Name: Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Impara a valutare il controllo respiratorio nei mitocondri isolati da biopsia percutanea del muscolo scheletrico. Questa tecnica richiede solo 20 mg di tessuto ed è ideale per la ricerca clinica.

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Vorremmo ringraziare il Dr. Marc Liesa, della Boston University School of Medicine, le utili discussioni; la signora Karin Murphy, la signora Heather Gregory e il signor John Stone, tutti della Wake Forest School of Medicine, per l'utile assistenza tecnica nello sviluppo di questo protocollo.

NOTA: Il protocollo descritto è stato approvato dal Institutional Review Board di Wake Forest School of Medicine. Il consenso informato è stato ottenuto per iscritto. Tutti i partecipanti erano sani adulti più anziani (65-79 anni) di entrambi i sessi, con BMI che vanno 23-35. 1. scheletrico biopsia muscolare <ol><li> Come descritto in precedenza, 9 eseguire tutte le biopsie al mattino presto dopo un O / N veloce. Chiedete ai soggetti di non prendere l&#39;aspirina, prescrizione e over-the-counter farmaci anti-infiammatori non steroidei, o altri composti che possono influenzare il sanguinamento, piastrine, o ecchimosi per la settimana prima della biopsia. Chiedere ai partecipanti di astenersi anche da qualsiasi attività faticose per almeno 36 ore prima della biopsia. NOTA: Muscle è ottenuto dal vasto laterale con la tecnica biopsia percutanea con un ago percutanea in anestesia locale con lidocaina 1%. Nessun complicazioni mediche o other segnalati eventi avversi della procedura si sono verificati nella nostra unità di ricerca clinica. </li><li> NOTA: La procedura descritta biopsia è adattato da quello di Bergstrom 10. <ol><li> In breve, a livello locale amministrare 1% prendendo lidocaina attenzione a non infiltrarsi nel muscolo. Seguire questo con un periodo di attesa di 10 minuti per consentire paralizzante sufficienti. </li><li> Prendete le biopsie dal ventre del muscolo (la regione centrale del muscolo tra inserimento e l&#39;origine) evitando le zone sottofasciale e myotendonous. <ol><li> Utilizzare ago percutanea (un dispositivo riutilizzabile aspirazione assistita con un lato finestra e cilindro di taglio interna di taglio) e seguire un fasciale &quot;pop&quot; o la resistenza della fascia come guida. </li><li> Stimare la profondità con l&#39;ago anestesia, poi di nuovo sentire con il bisturi stretto e fare un&#39;incisione di 4-5 mm attraverso la fascia. Avanzare l&#39;ago attraverso l&#39;incisione finché non viene inserito nel muscolo. </li><li> Raccoglierecampioni multipli con finestra rivolti in direzioni diverse. Applicare aspirazione continua utilizzando una siringa da 60 cc durante l&#39;avanzamento e ritiro campioni muscolari nell&#39;ago percutaneo due a quattro volte in direzioni diverse. Interrompere l&#39;aspirazione e rimuovere l&#39;ago. NOTA: Ogni passo (inserimento e la rimozione dell&#39;ago) dovrebbero prendere meno di un minuto. </li><li> Avere un assistente applica con decisione per puntura sito per 5 minuti per stabilire emostasi. Scollegare ago dal tubo di aspirazione e rimuovere con cautela campioni muscolari dalla finestra e botte. </li></ol></li><li> Fare un secondo passaggio se più muscolare è necessario ripetendo la procedura sopra. </li><li> Rimuovere eventuali coaguli di sangue visibili dal campione di muscolo usando pinze, pesare il campione, e mettere subito in una provetta contenente DPBS ghiacciate. NOTA: La resa media utilizzando questa metodologia è di 150 ± 20 mg. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento mitocondriale &lt;ol&gt; <li> Appena preparare il Chappel-Perry (CP) e mitocondriale Assay Solution (MAS) buffer (Tabella 1), il giorno dell&#39;esperimento, o aliquota e conservare a -20 ° C. Preparare i composti in dimetilsolfossido ad una concentrazione di 2,5 mM e aliquota e conservare a -20 ° C. Utilizzare i tampone e composti aliquote conservati a -20 ° C entro 2 mesi dal giorno di preparazione. </li><li> Rimuovere il tessuto connettivo visibile dal campione usando forbici affilate e pinzette; se un microscopio da dissezione per questo passo necessario uso. Lavare accuratamente i campioni 3-4 volte con tampone DPBS ghiacciato per rimuovere il sangue. Mantenere i campioni in DPBS e procedimenti ghiacciate al più presto possibile, facendo attenzione a non superare più di 45 minuti dalla biopsia. Prendere le precauzioni necessarie per rimuovere con attenzione eventuali tendini o tessuto adiposo dal campione muscolo. </li><li> Tritare immediatamente il tessuto muscolare in pezzi sottili usando un paio di forbici sterili e di sospendere in 500 ml a 1 ml CPI contenente proteinase (Nagarse) ad una concentrazione di 0,2 mg / g di tessuto. Seguire questo con un 5 min di incubazione a RT e poi trasferimento a ghiaccio. </li><li> Omogeneizzare i tessuti tritate trattati con Nagarse usando un omogeneizzatore automatizzato. Mantenere il campione in ghiaccio durante tutto il processo. Omogeneizzare ogni campione di tessuto quattro volte, ogni volta per un impulso di 2 sec, usando l&#39;omogeneizzatore automatizzata ad una impostazione di velocità di 10.000 rpm. Lavare la sonda con il 70% di etanolo seguito da acqua distillata tra tessuti. </li><li> Lavare il tessuto omogeneizzato con un volume uguale di CP I (500 microlitri di 1 ml) e 2x volume di CP II (1 ml a 2 ml), e raccogliere il contenuto in una provetta da centrifuga e centrifugare a 600 xg, a 4 ° C per 10 min. Passare il surnatante con un panno bagnato formaggio, raccogliere il filtrato e scartare il pellet, eliminando in tal modo la maggior parte delle frazioni non mitocondriali. </li></ol> 3. Lavare il mitocondri <ol><li> Centrifugare il surnatante dal passo sopra a 10,000 xg, a 4 ° C per 10 min. Sospendere il pellet in 4 ml di tampone CP II e in seguito centrifugare a 10.000 xg, a 4 ° C per 10 min. NOTA: In rare occasioni, un sottile pellet di sangue si forma sotto il pellet mitocondriale. In tal caso, rimuovere il pellet mitocondriale aspirando delicatamente con tampone CPII. Questo passaggio può essere evitato accuratamente lavando via il sangue al passo 2. </li><li> Sospendere il pellet ottenuto in 2 ml di tampone CP I. In questa fase utilizzare una piccola aliquota di questa sospensione per la stima della proteina. Risospendere il campione rimanente in CP I tampone e centrifuga come sopra. Sospendere il pellet finale in una quantità minima (200 ml) di mitocondriale Assay Solution (MAS). NOTA: Le proteine ​​sono analizzati in questa fase perché tampone CP io non ha BSA, mentre MAS in cui i campioni saranno poi sospesi non ha BSA in esso. </li></ol> 4. Stimare il contenuto mitocondriale misurando Protein Concentrazione Utilizzando un BCA Protein Assay Kit <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: utilizzare questa concentrazione per calcolare la quantità di mitocondri utilizzati per il carico su una micropiastra da 24 pozzetti per misure respirometriche, o per esperimenti Western Blot. Tenere conto del fattore di diluizione (10) per il calcolo della concentrazione proteica. 5. Eseguire saggi XF come descritto da Rogers, GW, et al. 12 NOTA: Visualizzare il tasso di consumo di O 2 (OCR) in pmoli O 2 / min, o livelli assoluti di O 2 e pH nell&#39;output dati. <ol><li> Utilizzare 1x MAS per preparare composti da iniettare. Aggiungere una concentrazione 10x dei composti alle porte AD per dare una concentrazione finale come segue: Port A, ADP [Adenosine 5 &#39;-diphosphate, 2 mM, 50 microlitri]; port B, oligomicina (2 micron, 55 ml); port C, FCCP [cianuro 4- (trifluorometossi) fenilidrazone carbonile, 6 micron, 60 ml]; e la porta D, 2 mM antimicina-A (65 ml). Prepararevolume sufficiente di composti per il numero di pozzetti. </li><li> Determinare la quantità ottimale di mitocondri mediante titolazione. Ad esempio, il carico 1,0 mg, 2,5 mg, e 5,0 mg di mitocondri per pozzetto in un volume di 50 ml di 1x ghiacciate MAS contenenti substrato. Per ridurre al minimo la variabilità tra i pozzi, prima diluire 10x mitocondri in freddo substrato 1x MAS +. Avanti, erogare 50 ml di questa sospensione di ogni bene (tranne i pozzi di correzione di sfondo). </li><li> Centrifugare la piastra a 2.000 xg, 20 min a 4 ° C. Dopo centrifugazione, aggiungere delicatamente 450 microlitri di 1x MAS + succinato (10 mm) e rotenone (2 mM) (condizioni iniziali, vedi sotto) per ciascun bene. Mostra i mitocondri al microscopio per assicurare l&#39;aderenza omogenea al pozzo prima di trasferire la piastra all&#39;analizzatore XF. NOTA: Le condizioni iniziali utilizzate dipenderà se la respirazione è guidato da una I o II complesso complesso ETC. Per complesso respirazione II-driven, usare succinate (10 mM) e rotenone (2 mM) come condizioni iniziali. Blocchi rotenone I e succinato complesso fornisce combustibile per il complesso II (succinato deidrogenasi). Per studiare la respirazione guidata da complesso I, utilizzare piruvato e malato, ciascuno ad una concentrazione finale di 5 mM o glutammato e malato ciascuna ad una concentrazione finale di 10 mM come condizioni iniziali. Quest&#39;ultimo può aiutare a distinguere tra disfunzione del ciclo di Krebs e il trasporto del substrato. Per studiare la respirazione guidata da entrambi I e II complesso complesso, comprende piruvato e succinato senza rotenone o malato come condizioni iniziali. Utilizzare palmitoil carnitina come substrato per la β-ossidazione. </li><li> Sequenziale misurare la respirazione mitocondriale in tempo reale utilizzando il respirometro programmando come descritto in precedenza 12. Utilizzare le impostazioni per il respirometro previsto nella tabella 2. NOTA: Una breve spiegazione dei vari stati respirazione mitocondriale sono i seguenti: </li><li&gt; Stato 2 = stato accoppiato con substrato presente; Stato 3 = fosforilare la respirazione in presenza di saturare ADP; Stato 4 o = non-fosforilazione respirazione indotta da oligomicina; 3u Stato = massima respirazione disaccoppiato stimolata dalla FCCP sganciamento; Residua non mitocondriale respirazione = respirazione dopo complesso III inibizione da antimicina-A. Va inoltre sottolineato che, la lunghezza della misura OCR in combinazione con la concentrazione mitocondriale potrebbe influenzare i dati mediante deplezione ossigeno durante i periodi di misurazione. </li></ol> 6. Western Blot NOTA: Determinare il marcatore mitocondriale COX IV e tutta la GAPDH tessuti mediante Western blotting per assicurare l&#39;arricchimento dei mitocondri nel campione finale <ol><li> Separare i mitocondri isolati e l&#39;estratto del tessuto tutto del 12% sodio dodecil solfato poliacrilammide gel. </li><li> Trasferire le proteine ​​su un fluoruro di polivinile (PVDF) membrana.</li><li> Incubare con COX IV anticorpo (1: 20.000), seguita da perossidasi di rafano (HRP) -conjugated anticorpi secondari. Per la determinazione GAPDH, striscia la macchia e la sonda con un anticorpo monoclonale GAPDH (1: 2.000). NOTA: Se le differenze di contaminazione ER sono di preoccupazione, comprendono marcatori ER quali ERp72, calnexina o calreticulina nell&#39;analisi. </li></ol>

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</ol>

L'autore, George Rogers, è un dipendente di Seahorse Bioscience che produce lo strumento utilizzato in questo articolo. Le tariffe Open Access sono state sostenute da Seahorse Biosciences.

Isolati mitocondri sono spesso utilizzati negli studi che esaminano il ruolo della funzione ETC, così come altre attività mitocondriali, compreso il trasporto di substrato e la funzione del ciclo TCA. Test respirometrici utilizzando organelli isolati consentono l&#39;esame diretto dei processi fondamentali della fosforilazione ossidativa e le proprietà intrinseche della ETC. Profiling respirometrici di mitocondri isolati rispetto alle cellule intere o fibre muscolari permeabilizzate ha i vantaggi di relativamente facile interpretazione dei dati e l&#39;assenza di &quot;interferenza&quot; da processi non-mitocondriali o modifiche mitocondriale massa / biogenesi. La normalizzazione dei dati si riferiscono al contenuto di proteina mitocondriale, consentendo così semplice confronto incrociato dei mitocondri tra campioni. Profiling respirometrici di mitocondri isolati è un approccio preferito quando l&#39;obiettivo dello studio è quello di determinare sottostanti meccanismi e identificare gli obiettivi specifici, come componente ETCs / complessi, o meccanismi di trasporto mitocondriale. Descritto è un protocollo per la biopsia muscolare e l&#39;isolamento dei mitocondri funzionale da piccoli campioni di tessuto. Questo metodo fornisce risultati riproducibili tra gli utenti a causa di utilizzo di un omogeneizzatore automatizzato contro mano azionato omogeneizzatori Dounce. Isolamento dei mitocondri può essere effettuata con un minimo di 20 mg di tessuto muscolare. La quantità di mitocondri isolati che si può ottenere da questa dimensione del campione è sufficiente per eseguire Seahorse respirometria basato piastra lasciando mitocondri surplus per altri esperimenti e deposito per ulteriori analisi molecolari. Si può osservare che questo metodo può essere tradotto al XF 96, dove anche piccole quantità di mitocondri possono essere utilizzati (1-2 mg per pozzetto). Diversi protocolli per mitocondri isolamento si basano su omogeneizzatori Dounce per disgregazione del tessuto iniziale. Un inconveniente di questo metodo è mani-sulla natura del tessuto inizialeomogeneizzazione. La forza e la velocità del pestello in omogeneizzatore possono variare significativamente tra operatori 6. Ciò può comportare esperimento a esperimento variazione, nonché variazioni laboratorio a laboratorio, e porta a difficoltà di comparazione dei dati tra esperimenti. Questo è particolarmente preoccupante in studi di intervento sull&#39;uomo quando i dati da parte dei partecipanti sono raccolti in momenti diversi, di solito prima e dopo il trattamento, e potenzialmente a più siti. Usiamo un omogeneizzatore automatico per un approccio più coerente che produce risultati più riproducibili con variazione limitata da persona a persona. La velocità di elaborazione rende questo metodo adatto per la gestione di più campioni contemporaneamente. Tipicamente, fino a tre esperimenti possono essere eseguiti in un solo giorno. Potenziali limitazioni della tecnica qui descritta derivano dall&#39;uso di organelli isolati e l&#39;uso di un formato basato piastra. Ad esempio, Picard et al. avere demonestrare che i mitocondri isolati possiedono caratteristiche funzionali che differiscono sostanzialmente da quelle dei mitocondri intatti in miofibre permeabilizzate. Hanno proposto che le tecniche di isolamento mitocondriali provocano alterata funzione bioenergetica, come significativamente aumentata RCR rispetto myofibers permeabilizzate accompagnati da una maggiore produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno 13. Rispetto alle fibre muscolari permeabilizzate, isolamento di mitocondri non richiede tempo di preparazione più lungo. Inoltre, la perdita di contenuto cellulare diminuisce rilevanza fisiologica, qualcosa che viene trattenuto nelle cellule intere e fibre anche permeabilizzate. L&#39;uso di respirometria basato piastra con i permessi tecnica descritta replicare piste per campione. Tuttavia, mitocondri devono aderire al fondo di ciascun pozzetto. Questa configurazione è diverso dal loro ambiente normale e può influenzare le caratteristiche funzionali. Inoltre, va notato che l&#39;utilizzo di questo protocollo per l&#39;isolamento mitocondriale, there può essere ancora contaminazione dal reticolo endoplasmatico (ER) nella preparazione mitocondriale. Le differenze di contaminazione ER possono influenzare la determinazione del rendimento e di influenzare i risultati mitocondriali. In conclusione, questo studio presenta dati che conferma che i mitocondri isolati da tessuti utilizzando questa procedura sono funzionalmente attivi e possono essere utilizzati per gli studi / applicazioni che richiedono mitocondri isolati alta qualità delle quantità minima di campioni di muscolo scheletrico. Il vantaggio di questo metodo è che: i) è possibile isolare mitocondri da quantità minime di muscolo scheletrico, ii) la procedura è veloce, iii) con la tecnologia piastra di base, è possibile eseguire più campioni contemporaneamente, e iv) c&#39;è abbastanza tessuto in eccesso e mitocondri isolati dopo il test bioenergetico di conservare il campione e di altri esami di biologia molecolare.

I mitocondri sono i siti di produzione di energia primaria nella cella e hanno un ruolo importante nella maturazione nonché vari disturbi legati all&#39;età, come le malattie cardiovascolari, il morbo di Alzheimer, il diabete, il cancro, e l&#39;obesità. Profiling respirometrici di mitocondri isolati fornisce un&#39;analisi diretta della catena di trasporto degli elettroni funzione (ETC) ed ha contribuito in modo significativo alla nostra comprensione della biologia mitocondriale e il suo ruolo nella salute e nella malattia. Isolati mitocondri vengono utilizzati per studiare vari aspetti della bioenergetica come, trasporti substrato, l&#39;attività ATP sintetasi, perdita protonica, ecc La metodologia descritta in questo manoscritto è stato ottimizzato per consentire l&#39;analisi respirometrico dei mitocondri isolati da biopsie di tessuto muscolare scheletrico ottenuti da soggetti umani. Il protocollo biopsia descritto in questo manoscritto è stato utilizzato dal nostro staff per gli ultimi 12 anni. Il nostro gruppo ha eseguito oltre 700 procedure sugli adulti di varie età,fino a 90 anni, e con varie condizioni croniche di malattia senza problemi avverse sicurezza. Un aspetto fondamentale di questo protocollo è che è specificamente progettato per utilizzare minime quantità di tessuto, facilitando in tal modo il suo uso in studi clinici. Sono stati sviluppati vari protocolli per isolare mitocondri. Fernandez-Vizarra et al. 1,2 descritto un metodo per isolare mitocondri da vari tessuti di ratto e cellule coltivate. Garcia-Cazarin et al. 3 hanno riportato un metodo per isolare mitocondri dai muscoli scheletrici di ratto e topo. Un metodo per isolare mitocondri da cervello di ratto è stata riportata anche da Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross, et al. 5 hanno riportato un metodo per isolare mitocondri usando l&#39;barocycler e / o il trituratore PCT. Recentemente, Franko et al. 6 ha riportato un metodo per isolare mitocondri altamente arricchito usando contro-TOM22 Sfere magnetiche. Mentre questi protocolli producono risultati eccellenti, requisiti di dimensione tessuti sono elevati rispetto al metodo descritto in questo manoscritto. Ad esempio, Gross et al. 5 usato 1,5-1,8 g del muscolo gastrocnemio, e circa 2 g del tessuto renale. Allo stesso modo, Franco et al. 6 utilizzato 500 mg di tessuto di fegato di topo. Dalla nostra esperienza, i rendimenti tipici che si possono attendere da biopsia percutanea del muscolo scheletrico (vasto laterale) vanno da 100-200 mg. La capacità di valutare la funzione mitocondriale in 20-50 mg di tessuto muscolare usando il protocollo qui descritto consente agli utenti di eseguire più valutazioni per la biopsia e di conservare i campioni per un uso futuro in altri esperimenti di biologia molecolare. Questa è una caratteristica fondamentale nella ricerca clinica e di altri studi che richiedono l&#39;uso diligente di campioni. Va notato che i mitocondri precedentemente congelati non sono buoni per studiare la respirazione accoppiata causa outEr danni della membrana mitocondriale e la perdita di attività del citocromo C. Il nostro metodo è stato adattato e modificato dal metodo pubblicata da Chappell e Perry 7. Utilizzando i metodi descritti in questo manoscritto, abbiamo recentemente riportato che il profilo respirometrico dei mitocondri isolati da Vasto umana lateralis è direttamente correlata con la capacità fisica, misurata come velocità andatura 8.

<table><tbody><tr><td>Attrezzatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore Bio-Gen PRO200</td><td>BioExpress</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deepwell late Rotor&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mm University College Hospital Ago</td><td>Cadenza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa 60 cc</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre a 96 pozzetti</td><td>Tecan (Genios-basic)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore Seahorse XF 24-3</td><td>Seahorse Biosciences, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di gel proteico</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak Gel Logic 112</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assemblaggio della fotocamera Kodak</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiali di</td><td></td><td></td><td></td>consumo</tr><tr><td>XF24 V7 Micropiastra per colture cellulari e cartuccia sensore XF24</td><td>Cavalluccio marino</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>100867-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>Acros</td><td>12421-0010</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Senza acidi grassi BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126575</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi batterica</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P-8038</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitolo</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Magnesio cloruro (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>PI23227</td><td></td></tr><tr><td>Acido succinico*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Acido piruvico*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Acido malico*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>2288</td><td></td></tr><tr><td>ADP(K+ sale)*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>XF Kit per test da sforzo mito cellulare</td><td>Seahorse Biosciences</td><td>101706</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-29113</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0343BOX</td><td></td></tr><tr><td>Membrane di trasferimento dell'immobilina (0,45 um)</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td></td></tr><tr><td>MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 litro</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi primari (mAB a VDAC1/Porina)</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi primari (mAB a GAPDH)</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IgG di topo (capra),</td><td>PerkinElmer</td><td>marcato</td> con HRP NEF822E001EA <td></td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio (capra),</td><td>PerkinElmer</td> marcato con HRP <td>NEF812E001EA</td><td></td></tr><tr><td>*L'ADP, l'acido succinico, l'acido piruvico e l'acido malico devono essere regolati a pH 7,4 solo con KOH.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico ottenuto dalla biopsia percutanea

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Profiling respirometrici di mitocondri isolati è comunemente utilizzato per studiare la funzione della catena di trasporto degli elettroni. Descriviamo un metodo per ottenere campioni di vasto laterale umano, isolare i mitocondri da minime quantità di tessuto muscolare scheletrico, e piastra di profiling respirometrico based utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare (XF). Confronto di profili respirometrici ottenuti utilizzando 1,0, 2,5 e 5,0 mg di mitocondri indicano che 1,0 mg è sufficiente per misurare la respirazione e 5,0 ug fornisce risultati più coerenti basata sul confronto di errori standard. Western blot dei mitocondri isolati per marcatore mitocondriale COX IV e non mitocondriale marcatore tessuto GAPDH indicano che non vi è limitata contaminazione non mitocondriale utilizzando questo protocollo. La possibilità di studiare respirometria mitocondriale in appena 20 mg di tessuto muscolare permette agli utenti di utilizzare biopsie individuali per più endpoint di studio in clinicaprogetti di ricerca.

La figura 1 illustra un diagramma di flusso dettagliato del intero protocollo. Profili Western blot di COX IV / GAPDH (Figura 2) descrivono l&#39;espressione della proteina mitocondriale, COX IV, e il marcatore non mitocondriale, GAPDH. Espressione di entrambi COX IV e GAPDH sono evidenti in tutta lisato muscolare. Dopo i mitocondri sono isolate utilizzando la tecnica descritta in questo protocollo, le bande COX IV sono ancora evidenti, mentre GAPDH è assente con la stessa esposizione. Esposizioni più lunghe possono rivelare una band GAPDH debole. Queste macchie indicano che i mitocondri isolati hanno minimal contaminazione non mitocondriale. Inoltre, l&#39;espressione di COX IV in mitocondri isolati è coerente tra i campioni. Figura 3 mostra i profili respirometrici tipici azionati da complesso II (succinato e rotenone) utilizzando 1,0 mg, 2,5 mg, 5,0 mg e dei mitocondri. Come previsto, OCR totale aumenta with maggiore quantità di mitocondri. Il rapporto di controllo respiratorio calcolato (RCR) per questo dosaggio è 7,95, che indica che la preparazione mitocondriale è di alta qualità. Inoltre, 3u stato OCR è leggermente superiore a quello dello stato 3, confermando qualità mitocondriale. Per confrontare la coerenza dei risultati a profilare diverse quantità di mitocondri, abbiamo effettuato ANOVA (analisi della varianza) e calcolato la somma dei quadrati (SS) come valori effettivi di varianza utilizzando 1,0 mg, 2,5 mg, e 5,0 mg di mitocondri caricato per ben (Figura 4). SS è presentato per lo stato 2, stato 3, 3u Stato, antimicina A, e RCR. Per stato 2 e lo stato 3 misurazioni, un modo ANOVA era statisticamente significativa (p &lt;0,01 e p &lt;0.05, rispettivamente). Analogamente, una ANOVA era statisticamente significativa per antimicina e RCR (p &lt;0,01 e p &lt;0,0001, rispettivamente. Nessuna differenza significativa è stata osservata per 3u stato tra i gruppi. These risultati indicano che 5,0 mg di mitocondri per pozzetto dato SS basso rispetto ad altre concentrazioni ed è la quantità ottimale da utilizzare nel sistema XF 24 con popolazione di partecipanti. Figura 5 funge da guida per indicare la quantità di proteina mitocondriale può essere previsto in base alla dimensione iniziale del campione muscolare. Come previsto vi è una forte correlazione tra la quantità di muscolo (mg) trattati e il contenuto totale di proteine ​​mitocondriale (mg) del campione finale. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Buffer Chappel-Perry I (CPI) </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Concentrazione </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 MM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mm </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 mM </td></tr&gt; <tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Buffer Chappel-Perry II (CPII) </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Concentrazione </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 MM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mm </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> Acidi grassi liberi BSA </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondriale Assay Solution (MAS) (2X) </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Concentrazione </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> 35 mm </td></tr><tr><td> Mannitolo </td><td> 110 mm </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2,5 mm </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 2,5 mm </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1,0 mm </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,5 mm </td></tr><tr><td> Acidi grassi liberi BSA </td><td> 0,10% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondriale Assay Solution (MAS) con complessi II condizioni iniziali </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Concentrazione </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Succinate </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 2 micron </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondriale Assay Solution (MAS) con complessi I condizioni iniziali </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Concentrazione </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato</td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Malate </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td colspan="2"> * I buffer da effettuare in acqua deionizzata </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Soluzione tampone e ricette. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Protocollo Steps </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> Comando </td><td> Time (min) </td><td> Porto </td></tr><tr><td> Calibrare </td><td> 0.00 </td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 10.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettare </td><td></td><td> La </td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 6.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettare </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettare </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td> Misura </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettare </td><td></td><td> D </td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Mix, misurare e mescolare impostazione del ciclo per il respirometro. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso di tutto il protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Una macchia rappresentante occidentale per tutto il tessuto muscolare scheletrico e mitocondri isolati. Estratto tessuto intero così come i mitocondri isolati sono stati immunoblotted con COX IV anticorpi come marcatore mitocondriale e anticorpi GAPDH per il controllo non-mitocondriale. No banda GAPDH è stato osservato nei mitocondri isolati che indica poca o nessuna contaminazione da fonti non-mitocondriali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> Figura 3. Profilo respirometrico Rappresentante dei mitocondri isolati da Vasto umano lateralis. Tre concentrazioni di mitocondri isolati, 5.0 mg, 2,5 mcg, e 1,0 mcg noi<html> abituati in questo test. Concentrazioni finali di composti dopo iniezioni di porta erano 2 ADP mm (attacco A); 2 mM oligomicina (porta B); 6 micron FCCP (porta C); e 2 micron antimicina A (porta D). RCR Calcolato per questa esecuzione è stato 7,95. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> Figura 4. Somma dei quadrati. Somma dei quadrati per i diversi stati di respirazione mitocondriale e RCR con 5.0 mg, 2,5 mg, e 1,0 mg mitocondri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Questo può essere usato come guida per stimare la quantità di proteina mitocondriale che può essere previsto in base al peso del muscolo del campione prima analisi di regressione:. Di quantità di muscolo (mg) e resa totale proteina mitocondriale (mg). Come previsto, vi è una correlazione positiva diretta tra la quantità di muscolo e la proteina mitocondriale totale ottenuta.

Sono descritti metodi per la biopsia di vasto laterale, la preparazione dei mitocondri purificati, e profilatura respirometrico. L&#39;uso di piccolo volume muscolare rende questa tecnica adatta per applicazioni di ricerca clinica.

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare il controllo respiratorio nei mitocondri isolati da tessuto muscolare scheletrico ottenuto mediante biopsia. Questo viene realizzato innanzitutto prelevando una piccola quantità di muscolo mediante biopsia percutanea con ago. Il secondo passaggio consiste nell'isolare i mitocondri dal muscolo biopsiato mediante omogeneizzazione.Successivamente, i mitocondri isolati vengono lavati e separati dalle frazioni non mitocondriali mediante centrifugazione e filtrazione del campione attraverso una garza di tela. L'ultimo passaggio consiste nell'allestire i mitocondri isolati per eseguire un'analisi respirometrica mediante saggi di flusso extracellulare, al fine di visualizzare il tasso di consumo di ossigeno. In definitiva, l'analizzatore di flusso extracellulare Seahorse viene utilizzato per esaminare il controllo respiratorio nei mitocondri isolati.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che richiede una quantità minima di tessuto muscolare pari a soli 20 milligrammi e riduce la variabilità tra esperimenti. Queste caratteristiche rendono la tecnica adatta ad applicazioni nella ricerca clinica. Le implicazioni di questa tecnica riguardano la diagnosi di disfunzione mitocondriale nei pazienti.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la biopsia muscolare e l'isolamento dei mitocondri richiedono manipolazioni precise che è preferibile mostrare visivamente piuttosto che descrivere esclusivamente nel testo. Per eseguire la biopsia in loco, somministrare lidocaina al 1%, avendo cura di non infiltrare il muscolo. Successivamente, attendere 10 minuti.Per consentire un'adeguata anestesia, prelevare i campioni bioptici dalla regione centrale del muscolo compresa tra inserzione e origine, evitando le aree sottofasciali e miotendinee. Per raggiungere questo obiettivo, utilizzare innanzitutto un ago percutaneo e seguire il "pop" fasciale o la resistenza della fascia come guida. Stimare la profondità con l'ago anestetico, quindi verificarla con la lama stretta del bisturi ed eseguire un'incisione di quattro-cinque millimetri attraverso la fascia.Avanzare l'ago attraverso l'incisione fino a quando non viene inserito nel muscolo. Raccogliere diversi campioni ruotando la finestra in direzioni diverse. Applicare un'aspirazione continua utilizzando una siringa da 60 centimetri cubi mentre si avanzano e si ritirano i campioni muscolari all'interno dell'ago percutaneo da due a quattro volte in diverse direzioni.Interrompere l'aspirazione e rimuovere l'ago. Far sì che un assistente applichi una pressione ferma sul sito di puntura per cinque minuti. Per ottenere l'emostasi, scollegare l'ago dal tubo di aspirazione e rimuovere con attenzione i campioni muscolari dalla finestra e dal corpo dello strumento.Eseguire un secondo passaggio se è necessario ulteriore muscolo, ripetendo questa procedura. Rimuovere eventuali coaguli di sangue visibili dal campione muscolare utilizzando pinzette. Quindi pesare il campione e posizionarlo immediatamente in un tubo contenente ghiaccio.Salina tamponata al fosfato fredda ECCOs o DPBS. Rimuovere accuratamente i tessuti connettivi visibili dal campione utilizzando forbici affilate e pinzette. Lavare i campioni da tre a quattro volte con tampone DPBS ghiacciato.Per rimuovere il sangue, mantenere i campioni in DPBS ghiacciato ed elaborarli il più rapidamente possibile. Entro 45 minuti dalla biopsia, prestare attenzione a rimuovere con cura eventuali tendini o tessuto adiposo dal campione muscolare. Rimuovere una piccola porzione di tessuto in eccesso per la conservazione a meno 80 gradi Celsius.Questo può essere utilizzato per altri esperimenti, come ad esempio i blot di Western. Tagliare immediatamente il tessuto muscolare in piccoli pezzi. Utilizzando un paio di forbici sterili, sospenderlo quindi in 500 microlitri fino a un millilitro di un inibitore ACE delle proteine Sistine, come ad esempio nagars disciolti nel buffer CP uno a una concentrazione di 0,2 milligrammi per grammo di tessuto.Trinciare il campione fino a quando non appare ben sospeso. Procedere con un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente prima di trasferire sul ghiaccio, assicurandosi che l'omogeneizzatore sia accuratamente lavato in precedenza. Omogeneizzare il tessuto tritato trattato con nagars.Utilizzando un omogeneizzatore automatico. Mantenere il campione sul ghiaccio per tutta la durata di questo processo. Omogeneizzare ogni campione di tessuto quattro volte, con un impulso di due secondi ciascuna.Utilizzando l'omogeneizzatore automatico a una velocità di impostazione di 10.000 giri/min, riporre il campione sul ghiaccio. Lavare la sonda con etanolo al 70% seguito da acqua distillata tra un tessuto e l'altro. A questo punto, lavare il tessuto omogeneizzato con un volume equivalente di buffer chapel Perry uno o CP uno.Quindi lavare il tessuto con il doppio del volume del tampone CP due. Aggiungere il tubo di bilanciamento portando l'acqua allo stesso volume in un altro tubo conico. Raccogliere il contenuto in un tubo da centrifuga e centrifugare a 600 ×g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Inumidire preventivamente la garza per permettere a tutte le particelle di passare senza rimanere intrappolate nel tessuto.Filtrare il soprannatante attraverso un canovaccio piegato, raccogliendo il filtrato e scartando il pellet, rimuovendo così la maggior parte delle frazioni non mitocondriali. Successivamente, ultracentrifugare il soprannatante a 10.000 ×g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Sospendere il pellet in quattro millilitri di buffer CP2 prima di centrifugare una seconda volta nello stesso modo dopo la centrifugazione.Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in due millilitri di tampone CP uno. A questo punto, prelevare un'aliquote piccola da questa sospensione e trasferirla in un tubo da prova separato da utilizzare per la stima proteica. Risospendere il campione rimanente nel tampone CP uno e centrifugare.Come in precedenza, si osservi che la piastra proteica deve essere preparata con gli standard durante le precedenti fasi di centrifugazione. Infine, risospendere il pellet finale in una quantità minima di soluzione per saggio mitocondriale o massa. Eseguire saggi XF per visualizzare il tasso di consumo di ossigeno o OCR in picomoli di ossigeno al minuto oppure i livelli assoluti di ossigeno e pH.Nell'output dei dati. Aggiungere una concentrazione 10 x dei composti in una massa X ai pozzetti A-D del respirometro a piastra per ottenere la concentrazione finale indicata nel protocollo testuale. Preparare un volume sufficiente di composti per il numero richiesto di pozzetti.Utilizzare i calcoli proteici misurati in precedenza per determinare le concentrazioni di mitocondri da aggiungere. Stabilire la quantità ottimale di mitocondri titolando uno microgrammo, 2,5 microgrammi e cinque microgrammi di mitocondri per pozzetto. Della piastra a 24 pozzetti per minimizzare la variabilità tra i pozzetti.Prima diluire 10 x mitocondri in massa fredda, una x più substrato. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di questa sospensione in ciascun pozzetto. Lasciare quattro pozzetti contenenti soltanto 50 microlitri di massa da utilizzare come letture di fondo.Posizionare la piastra di calibrazione pre-ammollata insieme alla cartuccia superiore utilizzata in precedenza nel respirometro per eseguire la calibrazione dello strumento. Prima di procedere con la corsa della piastra sottoposta al test, centrifugare la piastra a 2000 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione.Aggiungere delicatamente 450 microlitri di un x mass, più succinato e rotenone noto a ciascuno. Osservare attentamente le mitocondrie al microscopio per assicurare un'adesione omogenea al fondo della pozzetta prima di trasferire la piastra nell'analizzatore XF. Misurare sequenzialmente la respirazione mitocondriale in tempo reale utilizzando il respirometro, programmandolo secondo le impostazioni per il respirometro fornite nel protocollo testuale mostrato qui; i profili tipici di respirometria ottenuti mediante il complesso due utilizzando uno microgrammo, 2,5 microgrammi e cinque microgrammi di mitocondri sono quelli previsti.Complessivamente, l'OCR aumenta con quantità maggiori di mitocondri. Il rapporto di controllo respiratorio calcolato, o RCR, per questo saggio è pari a 7,95, indicando che la preparazione mitocondriale è di alta qualità, necessaria per confrontare la coerenza dei risultati durante il profilo di diverse quantità di mitocondri. È stata eseguita l'analisi di varianti o di Inova e calcolata la somma dei quadrati. La somma dei quadrati, o SS, è riportata per lo stato due, lo stato tre, lo stato tre disaccoppiato, antimicina A e RCR per le misurazioni dello stato due e dello stato tre in un solo verso.Innova era statisticamente significativo sia per ANTIMYCIN che per RCR. Non è stata osservata alcuna differenza significativa per lo stato tre scollegato tra i gruppi. Questi risultati indicano che cinque microgrammi di mitocondri per pozzetto hanno fornito il SS più basso rispetto ad altre concentrazioni.Questo grafico serve come guida per indicare la quantità di proteine mitocondriali ottenibile in base alla dimensione iniziale del campione muscolare. Come previsto, esiste una forte correlazione tra la quantità di muscolo processata e il contenuto totale di proteine mitocondriali del campione finale. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in meno di tre ore se eseguita correttamente.Dopo la biopsia muscolare, è importante assicurarsi che il paziente non assuma aspirina, ibuprofene o altri farmaci non steroidei senza prescrizione medica per i successivi tre giorni, al fine di garantire una corretta guarigione dei tessuti sottoposti a biopsia. Inoltre, è necessario verificare che il paziente non svolga alcuna attività fisica intensa per le successive 36 ore, evitando in particolare movimenti bruschi o traumanti, come nel caso di sport come il basket o l'uso del trampolino, ma che possa comunque svolgere le normali attività quotidiane.Chiediamo inoltre di mantenere l'area asciutta per 24 ore, ma la prima volta che dovesse bagnarsi, è preferibile che avvenga sotto la doccia, in modo che eventuali tipi di batteri presenti sulla pelle che non sono stati rimossi non entrino nella ferita chirurgica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una comprensione migliore di come eseguire una biopsia del tessuto muscolare scheletrico laterale S, isolare i mitocondri e misurare il controllo respiratorio.

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Questo protocollo descrive una procedura per studiare la respirazione dei mitocondri isolati da muscolo scheletrico. Questo metodo è stato adattato da...

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico

Un metodo rapido isolamento dei mitocondri da biopsie di tessuto mammiferi è descritto. Fegato di ratto o preparazioni muscolari scheletriche sono stati omogeneizzati con un dissociatore tessuto commerciale e mitocondri sono stati isolati per filtrazione differenziale attraverso filtri a rete di nylon. Tempo di isolamento mitocondriale è &lt;30 min rispetto ai 60 - 100 min con metodi alternativi.

Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

I metodi presentati forniscono istruzioni passo dopo passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi respirometrici basati su micropiastre utilizzando mitocondri isolati da quantità minime di muscolo scheletrico di topo. Questi saggi sono in grado di misurare i cambiamenti/adattamenti meccanicistici nel consumo di ossigeno mitocondriale in un modello animale di uso comune.

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Qui, presentiamo una modifica di un metodo precedentemente riportato che consente l'isolamento di mitocondri purificati e di alta qualità da piccole quantità di muscolo scheletrico di topo. Questa procedura si traduce in mitocondri altamente accoppiati che respirano con elevata funzione durante i saggi respirometrici basati su micropiastre.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Qui, un campione di muscolo quadricipite viene prelevato da un maiale anestetizzato e i mitocondri vengono isolati mediante centrifugazione differenziale. Quindi, le frequenze respiratorie dei complessi della catena respiratoria mitocondriale I, II e IV vengono determinate utilizzando la respirometria ad alta risoluzione.

L&#39;isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

Abbiamo progettato e costruito un laboratorio mobile per misurare la frequenza respiratoria nei mitocondri isolati di animali selvatici catturati sul campo. Qui descriviamo la progettazione e l'allestimento di un laboratorio mitocondriale mobile e i protocolli di laboratorio associati.

Sviluppo di un laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale per la misura dell'energetica mitocondriale sul campo

I mitocondri sono organelli metabolici chiave che mostrano un alto livello di plasticità fenotipica nel muscolo scheletrico. L'importazione di proteine dal citosol è una via critica per la biogenesi degli organelli, essenziale per l'espansione del reticolo e il mantenimento della funzione mitocondriale.  Pertanto, l'importazione di proteine funge da barometro della salute cellulare.

Misurazione della capacità di importazione di proteine dei mitocondri del muscolo scheletrico

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo e la successiva analisi della respirazione mediante Oxygen Consumption Rate (OCR) utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre. Questa pipeline può essere applicata per studiare gli effetti di molteplici interventi ambientali o genetici sul metabolismo mitocondriale.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici

I cavalli hanno un'eccezionale capacità di esercizio aerobico, rendendo il muscolo scheletrico equino un tessuto importante sia per lo studio della fisiologia dell'esercizio equino che per la fisiologia mitocondriale dei mammiferi. Questo articolo descrive le tecniche per la valutazione completa della funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico equino.

Fluoro-respirometria ad alta risoluzione del muscolo scheletrico equino

Qui, descriviamo un metodo completo per misurare la fosforilazione ossidativa mitocondriale in fibre muscolari scheletriche fresche permeabilizzate da muscolo umano o di topo. Questo metodo consente la quantificazione in tempo reale della respirazione mitocondriale e la valutazione della preferenza per il carburante e della flessibilità metabolica, preservando le reti mitocondriali esistenti e l'integrità della membrana.

Misurazione della respirazione mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche umane e di topo mediante repirometria ad alta risoluzione

Impara a valutare il controllo respiratorio nei mitocondri isolati da biopsia percutanea del muscolo scheletrico. Questa tecnica richiede solo 20 mg di tessuto ed è ideale per la ricerca clinica.

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea (Video) | JoVE Journal

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

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