Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare il controllo respiratorio nei mitocondri isolati da tessuto muscolare scheletrico ottenuto mediante biopsia. Questo viene realizzato innanzitutto prelevando una piccola quantità di muscolo mediante biopsia percutanea con ago. Il secondo passaggio consiste nell'isolare i mitocondri dal muscolo biopsiato mediante omogeneizzazione.

Successivamente, i mitocondri isolati vengono lavati e separati dalle frazioni non mitocondriali mediante centrifugazione e filtrazione del campione attraverso una garza di tela. L'ultimo passaggio consiste nell'allestire i mitocondri isolati per eseguire un'analisi respirometrica mediante saggi di flusso extracellulare, al fine di visualizzare il tasso di consumo di ossigeno. In definitiva, l'analizzatore di flusso extracellulare Seahorse viene utilizzato per esaminare il controllo respiratorio nei mitocondri isolati.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che richiede una quantità minima di tessuto muscolare pari a soli 20 milligrammi e riduce la variabilità tra esperimenti. Queste caratteristiche rendono la tecnica adatta ad applicazioni nella ricerca clinica. Le implicazioni di questa tecnica riguardano la diagnosi di disfunzione mitocondriale nei pazienti.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la biopsia muscolare e l'isolamento dei mitocondri richiedono manipolazioni precise che è preferibile mostrare visivamente piuttosto che descrivere esclusivamente nel testo. Per eseguire la biopsia in loco, somministrare lidocaina al 1%, avendo cura di non infiltrare il muscolo. Successivamente, attendere 10 minuti.

Per consentire un'adeguata anestesia, prelevare i campioni bioptici dalla regione centrale del muscolo compresa tra inserzione e origine, evitando le aree sottofasciali e miotendinee. Per raggiungere questo obiettivo, utilizzare innanzitutto un ago percutaneo e seguire il "pop" fasciale o la resistenza della fascia come guida. Stimare la profondità con l'ago anestetico, quindi verificarla con la lama stretta del bisturi ed eseguire un'incisione di quattro-cinque millimetri attraverso la fascia.

Avanzare l'ago attraverso l'incisione fino a quando non viene inserito nel muscolo. Raccogliere diversi campioni ruotando la finestra in direzioni diverse. Applicare un'aspirazione continua utilizzando una siringa da 60 centimetri cubi mentre si avanzano e si ritirano i campioni muscolari all'interno dell'ago percutaneo da due a quattro volte in diverse direzioni.

Interrompere l'aspirazione e rimuovere l'ago. Far sì che un assistente applichi una pressione ferma sul sito di puntura per cinque minuti. Per ottenere l'emostasi, scollegare l'ago dal tubo di aspirazione e rimuovere con attenzione i campioni muscolari dalla finestra e dal corpo dello strumento.

Eseguire un secondo passaggio se è necessario ulteriore muscolo, ripetendo questa procedura. Rimuovere eventuali coaguli di sangue visibili dal campione muscolare utilizzando pinzette. Quindi pesare il campione e posizionarlo immediatamente in un tubo contenente ghiaccio.

Salina tamponata al fosfato fredda ECCOs o DPBS. Rimuovere accuratamente i tessuti connettivi visibili dal campione utilizzando forbici affilate e pinzette. Lavare i campioni da tre a quattro volte con tampone DPBS ghiacciato.

Per rimuovere il sangue, mantenere i campioni in DPBS ghiacciato ed elaborarli il più rapidamente possibile. Entro 45 minuti dalla biopsia, prestare attenzione a rimuovere con cura eventuali tendini o tessuto adiposo dal campione muscolare. Rimuovere una piccola porzione di tessuto in eccesso per la conservazione a meno 80 gradi Celsius.

Questo può essere utilizzato per altri esperimenti, come ad esempio i blot di Western. Tagliare immediatamente il tessuto muscolare in piccoli pezzi. Utilizzando un paio di forbici sterili, sospenderlo quindi in 500 microlitri fino a un millilitro di un inibitore ACE delle proteine Sistine, come ad esempio nagars disciolti nel buffer CP uno a una concentrazione di 0,2 milligrammi per grammo di tessuto.

Trinciare il campione fino a quando non appare ben sospeso. Procedere con un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente prima di trasferire sul ghiaccio, assicurandosi che l'omogeneizzatore sia accuratamente lavato in precedenza. Omogeneizzare il tessuto tritato trattato con nagars.

Utilizzando un omogeneizzatore automatico. Mantenere il campione sul ghiaccio per tutta la durata di questo processo. Omogeneizzare ogni campione di tessuto quattro volte, con un impulso di due secondi ciascuna.

Utilizzando l'omogeneizzatore automatico a una velocità di impostazione di 10.000 giri/min, riporre il campione sul ghiaccio. Lavare la sonda con etanolo al 70% seguito da acqua distillata tra un tessuto e l'altro. A questo punto, lavare il tessuto omogeneizzato con un volume equivalente di buffer chapel Perry uno o CP uno.

Quindi lavare il tessuto con il doppio del volume del tampone CP due. Aggiungere il tubo di bilanciamento portando l'acqua allo stesso volume in un altro tubo conico. Raccogliere il contenuto in un tubo da centrifuga e centrifugare a 600 ×g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Inumidire preventivamente la garza per permettere a tutte le particelle di passare senza rimanere intrappolate nel tessuto.

Filtrare il soprannatante attraverso un canovaccio piegato, raccogliendo il filtrato e scartando il pellet, rimuovendo così la maggior parte delle frazioni non mitocondriali. Successivamente, ultracentrifugare il soprannatante a 10.000 ×g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Sospendere il pellet in quattro millilitri di buffer CP2 prima di centrifugare una seconda volta nello stesso modo dopo la centrifugazione.

Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in due millilitri di tampone CP uno. A questo punto, prelevare un'aliquote piccola da questa sospensione e trasferirla in un tubo da prova separato da utilizzare per la stima proteica. Risospendere il campione rimanente nel tampone CP uno e centrifugare.

Come in precedenza, si osservi che la piastra proteica deve essere preparata con gli standard durante le precedenti fasi di centrifugazione. Infine, risospendere il pellet finale in una quantità minima di soluzione per saggio mitocondriale o massa. Eseguire saggi XF per visualizzare il tasso di consumo di ossigeno o OCR in picomoli di ossigeno al minuto oppure i livelli assoluti di ossigeno e pH.

Nell'output dei dati. Aggiungere una concentrazione 10 x dei composti in una massa X ai pozzetti A-D del respirometro a piastra per ottenere la concentrazione finale indicata nel protocollo testuale. Preparare un volume sufficiente di composti per il numero richiesto di pozzetti.

Utilizzare i calcoli proteici misurati in precedenza per determinare le concentrazioni di mitocondri da aggiungere. Stabilire la quantità ottimale di mitocondri titolando uno microgrammo, 2,5 microgrammi e cinque microgrammi di mitocondri per pozzetto. Della piastra a 24 pozzetti per minimizzare la variabilità tra i pozzetti.

Prima diluire 10 x mitocondri in massa fredda, una x più substrato. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di questa sospensione in ciascun pozzetto. Lasciare quattro pozzetti contenenti soltanto 50 microlitri di massa da utilizzare come letture di fondo.

Posizionare la piastra di calibrazione pre-ammollata insieme alla cartuccia superiore utilizzata in precedenza nel respirometro per eseguire la calibrazione dello strumento. Prima di procedere con la corsa della piastra sottoposta al test, centrifugare la piastra a 2000 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione.

Aggiungere delicatamente 450 microlitri di un x mass, più succinato e rotenone noto a ciascuno. Osservare attentamente le mitocondrie al microscopio per assicurare un'adesione omogenea al fondo della pozzetta prima di trasferire la piastra nell'analizzatore XF. Misurare sequenzialmente la respirazione mitocondriale in tempo reale utilizzando il respirometro, programmandolo secondo le impostazioni per il respirometro fornite nel protocollo testuale mostrato qui; i profili tipici di respirometria ottenuti mediante il complesso due utilizzando uno microgrammo, 2,5 microgrammi e cinque microgrammi di mitocondri sono quelli previsti.

Complessivamente, l'OCR aumenta con quantità maggiori di mitocondri. Il rapporto di controllo respiratorio calcolato, o RCR, per questo saggio è pari a 7,95, indicando che la preparazione mitocondriale è di alta qualità, necessaria per confrontare la coerenza dei risultati durante il profilo di diverse quantità di mitocondri. È stata eseguita l'analisi di varianti o di Inova e calcolata la somma dei quadrati. La somma dei quadrati, o SS, è riportata per lo stato due, lo stato tre, lo stato tre disaccoppiato, antimicina A e RCR per le misurazioni dello stato due e dello stato tre in un solo verso.

Innova era statisticamente significativo sia per ANTIMYCIN che per RCR. Non è stata osservata alcuna differenza significativa per lo stato tre scollegato tra i gruppi. Questi risultati indicano che cinque microgrammi di mitocondri per pozzetto hanno fornito il SS più basso rispetto ad altre concentrazioni.

Questo grafico serve come guida per indicare la quantità di proteine mitocondriali ottenibile in base alla dimensione iniziale del campione muscolare. Come previsto, esiste una forte correlazione tra la quantità di muscolo processata e il contenuto totale di proteine mitocondriali del campione finale. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in meno di tre ore se eseguita correttamente.

Dopo la biopsia muscolare, è importante assicurarsi che il paziente non assuma aspirina, ibuprofene o altri farmaci non steroidei senza prescrizione medica per i successivi tre giorni, al fine di garantire una corretta guarigione dei tessuti sottoposti a biopsia. Inoltre, è necessario verificare che il paziente non svolga alcuna attività fisica intensa per le successive 36 ore, evitando in particolare movimenti bruschi o traumanti, come nel caso di sport come il basket o l'uso del trampolino, ma che possa comunque svolgere le normali attività quotidiane.

Chiediamo inoltre di mantenere l'area asciutta per 24 ore, ma la prima volta che dovesse bagnarsi, è preferibile che avvenga sotto la doccia, in modo che eventuali tipi di batteri presenti sulla pelle che non sono stati rimossi non entrino nella ferita chirurgica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una comprensione migliore di come eseguire una biopsia del tessuto muscolare scheletrico laterale S, isolare i mitocondri e misurare il controllo respiratorio.