Umano cellule staminali pluripotenti Basato Tossicità per lo sviluppo saggi per Chemical Screening e Safety Systems Biology generazione dati

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere due sistemi di test in vitro per la tossicità dello sviluppo basati su cellule staminali embrionali umane e studi sul trascrittoma. Questo viene realizzato innanzitutto coltivando cellule staminali embrionali umane su fibroblasti embrionali di topo. Il secondo passaggio consiste nel far formare alle cellule staminali embrionali umane corpi embrionali, nei quali possono generare cellule di tutti e tre i foglietti germinativi, oppure nel differenziarle in progenitori neuroectodermici.

Successivamente, i corpi embrionali o i progenitori neuroectodermici vengono trattati con composti di interesse a diverse concentrazioni durante la differenziazione. I passaggi finali consistono nel valutare la vitalità delle cellule e nell'isolare l'RNA. Infine, l'analisi del microarray del trascrittoma viene utilizzata per mostrare le variazioni nell'espressione dell'RNA delle cellule trattate con un composto di interesse rispetto alle cellule di controllo non trattate. Sulla base di cellule staminali neurali umane e macro aree del DNA, abbiamo sviluppato una metodologia in vitro che consente il monitoraggio di effetti tossici sullo sviluppo rilevanti per l'uomo.

La metodologia può essere applicata dall'industria farmaceutica e chimica per lo screening della sicurezza di potenziali farmaci e agenti tossici ambientali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della tossicità dello sviluppo, come l'effetto dei composti chimici sul neurosviluppo molto precoce. Per iniziare, scongelare il supplemento per il mezzo cellulare a temperatura ambiente e aggiungere 100 millilitri di questo in 400 millilitri di mezzo basale per cellule staminali.

Successivamente, scongelare la matrice della membrana basale in ghiaccio e aggiungere il volume supplementato di matrice in 24 millilitri di mezzo basale dmm. F 12 freddo secondo le indicazioni del produttore; mescolare la soluzione pipettando delicatamente su e giù, quindi aggiungere due millilitri della miscela in 12 piastre separate da sei centimetri. Incubare le piastre a temperatura ambiente per un'ora, durante la quale la matrice ricoprirà le piastre.

Quindi rimuovere il mezzo e aggiungere due millilitri di mezzo per cellule staminali. Successivamente, rimuovere quattro piastre confluenti dall'incubatrice contenenti cellule embrionali umane H nine coltivate su strati di cellule della fibroblasti embrionali di topo preparati come descritto nel protocollo nel testo accompagnatorio sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare una punta di pipetta da un millilitro ed eliminare le colonie differenziate dalla piastra.

Le colonie indifferenziate presentano margini ben definiti e cellule compatte, mentre le cellule differenziate iniziano a espandersi dai margini e sono di dimensioni maggiori. Aspirare il mezzo e lavare le cellule con quattro millilitri di PBS. Quindi aggiungere due millilitri di mezzo per cellule staminali con l'ottavo di uno stereomicroscopio.

Tagliare le colonie in sei o nove pezzi ciascuna utilizzando un ago da 26 gauge e raschiare gli aggregati con punte da pipetta da un millilitro. Raccogliere delicatamente le colonie tagliate in un tubo falcon da 50 millilitri e centrifugare a 200 G per cinque minuti. Successivamente, aspirare il soprannatante e risospendere le cellule in 12 millilitri di mezzo per cellule staminali.

Posizionare 20 microlitri della sospensione cellulare su un vetrino e contare il numero di aggregati al microscopio. Regolare la concentrazione della sospensione a 150 aggregati per millilitro, quindi aggiungere due millilitri della sospensione in ciascuna piastra da sei centimetri. Muovere le piastre avanti e indietro e da un lato all'altro per distribuire le cellule in modo uniforme, quindi incubare le piastre in un incubatore per colture cellulari ogni due giorni.

Cambiare con attenzione il mezzo. Dopo aver rimosso le colonie differenziate, aggiungere 40 microlitri di una soluzione sterile di copolimero al 5% in ciascun pozzetto di una piastra Vbo a 96 pozzetti e lasciare incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. Prelevare una piastra confluenziale contenente colonie dall'incubatore e rimuovere eventuali colonie differenziate al microscopio stereoscopico utilizzando una punta di pipetta da un millilitro. Quindi aspirare il mezzo dalla piastra e lavare delicatamente le cellule con quattro millilitri di PBS.

Successivamente, aggiungere due millilitri di mezzo di differenziamento casuale in ogni piastra. Utilizzare lo strumento per il passaggio per tagliare le colonie di cellule H nine in grumi di dimensioni uniformi. Raschiare delicatamente i grumi con una spatola per cellule e raccoglierli con cautela in una provetta conica da 50 millilitri per centrifuga.

Raccogliere le colonie centrifugando a 200 G per cinque minuti, quindi aspirare il surnatante e risospendere le cellule nel mezzo di differenziamento casuale a 1000 colonie per millilitro. Successivamente, aspirare il copolimero a blocchi dalla piastra 96 pozzetti con fondo a V; con l'aiuto di una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di sospensione di colonie in ogni pozzetto. Aggregare le colonie sul fondo dei pozzetti a forma di V centrifugando la piastra a 4 gradi Celsius per quattro minuti a 400 G. Quindi, posizionare la piastra nell'incubatore per quattro giorni utilizzando punte da 200 microlitri con foro più largo. Rimuovere i corpi embrionali dalla piastra a 96 pozzetti e trasferirli in una piastra quadrata sterile da 122 millimetri.

Successivamente, utilizzare una pipetta sierologica sterile da 10 millilitri per trasferire i corpi embrionali dalla piastra quadrata in un tubo falcon da 15 millilitri. Lasciare sedimentare i corpi embrionali per due minuti, quindi aspirare il surnatante e lavare i corpi embrionali con cinque millilitri di PBS. Attendere nuovamente che i corpi embrionali si sedimentino per due minuti, quindi aspirare il surnatante.

In questa fase risospendere i corpi embrionali in cinque millilitri di mezzo di differenziamento casuale. Successivamente, trasferire i corpi embrionali in una piastra batteriologica da 10 centimetri e aggiungere ulteriori 10 millilitri di mezzo di differenziamento casuale. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5%CO2 su un agitatore orizzontale.

A 50 giri al minuto, vengono mostrati gli aggregati embrionali rappresentativi al giorno cinque, al giorno nove e al giorno 14. Cambiare con attenzione il mezzo ogni due giorni, sostituendo tutti i 15 millilitri con un mezzo fresco per la differenziazione casuale. Per valutare l'effetto di un farmaco sulla differenziazione, iniziare ad aggiungere il farmaco al mezzo a partire dal giorno cinque per un periodo di 10 giorni, come descritto nel protocollo testuale allegato.

Utilizzando una pipetta sterile, raccogliere i corpi embrionali dalle piastre da 10 centimetri in un tubo falcon da 15 millilitri. Lasciarli sedimentare per due minuti, quindi aspirare il soprannatante. Lavare con cinque millilitri di PBS e trasferire in un tubo da 1,5 millilitri privo di nucleasi.

Lasciarli depositare ed aspirare il sopranatante. Sospendere i corpi embrionali in un millilitro di reagente triolo e far passare la soluzione attraverso un ago da 24 gauge con una siringa da un millilitro circa 15 volte per rompere le cellule. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di cloroformio a ciascun campione.

Vortexare brevemente il contenuto, quindi centrifugare i campioni a 12.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il sopranatante in provette da 1,5 millilitri senza disturbare gli altri strati. Aggiungere quindi un volume uguale di etanolo al 70% freddo al sopranatante e mescolare delicatamente il contenuto agitando. Trasferire 700 microlitri della miscela in una colonna mini spin e seguire le istruzioni del produttore per purificare l'RNA nel passaggio finale di eluizione.

Applicare 22 microlitri di acqua priva di nucleasi sulla colonna spin e centrifugare i tubi a 12.000 ×g per un minuto. Quindi rimuovere il tubo di raccolta e mettere l'RNA sul ghiaccio. Aggiungere un millilitro di spazio disco preriscaldato per ogni fiala T25 confluenta di cellule H9 e incubare la fiala per nove minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi aggiungere due millilitri di mezzo di lavaggio preriscaldato alle cellule trattate e pipettare delicatamente su e giù cinque volte con una pipetta da cinque millilitri. Trasferire la soluzione cellulare in un tubo falcon.

Successivamente, lavare il matraccio con nove millilitri di mezzo di lavaggio e aggiungerli al tubo contenente le cellule. Centrifugare il campione per tre minuti e mezzo a 500 G. Quindi rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo di lavaggio. Centrifugare nuovamente le cellule per tre minuti e mezzo a 500 G, quindi rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in quattro millilitri di mezzo per cellule staminali embrionali umane. Aggiungere 0,5 millilitri della sospensione cellulare e 4,5 millilitri di mezzo fresco in un nuovo matraccio T25 lavato con PBS contenente fibroblasti embrionali di topo inattivati mitoticamente.

Cambiare il mezzo nel matraccio ogni giorno. Rivestire una piastra da 10 centimetri con gelatina 0,1% in PBS e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi raccogliere le cellule staminali embrionali umane rimuovendo il mezzo e aggiungere un millilitro di acuta al matraccio T 25 mentre le cellule si staccano.

Aggiungere 6,6 millilitri di mezzo freddo a 330 microlitri di matrice della membrana basale congelata. Filtrare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri e utilizzare un millilitro della soluzione filtrata per ricoprire ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Le cellule verranno successivamente seminate sulle piastre rivestite dopo l'incubazione di 30 minuti delle cellule embrionali umane con Accutane; fermare la reazione aggiungendo 1,5 millilitri di mezzo Hess.

Staccare le cellule dalla fiasca e quindi aggiungere altri otto millilitri di mezzo Hess. Ottenere una soluzione di cellule singole pipettando delicatamente su e giù con un pipetta da 10 millilitri, filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri, quindi centrifugare le cellule per tre minuti a 500 ×g. Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo. Centrifugare nuovamente le cellule per tre minuti a 500 ×g. Quindi rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo Hess S contenente l'inibitore ROCK Y 2 7 6 3 2 a una concentrazione finale di 10 micromolare.

Successivamente, rimuovere il soprannatante dalla piastra rivestita con gelatina, sospendere le cellule nella piastra rivestita con gelatina e incubare esattamente per un'ora a 37 gradi Celsius. Durante questo passaggio, l'ipoblasto si depositerà sulle piastre rivestite con gelatina, mentre le cellule staminali embrionali umane rimarranno libere. Il tempo di galleggiamento è cruciale, poiché un'incubazione troppo lunga provocherà l'aggregazione delle cellule staminali, mentre un'incubazione troppo breve rimuoverà solo alcuni di questi fibroblasti una volta che i fibroblasti si saranno attaccati.

Utilizzare il mezzo presente nella piastra per lavare delicatamente le cellule staminali non aderenti dalla piastra. Lavare nuovamente la piastra con 10 millilitri di mezzo Hess e raccogliere le cellule, centrifugare le cellule per tre minuti a 500 ×g, rimuovere il soprannatante S risultante e risospendere le cellule in circa quattro millilitri di mezzo condizionato contenente 10 micromolar di inibitore della chinasi ROCK Y 2,7,6,3,2 e 10 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti due. Successivamente, mescolare le cellule con blu di trian e contarle su una piastra emocitometrica.

18.000 cellule per centimetro quadrato sulla piastra prima della membrana basale. Coprire le cellule con piastre rivestite con membrana con 1,5 millilitri di mezzo per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore, rinnovare il mezzo. Dopo ulteriori 24 ore, sostituire il mezzo con mezzo condizionato fresco integrato solo con 10 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti 2 per 72 ore.

Dopo aver seminato le cellule, sostituire il mezzo con un mezzo contenente sostituto del siero knockout. Questo punto temporale è indicato come giorno zero della differenziazione. Rinnovare le cellule con mezzo fresco ogni giorno per i successivi tre giorni.

Quando si cambia il mezzo nei giorni quattro e cinque, aggiungere un mezzo costituito dal 25% di mezzo supplementato N due e dal 75% di sostituto del siero knockout. Al sesto giorno, raccogliere le cellule per l'analisi. I corpi embrionali possono essere utilizzati per molti studi diversi.

Di seguito è riportato un esempio di studio sulla citotossicità che mostra l'effetto di diverse concentrazioni di mercurio metilico sulla vitalità delle cellule. Da questo grafico si è determinato che una concentrazione di 24 micromolare ha causato il 10% di morte cellulare e una concentrazione di 1,61 micromolare ha causato il 50% di morte cellulare dopo un'esposizione di 14 giorni. Gli RNA isolati da corpi embrionali di tre gruppi trattati con mercurio metilico sono stati analizzati mediante microarray per esaminare una vasta gamma di biomarcatori.

I soggetti esposti a 25 micromolar di mercurio sono mostrati in rosso. Quelli esposti a un micromolare di metilmercurio sono mostrati in blu, e l'RNA di controllo è mostrato in verde. Questa mappa di analisi delle componenti principali mostra che le caratteristiche genetiche di ciascun gruppo di trattamento differiscono significativamente tra loro: più di 276 geni sono stati modificati di oltre due volte quando esposti alla concentrazione di un micromolare di metilmercurio.

30 di questi geni sono stati inoltre modificati dal gruppo a concentrazione più bassa al punto di 25 micromolar. In questa mappa termica, si può osservare che 233 dei geni modificati nel gruppo trattato con un micromolare erano geni che sono stati regolati negativamente, mentre soltanto 43 sono stati regolati positivamente dal trattamento. Non dimenticare che lavorare con triazolo o formiche sviluppatrici può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare occhiali protettivi, guanti resistenti ai prodotti chimici e svolgere tutti i lavori relativi ai trioli all'interno di una cappa aspirante devono sempre essere prese in considerazione durante l'esecuzione di questa procedura.

Seguendo questa procedura, altri metodi come la colorazione o la formazione di feros, che possono essere combinati con il saggio di formazione di tubuli, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, come l'ancoraggio fenotipico.