Umano cellule staminali pluripotenti Basato Tossicità per lo sviluppo saggi per Chemical Screening e Safety Systems Biology generazione dati

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di descrivere due sistemi di test di tossicità per lo sviluppo in vitro basati su cellule staminali embrionali umane e studi sul trascrittoma. Ciò si ottiene coltivando prima cellule staminali embrionali umane su fibroblasti embrionali di topo. Il secondo passo consiste nel lasciare che le cellule staminali embrionali umane formino corpi di Embry in cui possono generare cellule di tutti e tre gli strati germinali o differenziarle in progenitori neuroectodermici.

Successivamente, i corpi embrionali o progenitori neuroectodermici vengono trattati con composti di interesse a diverse concentrazioni durante la differenziazione. I passaggi finali consistono nel valutare la vitalità delle cellule e isolare l'RNA. In definitiva, l'analisi dei microarray del trascrittoma viene utilizzata per mostrare i cambiamenti nell'espressione dell'RNA delle cellule trattate con un composto di interesse rispetto alle cellule di controllo non trattate. Sulla base di cellule staminali neoniche umane e macro aree di DNA, abbiamo stabilito una metodologia in vitro che consente il monitoraggio degli effetti rilevanti della tossicità per lo sviluppo umano.

La metodologia può essere applicata dall'industria farmaceutica e chimica per lo screening di sicurezza di potenziali farmaci e sostanze tossiche per l'ambiente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tossicità dello sviluppo, come l'effetto delle sostanze chimiche sul neurosviluppo molto precoce. Per iniziare, scongelare l'integratore di terreno di cellule staminali a temperatura ambiente e aggiungerne 100 millilitri in 400 millilitri di terreno di cellule staminali basali.

Quindi, scongelare la matrice della membrana basale su ghiaccio, quindi aggiungere il volume integrato di matrice in 24 millilitri di dmm refrigerato. F 12 terreno basale come raccomandato dal produttore, miscelato una soluzione pipettando delicatamente su e giù, quindi aggiungere due millilitri di miscela in 12 piastre separate da sei centimetri. Incubare le piastre a temperatura ambiente per un'ora mentre la matrice ricopre le piastre.

Quindi rimuovere il terreno e aggiungere due millilitri di terreno di coltura con cellule staminali. Quindi, rimuovere quattro piastre confluenti dall'incubatrice contenente embrionale umano. H nove cellule cresciute su strati di alimentazione di fibre embrionali di topo che vengono preparate come descritto nel protocollo intext di accompagnamento sotto uno stereoscopio, utilizzare una punta di pipetta da un millilitro e rimuovere le colonie differenziate dalla piastra.

Le colonie indifferenziate hanno bordi ben definiti e le cellule sono compatte, mentre le cellule differenziate iniziano a propagarsi dai bordi e le loro celle sono di dimensioni maggiori. Aspirare il terreno e lavare le cellule con quattro millilitri di PBS. Quindi aggiungere due millilitri di terreno di cellule staminali con gli otto di uno stereoscopio.

Tagliare le colonie in sei-nove pezzi ciascuno con un ago da 26 gauge e raschiare i grumi con punte di pipette da un millilitro. Raccogliere delicatamente le colonie tagliate in un tubo di falco da 50 millilitri e pellettare a 200 g per cinque minuti. Quindi, aspirare la trappola e risospendere le cellule in 12 millilitri di terreno di cellule staminali.

Posizionare 20 microlitri di sospensione cellulare su un vetrino e contare il numero di grumi al microscopio. Regolare la concentrazione della sospensione a 150 ciuffi per millilitro e quindi aggiungere due millilitri di sospensione in ciascuna piastra da sei centimetri. Spostare le piastre avanti e indietro e da un lato all'altro per distribuire uniformemente le cellule, quindi incubare le piastre in un incubatore per colture cellulari a giorni alterni.

Cambiare con cura il terreno Dopo aver rimosso le colonie differenziate, aggiungere 40 microlitri di una soluzione sterile di copolimero a blocchi al 5% a ciascun pozzetto di una piastra Vbo a 96 pozzetti e lasciarla incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. Rimuovere una piastra confluente contenente colonie dall'incubatrice e selezionare eventuali colonie differenziate con uno stereomicroscopio con una punta di pipetta da un millilitro. Quindi aspirare il terreno dalla piastra e lavare delicatamente le cellule con quattro millilitri di PBS.

Quindi, aggiungere due millilitri di terreno di differenziazione casuale a ciascuna piastra. Utilizzare lo strumento di passaggio per tagliare le colonie di nove cellule H in grumi di dimensioni uniformi. Raschiare i grumi con un raschietto cellulare e raccoglierli delicatamente in una centrifuga a provette falcon da 50 millilitri.

La colonia si aggrega a 200 G per cinque minuti, quindi aspira la trappola e risospende la cellula e il mezzo di differenziazione casuale a 1000 grumi per millilitro. Quindi, aspirare il copolimero a blocchi dalla piastra a 96 pozzetti con fondo a V Con l'aiuto di una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di sospensione di colonia a ciascun pozzetto, aggregare i grumi sul fondo dei pozzetti a forma di V centrifugando la piastra a quattro gradi Celsius per quattro minuti a 400 G.Quindi posizionare una piastra nell'incubatore per quattro giorni utilizzando puntali da 200 microlitri di diametro più largo. Rimuovere i corpi embrionali dalla piastra a 96 pozzetti e metterli in una piastra quadrata sterile da 122 millimetri.

Successivamente, utilizzare una pipetta sierologica sterile da 10 millilitri per trasferire i corpi embrionali dalla piastra quadrata in una provetta di falco da 15 millilitri. Lasciare riposare i corpi embrionali per due minuti, quindi aspirare la trappola e lavare i corpi embrionali con cinque millilitri di PBS. Ancora una volta, attendi che i corpi embrionali si stabilizzino per due minuti e poi aspira il surnatante.

Questa volta risospendere i corpi embrionali in cinque millilitri di terreno di differenziazione casuale. Successivamente, trasferire i corpi embrionali in una piastra batteriologica di 10 centimetri e aggiungere altri 10 millilitri di differenziazione casuale. Medio. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 su un agitatore orizzontale.

A 50 giri/min, i corpi embrionali rappresentativi vengono mostrati per il giorno cinque, il giorno nove e il giorno 14. Cambiare con cura il mezzo a giorni alterni, sostituendo tutti i 15 millilitri con una nuova differenziazione casuale. Medio. Per valutare l'effetto di un farmaco sulla differenziazione, iniziare ad aggiungere il farmaco al terreno al quinto giorno per 10 giorni come descritto nel protocollo di testo allegato.

Utilizzando una pipetta sterile, raccogliere i corpi embrionali dalle piastre da 10 centimetri in una provetta di falco da 15 millilitri. Lasciarli riposare per due minuti, quindi aspirare il surnatante. Lavateli con cinque millilitri di PBS e trasferiteli in una provetta da 1,5 millilitri priva di nucleasi.

Lasciali riposare e aspirare il rullante. Sospendi i corpi embrionali in un millilitro di reagente triolo e fai passare una soluzione attraverso un ago calibro 24 con una siringa da un millilitro circa 15 volte per distruggere le cellule. Quindi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio a ciascun campione.

Agitare brevemente il contenuto, quindi centrifugare i campioni a 12.000 G per 15 minuti A quattro gradi Celsius, raccogliere il surnatante in provette da 1,5 millilitri senza disturbare gli altri strati. Quindi aggiungere un volume uguale di etanolo refrigerato al 70% al surnatante e mescolare delicatamente il contenuto agitando. Trasferire 700 microlitri della miscela in una mini colonna di centrifuga e seguire le istruzioni del produttore per purificare l'RNA nella fase finale di eluizione.

Applicare 22 microlitri di acqua priva di nucleasi sulla colonna di centrifugazione e centrifugare le provette a 12.000 G per un minuto. Quindi rimuovere la provetta di raccolta e mettere l'RNA sul ghiaccio. Aggiungere un millilitro di spazio per il disco di preriscaldamento per ogni pallone confluente T 25 di H nove celle e incubare il pallone per nove minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi aggiungere due millilitri di preriscaldamento. Lavare il terreno fino alle cellule trattate spostate e pipettare delicatamente su e giù cinque volte con una pipetta da cinque millilitri. Trasferire la soluzione cellulare in una provetta di falco.

Quindi, lavare il pallone con nove millilitri di terreno di lavaggio e aggiungerlo al tubo con le celle. PT il raccogliere le sue cellule per tre minuti e mezzo a 500 G.Quindi rimuovere la trappola e risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno di lavaggio. Ripetere le cellule per tre minuti e mezzo a 500 G, quindi rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in quattro millilitri di terreno di cellule staminali embrionali umane, aggiungere 0,5 ml di sospensione cellulare e 4,5 millilitri di terreno fresco in un pallone T 25 fresco lavato con PBS contenente fibroblasti embrionali di topo inattivati mitoticamente.

Cambiare il mezzo nel pallone ogni giorno. Rivestire un piatto da 10 centimetri con lo 0,1% di gelatina in PBS e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi raccogliere una cellula staminale embrionale umana rimuovendo il terreno e aggiungere un millilitro di acuta al pallone T 25 mentre le cellule si stanno staccando.

Aggiungere 6,6 millilitri di terreno freddo a 330 microlitri di matrice di membrana basale congelata. Filtrare la soluzione attraverso un colino cellulare da 40 micrometri e utilizzare un millilitro della soluzione filtrata per coprire ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Le cellule verranno successivamente piastrate sulle piastre rivestite dopo l'incubazione di 30 minuti delle cellule embrionali umane con Accutane, interrompendo la reazione aggiungendo 1,5 millilitri di terreno Hess.

Raschiare le cellule dal pallone e poi aggiungere altri otto millilitri di terreno Hess. Produrre una soluzione a singola cellula pipettando delicatamente su e giù con una pipetta da 10 millilitri le cellule filtranti attraverso un colino cellulare da 40 micrometri, quindi centrifugare le cellule per tre minuti A 500 g, rimuovere il surnatante S e risospendere le cellule in 10 millilitri di celle a spin medio di nuovo per tre minuti a 500 g.Quindi rimuovere il surnatante e il reus. Sospendere le cellule in 10 millilitri di terreno Hess S contenente l'inibitore della roccia Y 2 7 6 3 2 a una concentrazione finale di 10 micromolari.

Quindi, rimuovere il surnatante dalla piastra del piatto rivestita di gelatina, la sospensione cellulare sul piatto rivestito di gelatina e incubare per un'ora esatta a 37 gradi Celsius. Durante queste fasi, l'ipoplasto si depositerà sulle piastre rivestite di gelatina dove le cellule staminali embrionali umane rimarranno libere. Il tempo di galleggiamento è fondamentale in quanto una lunga incubazione provocherà l'aggregazione delle cellule staminali e una breve incubazione rimuoverà solo alcuni di questi fibroblasti quando i fibroblasti si sono attaccati.

Utilizzare il terreno nella piastra per lavare delicatamente le cellule staminali non aderenti dalla piastra. Lavare la piastra una seconda volta con 10 millilitri di terreno Hess e raggruppare le cellule, centrifugare le cellule per tre minuti a 500 G, rimuovere il surnatante S risultante e risospendere le cellule in circa quattro millilitri di terreno condizionato contenente 10 micromolari di inibitore della roccia Y 2, 7, 6, 3, 2 e 10 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita della fibra due. Successivamente, ho mescolato le cellule con il trian blue e le ho contate in una piastra emocitometrica.

18.000 celle per centimetro quadrato sulla piastra prima del seminterrato. Le piastre rivestite con membrana coprono le cellule con 1,5 millilitri di terreno per pozzetto e incubano a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore, rinfrescare il terreno Dopo altre 24 ore, cambiare il terreno con un terreno condizionato fresco integrato con soli 10 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti 2 72 ore.

Dopo aver seminato le cellule, cambiare il terreno in un mezzo di sostituzione del siero knockout. Questo punto temporale è indicato come giorno zero di differenziazione. Rinfrescare le cellule con terreno fresco ogni giorno per i prossimi tre giorni.

Quando si cambia il terreno il quarto e il quinto giorno, aggiungere un 25% di N di terreno integrato e il 75% di siero di sostituzione knockout. Medium il sesto giorno raccogliere le cellule per l'analisi. I corpi embrionali possono essere utilizzati per molti studi diversi.

Ecco un esempio di studio di citotossicità che mostra l'effetto di concentrazioni variabili di metilmercurio sulla vitalità delle cellule. Da questo grafico, è stato determinato che il punto 24 micromolare ha causato il 10% di morte cellulare e una concentrazione di 1,61 micromolari ha causato il 50% di morte cellulare dopo un'esposizione per 14 giorni. Gli RNA isolati dai corpi embrionali di tre gruppi di trattamento con metilmercurio sono stati analizzati su un microarray per esaminare un'ampia varietà di biomarcatori.

Quelli esposti al mercurio micromolare del punto 25 sono mostrati in rosso. Quelli esposti a un micromolare di metilmercurio sono mostrati in blu e l'RNA di controllo è mostrato in verde. Questa mappa di analisi delle componenti principali mostra che le caratteristiche genetiche di ciascun gruppo di trattamento variano significativamente dall'altro: in tutto, più di 276 geni sono stati modificati più del doppio quando esposti a una concentrazione micromolare di metilmercurio.

30 di questi geni sono stati modificati anche dal gruppo a concentrazione più bassa al punto 25 micromolare. Su questa mappa di calore, si può vedere che 233 dei geni modificati nel gruppo di trattamento con un micromolare erano geni che erano sottoregolati e solo 43 erano sovraregolati dal trattamento. Non dimenticare che lavorare con il triazolo o con le formiche di sviluppo può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare occhiali setti, guanti per le mani resistenti agli agenti chimici e l'esecuzione di tutti i lavori relativi al triolo nella cappa aspirante dovrebbero essere sempre prese in considerazione durante l'esecuzione di questa procedura.

Seguendo questa procedura. Altri metodi come la colorazione, la formazione di feros, che possono mescolare la formazione del tubo, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come l'ancoraggio fenotipico.