Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare l'entità dell'arborizzazione dendritica nell'ippocampo di un modello murino. Ciò si ottiene attraverso due metodi diversi. Nel primo metodo, i dendriti vengono tracciati manualmente in tempo reale su tutto lo spessore di ogni sezione.

Dopo il tracciamento, l'intero albero dendritico può essere ricostruito e analizzato. Utilizzando il diagramma a ventaglio, l'analisi di vari diagrammi a ventaglio derivati da diversi mouse può essere utilizzata come mezzo oggettivo di confronto. Il secondo metodo consiste nel visualizzare l'arborizzazione dendritica con l'imaging della profondità di campo estesa.

Infine, viene utilizzato un metodo panoramico per unire più immagini ad alto ingrandimento per produrre un'immagine composita ad alta risoluzione per la valutazione qualitativa e quantitativa dei dendriti nell'intera regione di interesse E la dimostrazione di questa procedura sarà GI mobi. La ricerca sull'IMA proviene dal mio laboratorio. Il vantaggio principale di queste tecniche rispetto ai metalli esistenti è la facilità d'uso e la velocità di acquisizione e raccolta dei dati.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia, come la valutazione della dendritica nelle regioni cerebrali colpite e la valutazione degli effetti di diverse terapie sui dendriti. In questa procedura, un giorno dopo che il cervello del topo è stato fissato in aldeide paraforme al 4%, metterlo in una soluzione di saccarosio per la disidratazione per 48 ore a quattro gradi Celsius. Togliete il cervello dal saccarosio e posizionatelo direttamente su blocchi di rame posti sul ghiaccio secco.

Riempi il blocco con OCT e segna l'orientamento del cervello usando il bulbo olfattivo come punto di riferimento. Tagliare sezioni spesse 70 micron a -20 gradi Celsius utilizzando un criostato e metterle in una soluzione crioprotettiva e mantenerle a -20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Incubare le sezioni in perossido di idrogeno in metanolo per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi riscaldarle a 37 gradi Celsius in TBS per mezz'ora.

Incubare le sezioni con Triton allo 0,3% e siero di cavallo normale per 45 minuti a temperatura ambiente prima di colorare con l'anticorpo DCX il giorno successivo. Lavare le sezioni tre volte consecutive in TBS e incubare le sezioni con un antigo di cavallo biotinilato per due ore a temperatura ambiente. Lavare le sezioni tre volte consecutive in TBS per 10 minuti ciascuna e incubarle con una luce B, C per 1,5 ore.

A temperatura ambiente, aggiungere perossido di idrogeno alla soluzione DAB e incubare immediatamente le sezioni in questa soluzione per cinque minuti e terminare la reazione lavandole tre volte con TBS ghiacciato seguito da uno. Lavare in TT BS a temperatura ambiente. Disidratare le sezioni utilizzando una serie di soluzioni di etanolo.

Cinque minuti ciascuno, trasparente e xilene, e poi vetrino coprioggetto utilizzando DPX. Dopo che le sezioni sono state completamente asciugate, pulire il DPX in eccesso sulle superfici del vetrino con una lama affilata e posizionarle sul tavolino di scansione del microscopio una alla volta. Il sistema di visualizzazione è composto da un microscopio dotato di un joystick a scansione e da una telecamera a colori a 12 bit.

Quindi, avvia il programma neuro lucita e apri un nuovo file di dati. Posiziona un punto di riferimento sullo schermo facendo clic in qualsiasi punto con un puntatore del mouse per attivare tutte le icone dal pannello degli strumenti della finestra del programma. Quindi fare clic sull'icona senza joystick sulla barra degli strumenti e utilizzare il joystick per individuare il giro dentato dell'ippocampo.

Nella prima sezione della scheda strumenti della finestra del programma, selezionare Serial Section Manager. Fare clic sull'icona della nuova sezione nell'angolo in basso a sinistra della finestra per aprire la finestra di configurazione della sezione seriale. Successivamente, seleziona la finestra di configurazione della sezione seriale e inserisci il numero totale di sezioni che contengono regioni ippocampali.

Quindi selezionare l'intervallo di valutazione e inserire lo spessore della sezione. Inizia a tracciare la regione del giro dentato facendo clic sull'icona del disegno del contorno a mano libera nella barra degli strumenti. Successivamente delineare lo strato di cellule granulari dentate.

Selezionare 100x dal menu di ingrandimento. Quindi aggiungere una goccia di olio da immersione sulla sezione e portare l'obiettivo a 100 x. Localizzare i corpi cellulari dei granuli dentati e i dendriti sotto questo obiettivo.

Quindi, concentrati su un neurone selezionato e fai clic sull'icona del tracciamento dei neuroni. Sulla barra degli strumenti tracciare la circonferenza del corpo cellulare del granulo dentato. Al termine del tracciamento, fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare termina il corpo della cella.

Ora inizia a tracciare manualmente i dendriti e le direzioni X, Y e Z e segui ogni ramo usando il joystick e la manopola del motore Z In un nodo di biforcazione o triforcazione, seleziona la rispettiva opzione. Dal menu a discesa, traccia ciascuno dei rami che nascono da questi nodi alla fine di ogni ramo. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare la fine dal menu a discesa.

Utilizzando le icone dei tasti freccia nella finestra del software. Selezionare casualmente un'altra cella di granulo dentato e ripetere la procedura di tracciamento come appena dimostrato. Salva l'intero tracciamento.

Ora avvia Neuro Lucita Explorer per l'analisi dei neuroni. Apri il primo file di dati NRX dal primo topo del gruppo sperimentale. Aggiungere il file NRX del secondo mouse del gruppo sperimentale e continuare fino a quando non vengono aggiunti tutti i file NRX di questo gruppo.

Nella scheda di analisi, selezionare la ventola nel diagramma per aprire la ventola nella finestra di analisi, selezionare i dendriti e fare clic su Visualizza per i collegamenti e i modelli di ramificazione dei dendriti per questo gruppo di topi. In questa procedura, collegare il microscopio a una fotocamera digitale. Posizionare una sezione sul tavolino di scansione collegato al microscopio e passare a un obiettivo 10x.

Quindi, sposta la fase nell'area di interesse. Avviare un programma di acquisizione video e premere il pulsante di registrazione. Non appena si preme il pulsante di registrazione, utilizzare la manopola di messa a fuoco macro per spostarsi dall'alto verso il basso della sezione per un totale di quattro secondi Prima di salvare il file video risultante, utilizzare il freeware Image J per convertire i file video a VI in un formato non compresso.

Avvia un programma di analisi delle immagini e apri il file a VI. Vai al menu di processo e fai clic su profondità di campo estesa. Seleziona il file video corrispondente nelle opzioni di output.

Selezionare Genera immagine di messa a fuoco migliore composita nelle opzioni di analisi della messa a fuoco. Selezionare le opzioni di illuminazione normalizzata e contrasto locale massimo. Quindi fare clic su Crea per generare un'immagine risultante, che rappresenta tutti i pixel focalizzati lungo l'asse Z.

Successivamente, salva l'immagine risultante. In questa fase, posizionare una sezione sul tavolino di scansione collegato al microscopio. Sposta la fase nell'area di interesse.

Avvia quindi il programma di acquisizione delle immagini utilizzando un obiettivo 10x, acquisisci e salva immagini ad alta risoluzione dalla regione di interesse, assicurandoti di avere almeno il 10% di sovrapposizione tra le immagini. Quindi esegui l'editor composito di immagini per unire le immagini in seguito. Vai al menu file e fai clic su nuovo panorama.

Seleziona la cartella in cui sono memorizzate le immagini. Quindi, seleziona le immagini che appartengono alla stessa regione e premi Ok. Premere il pulsante Esporta su disco e salvare l'immagine.

Questa immagine rappresenta un'immagine ad altissima risoluzione dell'area di interesse che potrebbe essere utilizzata per l'analisi. Questa figura mostra la visualizzazione dell'arborizzazione dendritica con e senza metodi EDFI. Il metodo tradizionale per trovare il miglior piano di messa a fuoco è stato confrontato con EDFI e valori significativamente più elevati dell'area dendritica.

Utilizzando il metodo EDFI sono stati trovati. Qui viene mostrata la quantificazione della lunghezza e del volume occupati dai dendriti in diversi ordini di ramificazione. La lunghezza e il volume massimi sono stati raggiunti nel primo ordine.

Ecco un istogramma della lunghezza dendritica delle cellule dei granuli dentati. La maggior parte dei segmenti dendritici delle DDR con colorazione DCX erano lunghi da 13 a 26. Questa linea tratteggiata rossa rappresenta la normale distribuzione dei dati presentati Seguendo questa procedura.

Altri metodi classici come neuro Lucid potrebbero essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande riguardanti il volume e l'area occupata dai dendriti. Questa tecnica che vi abbiamo mostrato qui aiuterà enormemente i ricercatori nel campo della neurobiologia non solo a valutare l'azione delle strutture neuronali, ma anche a valutare piccole strutture non neuronali come la microglia in sezioni spesse del cervello. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare l'entità delle proiezioni neuronali in un periodo di tempo relativamente breve.