Alta definizione Fourier Transform Infrared (FT-IR) spettroscopica Imaging di sezioni di tessuto umano verso Migliorare Patologia

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere immagini a infrarossi ad alta definizione di campioni di tessuto. Ciò si ottiene sezionando prima i campioni di tessuto su vetrini compatibili con gli infrarossi. Il secondo passo consiste nell'allestire un apparato di imaging ad alta definizione installando gli obiettivi appropriati.

Successivamente, viene raccolto lo sfondo del substrato e il campione di tessuto viene scansionato. Il passaggio finale consiste nell'utilizzare un software appropriato per l'elaborazione e la visualizzazione dei dati. In definitiva, l'imaging a infrarossi ad alta definizione viene utilizzato per visualizzare e ottenere informazioni biochimiche dai tessuti biologici in modo non perturbante.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia ottica, è che la biochimica intrinseca del tessuto può essere studiata senza l'uso di coloranti o sonde. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla patologia del campo, come la previsione della recidiva della nefropatia diabetica e la classificazione della progressione della malattia epatica attraverso l'osteogenesi dell'auto HEPA. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi e alla prognosi della malattia, dato che fornisce grandi quantità di informazioni biochimiche non disponibili dall'istopatologia tradizionale.

Anche se questo metodo può essere utilizzato per la diagnosi. Può anche essere utilizzato per monitorare i cambiamenti nel processo di guarigione delle ferite e identificare le caratteristiche chiave dei tessuti come le cellule staminali nel tratto gastrointestinale e nel cervello. Prima sezione di un blocco di tessuto formale e fissato incorporato in paraffina a quattro micrometri di spessore su un vetrino compatibile con IR utilizzando un microtomo.

A seguito di ciò. Spurgare il microscopio FTIR e lo spettrometro utilizzando aria secca per rimuovere l'acqua atmosferica dal sistema. Quindi raffreddare sia il rivelatore a matrice sul piano focale che il rivelatore interno di tellururo di mercurio e cadmio nel microscopio utilizzando azoto liquido, montare il vetrino del campione sul tavolino del microscopio per l'imaging FTIR dopo essersi assicurati che la luce visibile sia accesa, mettere a fuoco il campione utilizzando il programma di acquisizione del campione.

Quindi, apri il pacchetto software e fai clic su Raccogli. Fare clic su diagnostica e selezionare uno spettrometro lineare. Quindi fare clic su configurazione imaging per calibrare il sistema.

Nella scheda ottica, selezionare il rivelatore come rivelatore al microscopio a terra come a sinistra, quindi selezionare la trasmittanza in modalità ottica. Fare clic su configurazione, che aprirà la finestra di controllo del lancer per la modalità di trasmissione nel controllo del lancer. Fare clic su raw utilizzando il joystick di controllo del tavolino e guardare la visualizzazione dal vivo dell'immagine dell'interferogramma FTIR spostarsi in un'area pulita della diapositiva.

A questo punto, regolare il tempo di integrazione a circa 8.000 conteggi e l'obiettivo del condensatore inferiore. Per aumentare il numero di conteggi al massimo, osservare la forma dell'immagine in basso a destra nel controllo lancer per assicurarsi che sia di aspetto gaussiano e relativamente uniforme. Dopo aver regolato il tempo di integrazione, di nuovo, sposta il tavolino per trovare un pezzo di tessuto con una struttura, preferibilmente il bordo di un tessuto.

Quindi perfeziona la messa a fuoco dell'immagine. Utilizzando il joystick di controllo del tavolino, spostarsi in un'area pulita dello scivolo. Premere il pulsante di calibrazione dopo aver selezionato.

Ok, due volte Nella scheda ottica, selezionare il rivelatore è uguale a MCT e il rivelatore del microscopio è uguale a destra. Quindi fare clic su configurazione. Una volta visualizzato l'interferogramma FTIR sullo schermo, fare clic su trova raffica centrale e va bene.

Nella scheda ottica, riselezionare il rivelatore uguale al rivelatore del microscopio a terra uguale a sinistra. Quindi seleziona configurazione. Dopo esserti assicurato che l'immagine sia ancora su un'area pulita nel controllo della lancer, fai nuovamente clic su Calibra e va bene.

Per raccogliere un'immagine FTIR di sfondo, vai alla scheda elettronica e seleziona una risoluzione spettrale appropriata, che in genere è di quattro o otto centimetri inversi. Per il tessuto, vai alla scheda dello sfondo e digita 128 nelle scansioni per il calcolo. Seleziona il pulsante Nuovo file e posiziona il file di sfondo nella cartella appropriata.

Dopo aver fatto clic su sfondo e aver atteso il completamento della scansione, conferma dove salvare il file. Fai clic su una regione sullo sfondo, sull'immagine FTIR e controlla lo spettro. A questo punto, fare clic su configurazione e, nel controllo lancer, utilizzare la vista IR in tempo reale.

Per trovare l'area di interesse, vai alla scheda elettronica e digita il numero di scansioni da coad. Per preparare il microscopio FTIR per l'analisi ad alta definizione, avvitare l'obiettivo ad alto ingrandimento al posto dell'obiettivo 15x. A questo punto, aprire il software di elaborazione e analisi delle immagini e caricare il file di dati IR.

Applicare un algoritmo di correzione della linea di base ai dati IR selezionando gli strumenti spettrali, quindi scorrere verso il basso e fare clic su spettri assorbenti. Quando viene visualizzato il menu a tendina, selezionare la correzione della linea di base. Eseguire la normalizzazione spettrale selezionando gli spettri normalizzati nelle opzioni del menu degli spettri assorbenti.

Successivamente, osservare un elenco di tutte le frequenze IR raccolte all'interno dell'immagine. Fare clic sulle frequenze che corrispondono a specifiche biomolecole per osservare un'immagine del tessuto alla frequenza selezionata per creare immagini che consentiranno la visualizzazione di diversi componenti biomolecolari. Fare clic su strumenti spettrali e quindi selezionare i rapporti di altezza del picco.

Scansiona la sezione di tessuto colorata adiacente corrispondente utilizzando un sistema di imaging separato per vetrini interi che acquisisce immagini in campo chiaro insieme all'immagine IR. Visualizzare l'immagine digitale del tessuto colorato con il programma di immagini visibili. Quindi, fai clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine in una regione di interesse e seleziona il profilo Z per fornire le informazioni spettrali al pixel selezionato.

Per contrassegnare pixel specifici sull'immagine, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e selezionare lo strumento ROI. Crea le classi che devono essere etichettate, ad esempio, le classi capsula di Meum e Bowman. Quindi seleziona il punto di tipo ROI in seguito, seleziona la classe per cui selezionare i pixel e disegna sui pixel appropriati sull'immagine IR.

Ricava gli spettri medi per ciascuna delle classi utilizzando lo strumento ROI medio. Infine, confrontare gli spettri derivati mediante tracciamento. Nei software di grafica, l'imaging FT IR consente la derivazione di immagini IR di tessuti che possono fornire contrasti diversi a seconda della frequenza IR.

Ogni pixel è composto dall'intero spettro con diversi picchi corrispondenti a diverse biomolecole che possono fornire informazioni sulle proprietà biochimiche dei tipi di cellule o sugli stati patologici. La strumentazione FTIR si è evoluta dalla misurazione in una modalità di mappatura a punto singolo utilizzando aperture opache alla modalità di imaging utilizzando obiettivi a grana CASA utilizzando un obiettivo illuminante, accoppiato con un obiettivo di raccolta in modalità di trasmissione, o un singolo obiettivo che illumina e raccoglie in modalità di riflessione. I progressi nella risoluzione spaziale per l'imaging tissutale sono stati di fondamentale importanza in quanto è ora possibile identificare i tipi di cellule e le strutture tissutali.

In questo caso, le unità funzionali dei glomeruli renali sono state osservate in un nucleo di tessuto epatico. E' possibile visualizzare gli epatociti e le regioni di fibrosi infiltrante che dividono due aree distinte di displasia e cirrosi non displasia. L'aumento della risoluzione spaziale consente l'isolamento di specifiche caratteristiche strutturali che possono essere modificate chimicamente dalla malattia prima che siano evidenti i cambiamenti istologici.

I cambiamenti biochimici nelle strutture glomerulari renali come la capsula di Bowman, il meum, la membrana basale glomerulare e la membrana basale tubulare possono essere identificati attraverso l'imaging FTIR. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di declassare completamente le diapositive prima di eseguire la scansione Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'analisi immunochimica tradizionale, possono essere eseguiti sulla stessa sezione di tessuto al fine di correlare le firme biochimiche e la morfologia del tessuto.

Il nostro primo sviluppo, questa tecnica, ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'imaging tissutale per esplorare lo stato biomolecolare di piccoli tipi di cellule e strutture all'interno dei tessuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una conoscenza di base su come ottenere immagini FTR ad alta definizione di campioni di tessuto ed eseguire analisi spettrali di base. Non dimenticare che lavorare con l'azoto liquido può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni di sicurezza, come guanti criogenici e occhiali protettivi.