Name: A Whole marcatura già cellulare approccio per valutare i trasporti e la biodisponibilità di contaminanti organici in acqua insaturi Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Scopri un saggio bioreporter cellulare completo per valutare la biodisponibilità di contaminanti organici come il fluorene. Questo metodo utilizza Burkholderia sartisoli e reti miceliali per monitorare la degradazione in sistemi non saturi.

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Il finanziamento da parte della Fondazione tedesca per l'ambiente (DBU) è riconosciuto. Gli autori ringraziano Ute Kuhlicke per l'aiuto tecnico con l'analisi CLSM e Birgit Würz, Rita Remer e Jana Reichenbach per l'aiuto sperimentale qualificato. Gli autori desiderano ringraziare in particolare il Prof. Jan Roelof van der Meer e il Dr. Robin Tecon per la fruttuosa discussione e per aver fornito il ceppo bioreporter. Contribuisce al programma di ricerca "Chemicals in the Environment" (CITE) dell'Associazione Helmholtz.

1. Preparazione di piatti, Scivoli e incubazione Chambers <ol><li> Preparare il seguente materiale per ogni microcosmo: un grande plastico Petri fondo piatto (d = 10 cm), uno modificato (vedi punto 1.2) piccolo plastica Petri fondo piatto (d = 5 cm) con coperchi e un conteggio vetrino da camera con tre cavità. </li><li> Prendete il numero desiderato di Petri parti inferiori piatto (d = 5 cm). Rimuovere parte della tesa con una sega per adattarsi esattamente una diapositiva (26 mm di bordo). Per sterilizzare il sistema, immergere Petri fondo piatto e coperchi in etanolo al 70% O / N e asciugare per almeno 2 ore in un armadio di flusso ai raggi UV. Conservare le piastre di Petri in un contenitore di plastica ermeticamente sigillato, che era stato anche esposto a luce UV per 2 h. </li><li> Pulire il numero desiderato di diapositive con il 70% di etanolo e asciugare all&#39;aria. Avvolgere diapositive in carta stagnola e metterli in un forno a muffola per 5 ore a 450 ° C per rimuovere eventuali contaminazioni. </li&gt; <li> Preparare camere di incubazione di vetro con coperchi. Pulire con il 70% di etanolo e esporre le camere aperte a luce UV per almeno 2 ore in un armadio di flusso. NOTA: grandi essiccatori (diametro circa 30 cm) con coperchi può essere utilizzato per questo scopo; ogni essiccatore può ospitare fino a dieci configurazioni microcosmo. </li></ol> 2. Preparazione di mezzi e culture <ol><li> Per eseguire 20 microcosmi paralleli, ottenere 100 ml di modifica medio triptone-lievito (MTY) 14, circa 150 ml di 21C minima media 16 (MM), 5 ml di minima agar (MMA, 0,5%, w / v), tre piastre di agar destrosio di patata (PDA, 1,5%, w / v) per P. ultimum, quattro piastre vuote, una piastra PDA contenente 2 mg L -1 cicloeximide, quattro piastre di agarosio (3%, w / v) contenente 0,3 g ml -1 carbone attivo e 40 mg di influenza in 2 porzioni mg. </li><li> Preparare Mty contenente 50 mg L -1 di kanamicina (kanamicina è required a mantenere il eGFP giornalista plasmide) e MM contenente acetato di 10 mm per la coltivazione batterica. Utilizzare MM, senza acetato per preparare 0,5% MMA per l&#39;immobilizzazione dei batteri nei microcosmi e versare piastre (ogni 20 ml) di 1,5% PDA per la coltivazione di Pythium ultimum e microcosmo configurazioni. </li><li> Seminare alcuni ife di P. ultimum su tre piastre PDA freschi e incubare al buio a 25 ° C per circa 72 ore. Allora sì che le piastre sono ricoperte completamente di micelio fresco e soffice. </li><li> Inizia due culture di B. sartisoli RP037-Mche in 50 ml di MTY da un stock di glicerolo. Incubare a 30 ° C con 230 giri movimento pallone rotante O / N. </li><li> Densità cultura Misura ottica (OD) a 578 nm e centrifugare a 1000 xg per 10 minuti (per B. sartisoli RP037-Mche, l&#39;OD atteso 578 è di circa 1,0 e le cellule sono in fase esponenziale). Gettare il surnatante e risospendere le cellulein una quantità appropriata di MM raggiungere un OD 578 di 0,4. Seminare 20 ml di MM contenenti 50 mg L -1 kanamicina con 400 ml di cellule risospese. Incubare a 30 ° C con 230 giri movimento pallone rotante O / N. </li><li> Misura 578 OD della cultura in MM (per B. sartisoli RP037-Mche, l&#39;OD atteso 578 è di circa 0,2 e le cellule sono in fase iniziale esponenziale). Cultura Centrifugare a 2.000 xg per 10 min e risospendere le cellule in una quantità appropriata di MM a raggiungere un diametro di 0,4. Mescolare 50 ml di sospensione cellulare con 500 ml di caldo, liquido MMA in 2 ml provette e conservare a 50 ° C fino utilizzo. Utilizzare 150 ml di cellule in MMA per ogni microcosmo. </li><li> Versare in piastre di gel di agarosio contenente carbone attivo. Melt agarosio (3%; w / v) in acqua bidistillata. Mescolare accuratamente con carboni attivi (0,3 g ml -1) e versare la miscela in piastre di Petri di plastica(D = 10 cm). </li></ol> 3. Microcosmo di montaggio NOTA:. L&#39;impostazione microcosmo completo è illustrato schematicamente nella figura 1, fare riferimento alla Figura 1 per tutti i successivi singoli passi. Le seguenti operazioni descrivono la preparazione di un campione (SAM) con i vettori di trasporto miceliari e tre differenti configurazioni di controllo (CON AIR, CON NEG, CON POS). Una sintesi di tutte le diverse configurazioni si trovano nella tabella 1. <ol><li> Prendere numero desiderato di piastre di Petri e scivoli ed esporli ai raggi UV sotto un armadietto di flusso per 30 min. </li><li> Posizionare la piccola scatola di Petri all&#39;interno della grande e adattare la diapositiva attraverso la fessura della piccola scatola di Petri. Prendere un campione di sospensione cellulare caldo in MMA e aggiungere 150 ml nella cavità centrale di una diapositiva. Ripetere questa operazione fino a quando le cavità centrali di tutte le diapositive sonopieno di MMA. Attendere 5 min per il MMA solidificare. </li><li> Utilizzare da 1 cm sonda di carotaggio a pugni le patch circolare da una piastra PDA vuoto. Collocare un cerotto ad una distanza di 2 mm accanto MMA all&#39;interno del piccolo piatto Petri. Aggiungere questo per promuovere la crescita del micelio nella configurazione (PDA 3 nella figura 1). </li><li> Tagliare patch curve PDA come barriere meccaniche. Utilizzare una parte inferiore piccola scatola di Petri pulita e sterile e premere in un piatto di PDA. Utilizzare una spatola per tagliare un altro anello più piccolo ad una distanza di 0,5 cm in agar che si traduce in un PDA-ring. <ol><li> Tagliare un pezzo, che si inserisce esattamente nella fessura del piccolo piatto Petri nella configurazione microcosmo e posizionarlo all&#39;interno del gap superiore della diapositiva. Assicurarsi che la distanza tra il MMA e la barriera PDA circolare è circa 2 mm. Chiudere il coperchio della piccola scatola di Petri premendo delicatamente nella barriera PDA. </li><li> Ripetere i punti 3.4 e 3.4.1 con un piatto PDA contenente 2 g L -1di cicloesimide. NOTA: Questa è l&#39;impostazione di controllo per il trasporto per via aerea (CON AIR) verso le cellule marcatura già, poiché miceli sono inibiti dal cicloeximide e non invadere MMA. </li></ol></li><li> Utilizzare da 1 cm sonda di carotaggio a pugni le patch circolari di un piatto PDA vuoto. Utilizzare un altro 0,5 centimetri sonda di carotaggio per tagliare la metà del primo patch. Posizionare la risultante piccola PDA-ring ad una distanza di 1 mm vicino alla barriera PDA (PDA 1 nella Figura 1). </li><li> Aggiungere 2 mg di influenza nel foro di PDA 1. Utilizzare da 1 cm sonda di carotaggio per tagliare le patch circolari da lastre PDA ricoperte di P. ultimum e mettere un cerotto (PDA 2 in Figura 1) inferiore verso il basso sull&#39;anello PDA in modo che il tappetino del micelio sia rivolta verso i cristalli influenza. <ol><li> Ripetere il passaggio precedente, senza l&#39;aggiunta di cristalli di influenza. NOTA: Questa è l&#39;impostazione di controllo negativo (CON NEG) per determinare sfondofluorescenza delle cellule marcatura già. </li></ol></li><li> Utilizzare da 1 cm sonda di carotaggio a pugni le patch circolari dal agar contenente carbone attivo. Mettere quattro patch in ogni configurazione microcosmo di diminuire ulteriormente la concentrazione FLU gassosa (Figura 1). </li><li> Preparare un controllo positivo (CON POS). Aggiungere alcuni cristalli FLU a 200 ml di sospensione cellulare MMA e metterlo in una cavità di una sagoma vuota. </li><li> Inserire un piatto Petri (d = 10 cm) con una certa polvere di carbone attivo sul fondo della camera di incubazione per minimizzare la concentrazione FLU gassosa nella camera. Inoltre, posizionare 04:56 50 ml bicchieri con acqua sterile sul fondo per mantenere alta umidità nella camera. <ol><li> Trasferire configurazioni microcosmo in camere di incubazione e incubare a 25 ° C per 96 ore. I campioni in modo casuale nelle diverse camere di crescita per escludere effetti di localizzazione. NOTA: Questa volta ap incubazioneveli alla oomicete P. ultimum. Potrebbe essere diverso per altri organismi. </li></ol></li></ol> 4. Microscopia confocale a scansione laser <ol><li> Idealmente utilizzare un setup CLSM con il microscopio in posizione verticale. NOTA: Può essere equipaggiato con i laser tradizionali offrendo ad esempio, 488, 561 e 633 linee di nm per l&#39;eccitazione o con una sorgente laser sintonizzabile bianco. </li><li> Utilizzare le seguenti impostazioni per la raccolta di immagini: Eccitazione: 490 nm (eGFP) e 585 nm (mCherry) presso l&#39;intensità del laser appropriata (eccitazione simultanea); gamme di emissione: da 500 a 550 nm (eGFP) e 605-650 nm (mCherry); obiettivo obiettivo: 63X NA 0.9 immersible acqua (a causa della sua lunga distanza di lavoro); passo per z-stack: 0.5 micron. </li><li> Configurazione aperta microcosmo e usare un bisturi per rimuovere PDA 1, 2, 3 e la barriera PDA. Mettere un vetrino di vetro sulla parte superiore del MMA e premerlo delicatamente per rimuovere le bolle d&#39;aria. Mount vetrino sul palco microscopio. Aggiungere una goccia d&#39;acqua sopra thcopertura e di slittamento e utilizzare le impostazioni mCherry per trovare le cellule marcatura già nel campione. </li><li> Prendi una rapida panoramica del campione e ottimizzare rapporto segnale-rumore con un bagliore-over-under tabella di ricerca per il rosso (mCherry) e verde (eGFP) del canale. Scegliete una posizione casuale sul campione da analizzare marcatura già fluorescenza. NOTA: ife può mostrare autofluorescenza nel range di emissione di marcatura già (ad esempio, l&#39;autofluorescenza verde) 17. Assicurarsi di selezionare le aree senza ife se questo è il caso. </li><li> Definire e registrare z-stack per ogni posizione nel verde (eGFP) e la (mCherry) canale rosso. Evitare sbiancamento del campione dalla lunga esposizione alla luce epifluorescenza o luce laser. <ol><li> Ripetere il passaggio precedente per dieci casuali, posizioni uniformemente distribuiti. </li></ol></li><li> Ripetere tutti i passi con le stesse impostazioni per tutti i campioni della pista di prova (SAM), CON AIR, CON NEG e CON POS. </li></ol&gt; Analisi 5. Immagine NOTA: Per analizzare rosso (mCherry) e verde (eGFP) fluorescenza nelle z-stack registrati, tra le altre opzioni del software ImageJ free 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) può essere utilizzato. <ol><li> Assicurarsi di installare il plugin logi_tool (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/). </li><li> Apri il file in ImageJ. Selezionare &quot;canali Split&quot; e vicino canale verde. Utilizzare la macro &#39;zona mCherry&#39; fornito come file di codice aggiuntivo per quantificare area di fluorescenza rossa in z-stack. Regolare le impostazioni preferite nella macro (indicata in grassetto). <ol><li> L&#39;uscita è una tabella con i pixel misurati sopra soglia (e la dimensione minima sopra definita) nello stack z. NOTA: La somma di tutti i valori è il numero totale di pixel rossi (area) nello stack. </li></ol></li><li> Apri il file in ImageJ. Selezionare &quot;canali Split&quot; e vicino canale rosso. Utilizzare la macro<html> 216; eGFP int &#39;fornito come file di codice aggiuntivo per quantificare l&#39;intensità di fluorescenza verde in pila z. Regolare le impostazioni preferite nella macro (indicata in grassetto). <ol><li> L&#39;uscita è un tavolo con intensità media e l&#39;area di tutti gli oggetti verdi sopra soglia (e soprattutto la dimensione minima definita) in z-stack. Per calcolare l&#39;intensità totale di pixel verdi in pila, moltiplicare ciascuna intensità per la superficie corrispondente significa. </li></ol></li><li> Calcolare l&#39;induzione relativo eGFP (eGFP rel): <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52334/52334eq1.jpg" width="300px" /> (1) NOTA: Poiché mCherry è espresso costitutivamente, il valore risultante di eGFP rel è una misura relativa per la quantità di eGFP espressa da una certa quantità di cellule. Si prega di fare riferimento anche alla Tabella 3 per ulteriori informazioni sul calcolo di eGFP rel. </li></ol>tle &quot;&gt; 6. Quantificazione Chemical NOTA: impostazioni Microcosmo possono anche essere utilizzati per eseguire la quantificazione chimica degli importi INFLUENZA traslocati con o senza un dissipatore contaminante abiotico. <ol><li> Avvolgere 15 fiale ml in vetro, 1 ml GC fiale / MS e inserti in alluminio. Riempire evaporazione piatti con Na 2 SO 4; posizionare tutti in muffola per 5 ore a 450 ° C per rimuovere possibili contaminazioni. Conservare il Na 2 SO 4 all&#39;interno di un essiccatore attivato. </li><li> Tagliare PDMS fibre di vetro rivestito in 0,5 cm di lunghezza. Lavare fibre agitando quattro volte 2 ore in metanolo fresco. Ripetere il lavaggio passaggi altre quattro volte con acqua ultrapura e memorizzare fibre pure in acqua ultrapura in un flaconcino di vetro sigillato. </li><li> Preparare 1,5 L di toluene / acetone (3: 1, v / v) contenente 10 mg L -1 fenantrene-d 10. </li><li> Eseguire i passaggi 1, 2 e 3 del protocollo. Preparare microcosmi senza BIORcellule eporter per studiare il trasporto FLU (SAM (-) e CON AIR (-)) e con le cellule di marcatura già (SAM) per verificare il degrado FLU. <ol><li> Opzionali (senza celle marcatura già): Luogo tre PDMS rivestite in fibra di vetro (di solito utilizzati per esperimenti SPME) come artificiale e quantificabile lavandino contaminante all&#39;interno MMA di SAM (-) utilizzando una pinza sottile. </li><li> Rimuovere fibre di vetro con una pinza sottile e trasferire ognuno in un GC / MS flacone con inserto. </li><li> Aggiungere 200 ml di toluene e scuotere verticalmente O / N e analizzare mediante GC / MS. Utilizzare le impostazioni di cui alla tabella 2. </li></ol></li><li> Trasferire MMA dalla cavità centrale in un flaconcino di vetro da 15 ml e aggiungere circa tre spatole di Na 2 SO 4. Mescolare bene con una spatola e aggiungere 10 ml di solvente. Vortex la miscela e agitare orizzontalmente O / N nel buio. <ol><li> Trasferire 1001; l di campione in GC / MS flacone con inserto. Aggiungere 10 ml di acenaftilene-D 08 (10 mg L -1) e analizzare tramite GC / MS con lo stesso programma, come descritto al punto 6.4.3. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

La configurazione microcosmo presentato dimostrato adatto per studiare la biodisponibilità di sostanze chimiche spazialmente separate per degradare organismi dopo l&#39;assorbimento e il trasporto da miceli. Potenziale di trasporto del gas in fase di composti volatili parzialmente è impedito e le cellule di marcatura già batteriche può essere visualizzato senza preparazione del campione elaborato e quindi con il minimo disturbo del sistema sensibile. Allo stesso tempo, l&#39;analisi chimica del campione può essere facil...

Suolo è densamente popolato da una vasta gamma di microrganismi come batteri 1,2. Tuttavia, le condizioni in questo habitat sono impegnativi, soprattutto in termini di disponibilità di acqua 3. I batteri in modo permanente devono cercare le condizioni ottimali in ambienti eterogenei 4, ma l&#39;assenza di film d&#39;acqua continuo si traduce in mobilità limitata 5 ostacolando loro di diffondersi liberamente. Inoltre, i tassi di diffusione di soluti (ad esempio, nutrienti) sono abbassati in condizioni insaturi 6. Così, batteri e sostanze nutrienti sono spesso separati fisicamente e l&#39;accessibilità dei nutrienti è limitato a 3. Di conseguenza, un vettore di trasporto per i composti chimici che non richiede un acqua-fase continua potrebbe contribuire a superare queste limitazioni. In realtà, molti microrganismi, come funghi e oomiceti hanno sviluppato una forma di crescita filamentosa che permette loro di crescere attraverso pori pieni d&#39;aria e raggiungere in tal modo mobilizing anche fisica nutrienti 7 e 8 sostanze carboniose separato su lunghe distanze. Essi possono anche fungere da vettori di trasporto biologici che forniscono zuccheri e altre fonti di energia ai batteri 9. Assorbimento e trasporto in organismi miceliari è stato anche dimostrato di inquinanti organici idrofobici come gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) in Pythium ultimum 10 o nei funghi micorrizici arbuscolari 11. Dal PAH sono contaminanti solubili in acqua onnipresenti e scarsamente 12 nel suolo, trasporti miceli mediata potrebbe contribuire ad aumentare la biodisponibilità dei contaminanti per i potenziali degraders batteriche. Considerando che l&#39;importo totale del trasporto inquinante può essere quantificato direttamente chimica significa 10, la biodisponibilità dei contaminanti trasportati da miceli a batteri degradanti e altri organismi non può essere valutata facilmente. Il protocollo che segue presenta un metodo per valutare l&#39;impatto di MyCelia sulla biodisponibilità contaminante degraders batteriche in modo diretto; permette la raccolta di informazioni sull&#39;impatto spazio-temporale dei contaminanti sugli ecosistemi microbici. Descriviamo come impostare un elaborato sistema di microcosmo insaturo imitando interfacce aria-acqua nel suolo collegando una sorgente puntiforme PAH separati fisicamente con PAH-degradanti marcatura già batteri tramite vettori di trasporto miceliari. Poiché è escluso il trasporto aereo, l&#39;effetto del trasporto miceliale basata sulla PAH biodisponibilità dei batteri può essere studiata in modo isolato. Più in dettaglio, tre anelli PAH fluorene, l&#39;organismo miceliale Pythium ultimum e la marcatura già batterio Burkholderia sartisoli RP037-Mche 13 sono stati applicati nelle configurazioni microcosmo descritti. Il batterio B. sartisoli RP037-Mche è stato originariamente costruito per studiare flussi fenantrene alla cella 14 ed esprime migliorati proteina fluorescente verde (eGFP) per effetto del flusso di PAHla cella, mentre il rosso fluorescente mCherry è espressa costitutivamente. Informazioni dettagliate sulla costruzione giornalista è data da Tecon et al. 13 Nei test preliminari, il batterio non ha rivelato alcuna nuoto e solo molto lenta capacità sciamatura. Era in grado di migrare lentamente ife di Pythium ultimum quando applicato come una sospensione densa sopra il ife. Poiché i batteri sono stati incorporati in agarosio nella seguente protocollo, migrazione ife non si è verificato. Utilizzando microscopio confocale a scansione laser (CLSM), i batteri marcatura già possono essere visualizzati direttamente in microcosmi ed espressione di eGFP possono essere quantificati in relazione alla quantità di cellule (proporzionale al segnale mCherry) con l&#39;aiuto del ImageJ software. Questo permette di confrontare biodisponibilità qualitativamente in diversi scenari (cioè, superiore o inferiore). FLU è risultato essere biodisponibile dopo trasporto micelio di P. ultimum (cioè,era superiore a quello di un controllo negativo). Inoltre, il protocollo descrive come quantificare l&#39;ammontare totale del trasporto miceli mediato tramite mezzi chimici e verificare la biodisponibilità dei contaminanti con fibre di vetro siliconato (fibre SPME) in microcosmi identici. I risultati con questa configurazione microcosmo sono stati pubblicati e discussi per la combinazione di P. ultimum, fluorene e B. sartisoli RP037-Mche 15. Qui, l&#39;attenzione si concentra sulla descrizione metodo dettagliato e l&#39;individuazione di potenziali insidie ​​del protocollo di fornire questa conoscenza per i potenziali ulteriori applicazioni. Ulteriori applicazioni possono coinvolgere vari fungine, specie batteriche (ad esempio, da siti contaminati), e altri contaminanti (ad esempio, i pesticidi) o contaminante di alimentazione (ad esempio, i terreni di età).

<table><tbody><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td></td><td>TCS SP5X, LAS AF - Versione 2.6.1; o equivalente CLSM</td></tr><tr><td>GC HP 7890 Series GC e Agilent 5975C MSD</td><td>Agilent</td><td></td><td>un equivalente GC/MS può essere utilizzato</td></tr> colonna <tr><td>capillare GC J& W 121-5522&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cork trivella</td><td>Fisher Scientific</td><td>12863952</td><td>o qualsiasi altro</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td>Marienfeld</td><td>107222</td><td>Alte prestazioni, No.1.5H</td></tr><tr><td>GC/MS inserti</td><td>WICOM</td><td>WIC 47080</td><td></td></tr><tr><td>GC/MS flaconi 2 ml</td><td>WICOM</td><td>WIC 41150</td><td></td></tr><tr><td>Coperchi / setti per fiale con tappo a vite</td><td>DIONEX</td><td>49463 / 049464&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Coperchi per fiale GC/MS</td><td>WICOM</td><td>WIC 43948/B</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini obiettivo</td><td>Menzel</td><td></td><td>ordinari</td></tr><tr><td>PDMS rivestiti in fibre di vetro</td><td>Polymicro Technologies, Inc.</td><td></td><td>V (PDMS) = 13,55&nbsp; &plusmn; &nbsp; 0,02&nbsp; &micro; l&nbsp; m-1</td></tr><tr><td>Petri Piastre piccole / grandi</td><td>Greiner</td><td>633-102 / 628-102</td><td></td></tr><tr><td>Fiale con tappo a vite 40 ml</td><td>DIONEX</td><td>48783</td><td>altre fiale di vetro possono essere utilizzate</td></tr><tr><td>Fiale con tappo a vite 60 ml</td><td>DIONEX</td><td>48784</td><td>altre fiale di vetro possono essere utilizzate</td></tr><tr><td>Acenaphthylene d08</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>C 20510100</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Carl Roth</td><td>9372.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbone attivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242276-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Carl Roth</td><td>2267.4</td><td></td></tr><tr><td>Fluorene</td><td>Fluka</td><td>46880</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina solfato</td><td>Carl Roth</td><td>T832.2</td><td>50 mg L-1</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Carl Roth</td><td>P7171</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1.000 ml aqua dest</td></tr><tr><td colspan="4">Solution 1</td></tr><tr><td>Ammonium sulfate</td><td>Carl Roth</td><td>3746.1</td><td>5 g L-1&nbsp; </td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio x 6&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td>1 g L-1</td></tr><tr><td>Nitrato di calcio x 4&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>P740.1</td><td>0.5 g L-1</td></tr><tr><td colspan="4">Solution 2</td></tr><tr><td>Fosfato disodico</td><td>Carl Roth</td><td>P030.1</td><td>55.83 g L-1</td></tr><tr><td>Fosfato monopotassico</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td>20 g L-1</td></tr><tr><td colspan="4">Solution 3 (pH 6,0)</td></tr><tr><td>EDTA disodico</td><td>MERCK</td><td>1084180250</td><td>0,8 g L-1</td></tr><tr><td>Cloruro di ferro (II) x 4&nbsp; H2O</td><td>MERCK</td><td>1038610250</td><td>0,3 g L-1</td></tr><tr><td>Cloruro di cobalto(II) x 6&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>T889.3</td><td>4 mg L-1</td></tr><tr><td>Cloruro di manganese (II) x 1&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4320.2</td><td>10 mg L-1</td></tr><tr><td>Rame(II) solfato</td><td>Carl Roth</td><td>P023.1</td><td>1 mg L-1</td></tr><tr><td>Molibdato di sodio x 2&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>0274.1</td><td>3 mg L-1</td></tr><tr><td>Cloruro di zinco</td><td>MERCK</td><td>1088160250</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>Litio cloruro</td><td>Carl Roth</td><td>P007.1</td><td>0,5 mg L-1</td></tr><tr><td>Cloruro di stagno (II) x 2&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4473,1</td><td>0,5 mg L-1</td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Riedel-de-Haen&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>11606</td><td>1 mg L-1</td></tr><tr><td>Bromuro di potassio</td><td>Carl Roth</td><td>A137.1</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>Ioduro di potassio</td><td>Carl Roth</td><td>6750.1</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>Cloruro di bario</td><td>Carl Roth</td><td>4453.1</td><td>0,5 mg L-1</td></tr><tr><td>MMA</td><td></td><td></td><td>Terreno minimo + agarosio 0,2%</td></tr><tr><td>Fenantrene d10</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>C 20920100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 brodo + bacto-agar 1,5%; pH 6,8</td></tr><tr><td>Potato Dextrose broth</td><td>Difco/ Beckton Dickinson</td><td>254920</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>Difco/ Beckton Dickinson</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio x 3 hydr.</td><td>Carl Roth</td><td>6779.1</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di sodio</td><td>MERCK</td><td>1066495000</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>MERCK</td><td>1083252500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">mTY medium: 3 g&nbsp; L-1 estratto di lievito, 5&nbsp; g&nbsp; L-1 bacto triptone e 50 mM NaCl</td></tr><tr><td>estratto di lievito</td><td>Merck</td><td>1037530500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Serva</td><td>4864702</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ con logi tool plugin</td><td></td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html e http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10</td></tr><tr><td>Pythium ultimum ceppo 67-1</td><td></td><td></td><td>Ottenuto dal laboratorio del Dr. Christoph Keel; Dipartimento di Microbiologia Fondamentale, Università di Losanna, Svizzera</td></tr><tr><td>Burkholderia sartisoli RP037-mChe</td><td></td><td></td><td>Ottenuto dal laboratorio del Prof. Jan Roelof van der Meer; Dipartimento di Microbiologia Fondamentale, Università di Losanna, Svizzera</td></tr></tbody></table>

a whole marcatura già cellulare approccio per valutare i trasporti e la biodisponibilità di contaminanti organici in acqua insaturi sistemi

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

La biodisponibilità dei contaminanti è un prerequisito per la loro efficace biodegradazione nel suolo. La concentrazione apparente media di un contaminante, tuttavia, non è una misura appropriata per la sua disponibilità; La biodisponibilità dipende piuttosto dall'interazione dinamica del potenziale trasferimento di massa (flusso) di un composto verso una cellula microbica e dalla capacità di quest'ultima di degradare il composto. Nelle parti del suolo insature d'acqua, è stato dimostrato che i miceli superano i limiti di biodisponibilità trasportando e mobilizzando attivamente i composti organici nell'ordine dei centimetri. Mentre l'entità del trasporto a base di miceli può essere facilmente quantificata con mezzi chimici, la verifica della biodisponibilità dei contaminanti per le cellule batteriche richiede un metodo biologico. Per risolvere questo limite, abbiamo scelto il fluorene IPA (FLU) come composto modello e abbiamo sviluppato un microcosmo modello insaturo acquoso che collega una sorgente puntiforme di FLU spazialmente separata e il batterio bioreporter degradante FLU Burkholderia sartisoli RP037-mChe da una rete miceliale di Pythium ultimum. Poiché il bioreporter esprime eGFP in risposta al flusso di IPA alla cellula, l'esposizione e la degradazione dell'influenza batterica possono essere monitorate direttamente nei microcosmi tramite microscopia confocale a scansione laser (CLSM). Le analisi CLSM e di immagine hanno rivelato un aumento significativo dell'espressione di eGFP in presenza di P. ultimum rispetto ai controlli senza miceli o FLU, indicando così la biodisponibilità di FLU per i batteri dopo il trasporto mediato da miceli. I risultati della CLSM sono stati supportati da analisi chimiche in microcosmi identici. Il microcosmo sviluppato si è dimostrato adatto per studiare la biodisponibilità dei contaminanti e per visualizzare contemporaneamente le interazioni batteri-miceliali coinvolte.

I risultati presentati qui sono già stati pubblicati in precedenza 15. Consultare l&#39;articolo per la discussione dettagliata meccanicistica e ambientale. Dopo la registrazione dell&#39;immagine mediante CLSM, una sporgenza massima intensità può essere effettuato utilizzando il rispettivo software microscopio o ImageJ per ottenere una prima impressione visiva del campione ei controlli (Figura 2). Più tardi, i set di dati possono essere proiettati in modo diverso...

Un intero test marcatura già cella con Burkholderia sartisoli RP037-Mche è stato sviluppato per rilevare frazioni di un contaminante organico (cioè, fluorene) disponibile per la degradazione batterica dopo trasporto attivo da miceli ponte pori pieni d&#39;aria in un sistema modello insaturo acqua.

A Whole marcatura già cellulare approccio per valutare i trasporti e la biodisponibilità di contaminanti organici in acqua insaturi Sistemi

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un saggio bioreporter per monitorare direttamente l'influenza delle reti miceliali sulla biodisponibilità dei contaminanti organici. Ciò si ottiene immobilizzando i batteri bioreporter che esprimono una proteina fluorescente verde potenziata o EGFP in funzione della biodisponibilità dei contaminanti nella coclea e applicandoli su un vetrino adatto. Successivamente, la fonte di contaminante viene aggiunta all'impianto all'interno di un anello a coclea e l'organismo miceliale viene inoculato su un cerotto a coclea sopra di esso.Quindi il microcosmo viene incubato fino a quando il micelio non ha ricoperto l'intera struttura e il contaminante può essere trans localizzato lungo la rete. Infine, le cellule bioreporter vengono visualizzate utilizzando la microscopia a scansione laser confocale. In definitiva, l'influenza delle reti miceliali sulla biodisponibilità del fluoro viene valutata quantificando l'espressione di EGFP delle cellule bioreporter utilizzando un software di analisi delle immagini.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'estrazione chimica degli IPA, è che la biodisponibilità dei contaminanti può essere valutata direttamente in un sistema biologico e con un consumo minimo di materiale. Questo metodo può fornire informazioni sulla biodisponibilità di p hs in un ambiente insaturo d'acqua come il suolo in futuro. Può anche essere utilizzato per altre sostanze chimiche come pesticidi e/o utilizzando altri ceppi batterici e fungini.Per iniziare, prepara il seguente materiale per ogni microcosmo. Una piastra di Petri da 10 centimetri, in basso, una piastra di Petri modificata, il fondo che è stato tagliato sull'orlo per adattarsi a un vetrino con una lunghezza del bordo di 26 millimetri, un vetrino per camera di conteggio con tre cavità e un piccolo coperchio per piastra di Petri. Dopo aver preparato il terreno di coltura Pythium Ultima su piastre PDA e la coltivazione, ecco l'area sarti soli RP O 37 mg in terreno minimo, secondo il protocollo di testo, misurare l'OD 5 78 della coltura di sarti soli dell'area behold.L'OD previsto è di circa 0,2, centrifugare la coltura a 2000 G per 10 minuti e risospendere le cellule in una quantità appropriata di terreno minimo per raggiungere un OD di 0,4. Mescolare 50 microlitri di sospensione cellulare con 500 microlitri di liquido caldo, coclea media minima o MMA in provette da due millilitri e conservare a 50 gradi Celsius fino al momento dell'uso in una cappa di flusso. Esporre il numero desiderato di piastre di Petri e vetrini alla luce UV per 30 minuti.Quindi posizionare la piccola capsula di Petri all'interno di quella più grande e inserire il vetrino attraverso la fessura della piccola capsula di Petri. Aggiungere 150 microlitri di sospensione di cellule calde nella cavità centrale di ciascun vetrino e lasciarli solidificare per cinque minuti. Usa un prestito di sughero da un centimetro per perforare i cerotti circolari da una piastra PDA vuota per promuovere la crescita miceliale.Posiziona un cerotto a una distanza di due millimetri dall'MMA all'interno della piccola capsula di Petri. Accanto al taglio di patch PDA curve come barriere meccaniche. Utilizzare una piccola piastra di Petri pulita e sterile e premerla in una piastra PDA.Quindi usa una spatola per tagliare un altro cerchio di circa 0,5 centimetri di diametro più piccolo per produrre un anello PDA. Ritagliare un pezzo dell'anello della coclea che si adatti esattamente alla fessura della piccola capsula di Petri nel microcosmo e posizionarlo all'interno della fessura sopra il vetrino. Assicurarsi che la distanza tra l'MMA e la barriera circolare del PDA sia di circa due millimetri.Chiudere il coperchio della piccola capsula di Petri, premendola delicatamente nella barriera PDA come configurazione di controllo per il trasporto aereo verso le cellule bioreporter, preparare una barriera PDA meccanica utilizzando una piastra PDA contenente due grammi per litro di cicloolio. Usa un prestito di sughero da un centimetro per perforare le toppe circolari di una piastra PDA vuota. Usa un altro sughero boer da 0,5 centimetri per ritagliare la parte centrale della prima patch.Posizionare il piccolo anello PDA risultante a una distanza di un millimetro dalla barriera PDA. Ora aggiungi due milligrammi di fluoro IPA nel foro del PDA uno. Quindi utilizzare un boer di sughero di un centimetro per ritagliare i cerotti circolari dalle piastre del PDA ricoperte di pythium ultimo, e posizionare un cerotto dal basso verso il basso sull'anello del PDA in modo che il tappetino miceliale sia rivolto verso i cristalli di fluoro.Preparare un controllo negativo senza cristalli di fluoro per determinare la fluorescenza di fondo delle cellule bioreporter in modo simile. Ritagliare dei cerotti circolari di un centimetro dalla coclea contenente carbone attivo e posizionare quattro cerotti in ciascun microcosmo per ridurre ulteriormente la concentrazione di fluoro gassoso. Per preparare un controllo positivo, aggiungere cristalli di fluoro a 200 microlitri di sospensione cellulare di MMA e metterla in una cavità di un vetrino vuoto.Posizionare una capsula di Petri con un po' di polvere di carbone attivo sul fondo della camera di incubazione per ridurre al minimo la concentrazione di fluoro gassoso nella camera. Quindi posizionare quattro o cinque becher da 50 millilitri con acqua sterile sul fondo per mantenere alta l'umidità nella camera. Trasferire le configurazioni del microcosmo nelle camere di incubazione, posizionando i campioni in modo casuale nelle diverse camere di crescita per escludere gli effetti di localizzazione per il pythium Ultimo.Incubare a 25 gradi Celsius per 96 ore dopo aver impostato il microscopio confocale. Utilizzando le linee guida delineate nel protocollo di testo, aprire una configurazione del microcosmo. Utilizzare un bisturi per rimuovere i PDA 1, 2, 3 e la barriera del PDA.Posiziona un vetrino di copertura sopra l'MMA e premilo delicatamente per rimuovere le bolle d'aria. Montare il vetrino sul tavolino del microscopio. Aggiungere una goccia d'acqua sopra il vetrino coprioggetti e utilizzare le impostazioni m cherry per trovare le cellule bioreporter nel campione.Quindi, scegli una posizione casuale sul campione per averne una rapida panoramica. Quindi utilizzare una tabella di ricerca che si illumina sopra per i canali rosso e verde e ottimizzare il rapporto segnale/rumore. Quindi definisci e registra le pile Z per ogni posizione nei canali verde e rosso.Ripetere l'acquisizione Zack per 10 posizioni casuali distribuite uniformemente utilizzando l'immagine J In base al protocollo di testo, aprire una pila di immagini, selezionare i canali divisi e chiudere il canale verde. Utilizzare la macro M cherry area fornita come file di codice supplementare per quantificare l'area di fluorescenza rossa nello stack Z e la tabella di output verrà generata con i pixel misurati al di sopra della soglia nello stack Z con la somma di tutti i valori che rappresentano il numero totale di pixel rossi nello stack. Successivamente, con il file aperto, chiudere il canale rosso.Utilizzare la macro E-G-F-P-I-N-T fornita come file di codice supplementare per quantificare l'intensità della fluorescenza verde nello stack Z. L'output è una tabella con le intensità medie e l'area di tutti gli oggetti verdi al di sopra della soglia nella pila Z. Per calcolare l'intensità totale dei pixel verdi nella pila, moltiplica ogni intensità media per l'area corrispondente.Calcolare l'induzione relativa di EGFP utilizzando la seguente formula e fare riferimento al protocollo di testo per ulteriori opzioni per quantificare chimicamente le quantità di fluoro. Dopo aver preparato i microcosmi con e senza cellule bioreporter, posizionare tre fibre di vetro rivestite di PDMS precedentemente pulite come pozzi di contaminanti artificiali e quantificabili all'interno dell'MMA dei microcosmi Samin. Dopo l'incubazione per 96 ore, utilizzare una pinza per rimuovere le fibre di vetro e trasferirle in una gascromatografia, spettrometria di massa o in una fiala GCMS con inserto, aggiungere toluene ai campioni e incubare durante la notte.Infine, utilizzare GCMS per analizzare i campioni. È possibile generare una proiezione di massima intensità per ottenere una prima impressione visiva del campione e dei controlli, come dimostrato qui. La sospensione del controllo positivo mostra una distinta induzione di EGFP, mentre l'Airborne Control Con Air mostra solo una fluorescenza EGFP di fondo, questi pannelli mostrano che la fluorescenza EGFP nel campione di prova Sam, sembra essere elevata rispetto all'errore di con, ma non così marcata come i conps.La fluorescenza della ciliegia M è indipendente dalla degradazione degli IPA e quindi simile per tutti i campioni per i microcosmi testati. L'ispezione visiva è stata completata dall'analisi delle immagini e dal calcolo dell'induzione relativa di EGFP, come dimostrato qui nelle condizioni date. Non è stato possibile rilevare alcuna differenza significativa tra coneg e con, escludendo quindi qualsiasi trasporto di fluoro in fase vapore verso le cellule bioreporter in presenza di miceli e fluoro.L'EGFP è stato indotto in modo significativo nelle cellule rispetto ai controlli negativi. Tuttavia, l'induzione dell'EGFP è relativamente bassa rispetto al controllo positivo. Questa figura mostra che Mycelia Trans ha localizzato circa 25 nanogrammi di fluoro entro 96 ore, controlli in assenza di micelio Conair meno, tuttavia ha rivelato un trasporto gassoso di fluoro nell'MMA nell'intervallo di soli due nanogrammi entro 96 ore.Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante ricordare che i batteri BioPort sono altamente sensibili alle concentrazioni di fluoro in fase gassosa. Pertanto, è molto importante ridurre al minimo il trasporto in fase gassosa il più possibile e verificare l'assenza di trasporto in fase gassosa mediante estrazione chimica di MMA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare i microcosmi e come eseguire l'ispezione visiva utilizzando la microscopia a scansione laser confocale.Si può anche vedere che i microcosmi sono adatti a diversi ceppi microbici e varie sostanze chimiche.

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