltre, in un&#39;immagine IR, ogni pixel comprende l&#39;intero spettro IR, con differenti picchi corrispondenti a differenti biomolecole che possono dare informazioni sulle proprietà biochimiche di tipi cellulari o stati di malattia (Figura 1). Qui, abbiamo dimostrato come confrontare le firme spettrali tra le classi, ma più avanzato classificazione automatica è possibile utilizzando algoritmi aggiuntivi 3,43-50, quali la classificazione bayesiana, foreste casuali, reti neurali artificiali e gerarchiche Cluster Analysis è possibile eseguire sul dati. Approcci classificazione supervisionata consentiranno per la costruzione di un classificatore che può essere addestrato per consentire il riconoscimento automatico di tipi cellulari o stati di malattia. Approcci classificazione non supervisionata possono essere utilizzati per cercare naturale difrenze nei tessuti o cellule a causa della varianza biochimica. Strumentazione FT-IR si è evoluta nel corso degli ultimi decenni, dalla misurazione in un unico punto modalità / mapping tramite IR aperture opachi alla modalità di imaging con obiettivi Cassegrain, utilizzando un obiettivo illuminante accoppiato con un obiettivo di raccolta nella trasmissione-mode o un unico obiettivo che entrambi illumina e raccoglie in riflessione-mode (Figura 2). È stato recentemente dimostrato che l&#39;obiettivo di raccolta in trasmissione potrebbe essere commutata per un ingrandimento maggiore e oggettivo apertura numerica per consentire diffrazione limitata immagini IR, che porta a sostanziali aumenti la risoluzione spaziale delle immagini IR raccolti 4,5. I progressi nella risoluzione spaziale per l&#39;imaging dei tessuti sono stati di fondamentale importanza come ora siamo in grado di identificare i tipi di cellule e strutture del tessuto, per esempio, le unità funzionali del rene, i glomeruli, utilizzando adattato in-houseSistemi FT-IR (Figura 3). Ad alta definizione di immagini FT-IR consente di ottenere immagini dettagliate di tessuti da esaminare per identificare le regioni anormali e di identificare le differenze biochimiche tra diversi tipi di cellule. In un nucleo tessuto epatico, è possibile visualizzare epatociti e regioni di infiltrazione fibrosi che divide due distinte aree di displasia e cirrosi non displastiche (Figura 4). Stiamo lavorando per sfruttare questo per rendere gli strumenti diagnostici automatizzati per l&#39;utilizzo in casi difficili di malattia del fegato. È importante sottolineare che la maggiore risoluzione spaziale può ora permettere di isolare specifiche caratteristiche strutturali che possono essere modificati chimicamente dalla malattia prima alterazioni istologiche sono evidenti. Ad esempio, siamo concentrati sull&#39;identificazione cambiamenti biochimici nelle strutture glomerulari renali come capsula di Bowman, mesangio, membrana basale glomerulare e membrana tubolare seminterrato, prima<html> modifiche individuate dal patologo può essere osservato (Figura 5). In particolare, siamo interessati a individuare cambiamenti associati con la progressione della nefropatia diabetica e rigetto cronico nei pazienti sottoposti a trapianto, dove le tecniche attuali non riescono a identificare i cambiamenti in modo abbastanza presto per un intervento di successo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" /> Figura 1. immagini FT-IR e spettro di un nucleo fegato. Immagine di (A) H &amp; E macchiato nucleo da biopsia epatica e immagini di assorbanza IR della sezione di serie della stessa core a (B) 3.286 centimetri -1 e (C) 2.603 cm -1, che ha evidenziato diverse caratteristiche strutturali. (D) tipico spettro IR del tessuto, con picchi importanti etichettati. Bar Scala = 100 micron.fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" /> Figura 2. Ottica dettaglio i modi di funzionamento microscopio FT-IR schematici. (A) in modalità di trasmissione, il campione è illuminato attraverso l&#39;obiettivo di fondo, e la luce che passa attraverso il campione viene raccolto dall&#39;obiettivo top. (B) In modalità di riflessione, l&#39;obiettivo prioritario serve sia per illuminare il campione e per raccogliere la luce riflessa. L&#39;obiettivo di fondo non viene utilizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" /> Figura 3. Confronto di different obiettivi del microscopio sulle immagini FT-IR di un glomerulo renale a 2.925 centimetri -1. (A) 15X oggettivi raccolta con NA = 0.5 (dimensioni 5.5 x 5.5 micron pixel). (B) 36X obiettivo di raccolta con NA = 0.5 (dimensioni 2,2 x 2,2 micron pixel). (C) 74x raccolta obiettivo con NA = 0,65 (dimensioni 1,1 x 1,1 micron pixel). Bar Scala = 50 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" /> Figura 4. differenze spettrali tra fibrosi e epatociti in un nucleo del fegato. (A) H &amp; E macchiato nucleo da biopsia epatica. (B) L&#39;immagine di un nucleo sezione seriale digitalizzata in FT-IR (36X impostazione oggettiva). (C) Repspettri rappresentativi della epatociti e fibrosi, presi dalle regioni di tessuto indicati dalle frecce in (A) e (B). Scala bar = 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" /> Figura 5. La differenziazione delle caratteristiche biopsia del tessuto renale attraverso l&#39;uso di imaging ad alta definizione FT-IR. (A) periodica sezione colorata acido Schiff con le caratteristiche da estrarre etichettato. (B) ad alta definizione FT-IR immagine della regione che si estende CH 2 asimmetrica (36X configurazione oggettiva) di una sezione di serie del tessuto stesso. (C) Caratteristiche etichettato (A) estratto utilizzando l&#39;immagine FT-IR in (B) per poter chimicamente differentiate le quattro caratteristiche del tessuto. Bar Scala = 50 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

'L'imaging spettroscopico a infrarossi in trasformata di Fourier (FT-IR) è un approccio rapido e senza etichette per ottenere set di dati biochimici di cellule e tessuti. Qui, dimostriamo come ottenere immagini FT-IR ad alta definizione di sezioni di tessuto per migliorare la diagnosi della malattia.

Alta definizione Fourier Transform Infrared (FT-IR) spettroscopica Imaging di sezioni di tessuto umano verso Migliorare Patologia

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere immagini infrarosse ad alta definizione di campioni di tessuto. Questo risultato si ottiene innanzitutto sezionando i campioni di tessuto su vetrini compatibili con l'infrarosso. Il secondo passaggio consiste nell'allestire un apparato di imaging ad alta definizione installando le ottiche appropriate.Successivamente, viene acquisito il fondo del substrato e viene eseguita la scansione del campione di tessuto. L'ultimo passaggio consiste nell'utilizzare un software appropriato per l'elaborazione e la visualizzazione dei dati. Infine, l'imaging infrarosso ad alta definizione viene utilizzato per visualizzare e ottenere informazioni biochimiche dai tessuti biologici in modo non disturbante.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia ottica, è che la biochimica intrinseca del tessuto può essere studiata senza l'uso di coloranti o sonde. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della patologia, come la previsione della ricorrenza della nefropatia diabetica e la classificazione del decorso delle malattie epatiche attraverso l'osteogenesi car HEPA. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi e prognosi delle malattie, poiché fornisce ampie quantità di informazioni biochimiche non disponibili nella tradizionale istopatologia.Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per la diagnosi, può anche essere impiegato per monitorare i cambiamenti nel processo di guarigione delle ferite e identificare caratteristiche tissutali chiave come le cellule staminali nel tratto gastrointestinale e nel cervello. Prima sezione di un blocco di tessuto fissato in formalina e inclusi in paraffina, tagliata a uno spessore di quattro micrometri su un vetrino compatibile con l'IR utilizzando un microtomo.Successivamente, purgare il microscopio e lo spettrometro FTIR utilizzando aria secca per rimuovere l'acqua atmosferica dal sistema. Quindi raffreddare sia il rivelatore a matrice piano focale sia il rivelatore interno al mercurio cadmio tellururo nel microscopio mediante azoto liquido. Montare il vetrino del campione sullo stativo del microscopio per l'analisi FTIR dopo aver verificato che la luce visibile sia accesa, quindi mettere a fuoco il campione utilizzando il programma di acquisizione del campione.Successivamente, aprire il pacchetto software del bundle e fare clic su "collect". Fare clic su "diagnostics" e selezionare uno spettrometro a linea. Quindi fare clic su "imaging setup" per calibrare il sistema.Nella scheda ottica, selezionare il rilevatore come rilevatore microscopico a terra a sinistra, quindi selezionare la trasmittanza nella modalità ottica. Fare clic su impostazione, che aprirà la finestra di controllo lancer per la modalità di trasmissione nel controllo lancer. Cliccare su raw utilizzando il joystick di controllo dello stadio e, osservando la vista in tempo reale dell'immagine dell'interferogramma FTIR, spostarsi verso un'area pulita del vetrino.A questo punto, regolare il tempo di integrazione a circa 8.000 conteggi e l'obiettivo condensatore inferiore. Per aumentare il numero di conteggi al suo valore massimo, osservare la forma dell'immagine in basso a destra nel controllo di lancer per assicurarsi che abbia un aspetto gaussiano e relativamente uniforme. Dopo aver regolato il tempo di integrazione, spostare nuovamente la piastra per individuare un frammento di tessuto con struttura, preferibilmente il margine di un tessuto.Quindi perfezionare il fuoco dell'immagine. Utilizzando il joystick di controllo del palchetto, spostarsi in un'area pulita del vetrino. Premere il pulsante di calibrazione dopo aver effettuato la selezione.Ok, due volte nella scheda ottica, selezionare rivelatore uguale a MCT e rivelatore del microscopio uguale a destro. Quindi fare clic su impostazione. Una volta che l'interferogramma FTIR è visualizzato sullo schermo, fare clic su trova centro burst e ok.Nella scheda ottica, riselezionare rilevatore uguale a rilevatore del microscopio a scansione uguale a sinistro. Quindi selezionare configurazione. Dopo aver verificato che l'immagine sia ancora su un'area pulita nel controllo del lancer, fare clic nuovamente su calibra e su ok.Per acquisire un'immagine FTIR di fondo, andare alla scheda elettronica e selezionare una risoluzione spettrale appropriata, tipicamente di quattro o otto centimetri inversi. Per i tessuti, andare alla scheda di fondo e digitare 128 nei cicli di scansione da accumulare. Selezionare il pulsante per un nuovo file e salvare il file di fondo nella cartella appropriata.Dopo aver fatto clic su sfondo e aver atteso il completamento della scansione, confermare dove salvare il file. Fare clic su una regione dello sfondo, dell'immagine FTIR e verificare lo spettro. A questo punto, fare clic su impostazione e, nel controllo lancer, utilizzare la vista IR in tempo reale.Per individuare l'area di interesse, accedere alla scheda elettronica e digitare il numero di scansioni da accumulare. Quindi fare clic su "scan". Per preparare il microscopio FTIR all'analisi ad alta definizione, avvitare l'obiettivo ad alto ingrandimento al posto dell'obiettivo da 15x. A questo punto, aprire il software di elaborazione e analisi delle immagini e caricare il file di dati IR.Applica un algoritmo di correzione della linea di base ai dati IR selezionando gli strumenti spettrali, scorri verso il basso e fai clic su spettri assorbenti. Quando appare il menu a comparsa, seleziona correzione della linea di base. Esegui la normalizzazione spettrale selezionando spettri normalizzati tra le opzioni del menu spettri assorbenti.In seguito, osservare un elenco di tutte le frequenze IR raccolte all'interno dell'immagine. Fare clic sulle frequenze corrispondenti a biomolecole specifiche per osservare un'immagine del tessuto alla frequenza selezionata, creando immagini che permettono la visualizzazione di diversi componenti biomolecolari. Fare clic su strumenti spettrali e quindi selezionare i rapporti tra altezze dei picchi.Scansionare la sezione di tessuto colorata corrispondente adiacente utilizzando un sistema separato di imaging di intere diapositive che acquisisce immagini in campo chiaro insieme all'immagine IR. Aprire l'immagine digitale del tessuto colorato con il programma per immagini visibili. Successivamente, fare clic con il tasto destro sull'immagine in una regione di interesse e selezionare il profilo Z per ottenere le informazioni spettrali nel pixel selezionato.Per contrassegnare pixel specifici nell'immagine, fare clic con il tasto destro sull'immagine e selezionare lo strumento ROI. Creare le classi da etichettare, ad esempio le classi Meum e capsula di Bowman. Successivamente, selezionare il tipo di ROI "punto"; a questo punto, scegliere la classe per cui selezionare i pixel e disegnare sui pixel appropriati nell'immagine IR.Derivare gli spettri medi per ciascuna delle classi utilizzando lo strumento di media delle aree di interesse (ROI). Infine, confrontare gli spettri ottenuti tramite rappresentazione grafica. In un software di grafica, l'imaging FT IR consente di ottenere immagini IR del tessuto che possono fornire contrasti diversi a seconda della frequenza IR.Ogni pixel è composto dall'intero spettro con picchi diversi corrispondenti a diverse biomolecole che possono fornire informazioni sulle proprietà biochimiche dei tipi cellulari o degli stati patologici. Lo strumento FTIR si è evoluto passando dalla misurazione in modalità mappatura a singolo punto mediante diaframmi opachi alla modalità di imaging mediante obiettivi per grani CASA, utilizzando o un obiettivo illuminante abbinato a un obiettivo raccoglitore in modalità trasmissione, oppure un singolo obiettivo che illumina e raccoglie in modalità riflessione. I progressi nella risoluzione spaziale per l'imaging dei tessuti sono stati di fondamentale importanza poiché ora è possibile identificare i tipi cellulari e le strutture tissutali.In questo caso, le unità funzionali dei glomeruli renali sono state osservate in un campione di tessuto epatico. È possibile visualizzare epatociti e aree di fibrosi infiltrativa che dividono due aree distinte di displasia e cirrosi non displastica. Un'elevata risoluzione spaziale consente l'isolamento di specifiche caratteristiche strutturali che possono essere modificati chimicamente dalla malattia prima che si manifestino cambiamenti istologici.Modifiche biochimiche nelle strutture glomerulari renali, come la capsula di Bowman, il mesangio, la membrana basale glomerulare e la membrana basale tubulare, possono essere identificate mediante imaging FTIR. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di disidratare completamente i vetrini prima della scansione, seguendo questo protocollo. Altri metodi, come l'analisi immunoistochimica tradizionale, possono essere eseguiti sulla stessa sezione di tessuto al fine di correlare le firme biochimiche con la morfologia tissutale.Il nostro primo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'imaging tissutale per esplorare lo stato biomolecolare di piccoli tipi cellulari e strutture all'interno dei tessuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione di base su come ottenere immagini FTR ad alta definizione di campioni tissutali ed eseguire un'analisi spettrale di base. Non dimenticare che lavorare con azoto liquido può essere estremamente pericoloso e che precauzioni di sicurezza, come guanti criogenici e occhiali protettivi, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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