Name: Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Impara a valutare l'arborizzazione dendritica nel giro dentato dell'ippocampo nei topi con tracciamento in tempo reale e imaging a profondità di campo estesa. Questi metodi consentono analisi dettagliate della morfologia neuronale.

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Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni della LuMind Foundation, della Research Down Syndrome e dell'Alzheimer's Association (AS). CP è stato parzialmente supportato da una sovvenzione per lo sviluppo della facoltà del College of Nursing and Health Professions dell'Arkansas State University.

NOTA: Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con gli standard etici approvati dalla commissione per la ricerca degli animali presso il sistema sanitario Veterans Affairs Palo Alto. 1. Golgi-Cox colorazione <ol><li> Estrazione del cervello e colorazione <ol><li> Il 1 ° giorno, anestetizzare profondamente topi con 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xylazina prima eutanasia via dissanguamento. </li><li> Rimuovere con cautela la calotta cranica e sezionare il cervello. <ol><li> Prima rimuovere la pelle sulla parte superiore del cranio, ponendo una forbice curva sulla parte superiore del cervelletto e delicatamente tagliare il cranica parallelo al solco centrale con la punta della forbice rilevato verso l&#39;esterno, si muove nella direzione verso il bulbo olfattivo. Ripetere questa operazione su entrambi i lati. </li><li> Utilizzare un pincet chirurgica per sollevare il cranica mentre si gira verso i bulbi olfattivi e troncare. Quindi, capovolgere il cranio a testa in giù e utilizzare un plettro per tagliare attraverso l&#39;otticanervi e allentare il cervello. Infine, utilizzare il pick per separare il cervello dal midollo spinale a livello del foro occipitale. </li></ol></li><li> Immergere immediatamente il cervello in 15 ml di disponibile in commercio, diluito soluzione Golgi-Cox. Conservare il cervello in soluzione Golgi in una bottiglia di vetro da 20 ml con tappo a temperatura ambiente al buio. </li><li> Il giorno 2, versare lentamente la soluzione e sostituirla con 15 ml di soluzione fresca Golgi-Cox. Richiudere il flacone contenente il cervello e lasciare riposare per altri 9 giorni al buio. </li></ol></li><li> Sezioni e embedment <ol><li> Il giorno 11, mettere il cervello in soluzione di saccarosio del 30%, preparati in DDH 2 O per disidratazione. Cambiare la soluzione appena preparata con 30% di saccarosio dopo 12 ore. Incubare i cervelli in una soluzione di saccarosio al 30% per 3 giorni a 4 ° C. </li><li> Il giorno 14, riempire il serbatoio del vibratome con una soluzione di saccarosio al 30% fino a che la lama è coperto. Impostare la velocità di 1 mm / s con un&#39;ampiezza di 0,95 mm. </li><li> Asciugare il cervello con un Kimwipe per eliminare l&#39;umidità in eccesso e rimuovere il cervelletto con una lama di rasoio per tagliare coronale. </li><li> Saldamente montare l&#39;intero cervello sulla piattaforma vibratome utilizzando colla e lasciare riposare per 2-4 minuti. Inserire la piattaforma con il cervello aderito nel serbatoio e regolare la lama all&#39;inizio del cervello. </li><li> Utilizzando vibratome, la fetta di cervello in 150 micron sezioni spesse a temperatura ambiente, ricordandosi di cambiare la lama dopo ogni 3 cervello. </li><li> Raccogliete le sezioni dal serbatoio con uno spazzolino capovolto e immergerli in una capsula di Petri contenente 0,3% di gelatina fatta in DDH 2 O. Mentre le sezioni rimangono nella capsula di Petri, aggiungere 0,5 ml di 0,3% di gelatina in ogni diapositiva e utilizzare un pennello per diffondere e rivestire le SuperFrost + diapositive. </li><li> Raccogliere delicatamente le sezioni immerse dalla capsula di Petri e metterli sulle diapositive gelatinizzati. Orientare le sezioni di cervello datoccarli solo sui loro lati e non sulle parti superiori. </li><li> Dopo circa dieci minuti, ricoprire le sezioni con il 30% di saccarosio prima il tessuto asciuga completamente. Poi asciugare i vetrini preparati in un luogo buio in un rack scorrevole per 3 giorni. </li><li> Diluire disponibile in commercio 10x soluzione di sviluppo a 1x con DDH 2 O. Immergere i vetrini in soluzione di sviluppo per 7-10 min. Sciacquare i vetrini 3 volte in DDH 2 O. </li></ol></li><li> Disidratazione <ol><li> Preparare 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, e 95% di etanolo usando soluzioni distillata DDH 2 O. </li><li> Immergere i vetrini in etanolo soluzioni sempre più elevati per 10 minuti ciascuna. </li><li> Immergere i vetrini in soluzione di etanolo al 100% per 3 volte per 10 minuti ogni volta. </li><li> Immergere i vetrini in 100% xilene 3 volte consecutive per 5 min ciascuna, mantenendo le sezioni nella soluzione finale fino a quando sono copertura scivolato. </li><li> Mettere una generosa quantità di DPX (Di-n-butil ftalato in xilene) mezzo di montaggio (about 1-1,5 ml) su ogni diapositiva con una pipetta di plastica. Posizionare con cura coprioggetto per evitare le bolle. </li><li> Coperchio a secco Air scivolato-cervello sezioni orizzontali per 3 giorni. </li></ol></li></ol> 2. Doublecortin colorazione <ol><li> Profondamente anestetizzare (vedi punto 1.1.1) gli animali. </li><li> Eseguire perfusione cardiaca con appena preparato 4% paraformaldeide fatto in tampone fosfato 12. </li><li> Estrarre il cervello (vedi 1.1.2) e conservare in 45 ml di paraformaldeide 4% a 4 ° C durante la notte su un agitatore a dondolo. </li><li> Trasferire il cervello per una soluzione di saccarosio al 30% e attendere la completa disidratazione per 48 ore a 4 ° C. Togliere il cervello dal saccarosio e metterli direttamente su blocchi di rame poste in ghiaccio secco. </li><li> Riempire il blocco con temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e segnare l&#39;orientamento del cervello utilizzando il bulbo olfattivo come punto di riferimento. </li><li> Utilizzando un criostato, tagliare 70 sezioni micron di spessore a -20 ° C e collocarliin soluzione crioprotettore (25% di glicole etilenico, glicerolo 25%, in tampone fosfato 0,05 M di sodio, pH 7,4) e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Effettuare una soluzione di 50% crioprotettore e 50% di metanolo. A questa soluzione aggiungere 0,5% di perossido di idrogeno (vol / vol). Incubare sezioni galleggianti per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sezioni caldi in 37 ºC a TBS (soluzione fisiologica tamponata con Tris) per 30-40 min mettendoli in un forno a istologico. </li><li> Incubare le sezioni con lo 0,3% tritone e siero di cavallo normale 3% per 45 minuti a temperatura ambiente prima della colorazione. Incubare sezioni a 4 ° C durante la notte in 3 ml di soluzione di anticorpo DCX diluito 1: 500 in TBS con 0,3% Triton e siero di cavallo normale 1%. </li><li> Il giorno seguente lavare sezioni 3 volte consecutive in TBS (10 min ciascuna). </li><li> Incubare sezioni con un anti-capra biotinilato cavallo (1: 200 in TBS) per due ore a temperatura ambiente. Lavare le sezioni 3 volte consecutive in TBS (10 min ciascuna). </li><li> Incubare torlo con ABC Lite (1: 1.000) per 1,5 ore a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 5 ml di 30% H 2 O 2 ad una compressa di 10 mg di soluzione di DAB (3,3 &quot;-Diaminobenzidine) sciolti in 15 ml di 1 M Tris-HCl (pH 7,6). Incubare immediatamente sezioni in questa soluzione per 5 min. </li><li> Terminare la reazione mediante lavaggio con TBS ghiacciata tre volte seguito da un lavaggio in TBS a temperatura ambiente. </li><li> Disidratare sezioni utilizzando una serie di soluzioni di etanolo (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 min ciascuna), xilene, e quindi coprire slittamento usando DPX come al punto 1.3. </li></ol> 3. Visualizzazione <ol><li> Dopo completa asciugatura delle sezioni, rimuovere l&#39;eccesso DPX sopra i vetrini con una lama affilata, e metterli in fase di scansione del microscopio. Il sistema è composto da un microscopio dotato di fase scansione, joystick, e una telecamera a colori 12 bit. </li><li> Avviare il programma. Aprire un nuovo file di dati. </li><li> Luogoun punto di riferimento sullo schermo cliccando con il puntatore del mouse in qualsiasi luogo. Questo attiverà tutte le icone dal pannello degli strumenti di finestra del programma. </li><li> Fare clic sull&#39;icona &quot;Joystick Free&quot; sulla barra degli strumenti e quindi utilizzare il joystick per individuare giro dentato dell&#39;ippocampo nella prima sezione. </li><li> Nella scheda &quot;Tools&quot; della finestra del programma, selezionare &quot;Gestione Sezioni seriale&quot;. Fare clic sull&#39;icona &quot;Nuova sezione&quot; nell&#39;angolo in basso a sinistra della finestra. Si aprirà la finestra &quot;Setup Serial Sezione&quot;. </li><li> Selezionare la finestra Serial Setup sezione e poi inserire il numero totale di sezioni che contengono regioni dell&#39;ippocampo. Selezionare l&#39;intervallo di valutazione. Inserire lo spessore della sezione di taglio (70 micron per DCX e 150 micron per le sezioni Golgi-colorate). </li><li> Avviare tracciando la regione giro dentato, cliccando sull&#39;icona &quot;Freehand Disegno a contorno&quot; nella barra degli strumenti. Delineare lo strato di cellule granulari dentate. &lt;/ Li&gt; <li> Selezionare &quot;100X&quot; dal menu &quot;Ingrandimento&quot;. Aggiungere una goccia di olio di immersione sulla sezione e passare l&#39;obiettivo di 100X. Individuare i corpi cellulari granuli dentate e dendriti nell&#39;ambito di tale obiettivo. </li><li> Concentrarsi su un neurone selezionato e fare clic sull&#39;icona &quot;Neuron Tracing&quot; sulla barra degli strumenti. Tracciare la circonferenza del corpo cellulare dei granuli dentate. Al termine l&#39;analisi, fare clic destro per selezionare &quot;Finish cellulare Body&quot;. </li><li> Avviare rintracciare i dendriti manualmente in x, y, e Z e seguire ogni ramo con la manopola joystick ez-motore. In un nodo biforcazione o triforcazione, selezionare la relativa opzione dal menu a discesa sulla destra del mouse. Tracciare ciascuno dei comparti che nascono da questi nodi. Al termine di ciascun ramo destro del mouse e selezionare &quot;Ending&quot; dal menu a discesa. </li><li> Utilizzando le icone dei tasti freccia nella finestra del software seleziona a caso un altro cellulare dei granuli dentate e seguire la stessa procedura described in fase 3,9-3,10. Salvare l&#39;intero tracciato. </li><li> Avviare il software tracciato neuronale. </li><li> Aprire il primo file di dati NRX dal primo mouse del gruppo sperimentale. Aggiunge il file NRX del secondo mouse del gruppo sperimentale. Continuare fino a quando tutti i file NRX di questo gruppo vengono aggiunti. </li><li> Nella scheda Analisi, selezionare &quot;Fan In-schema&quot;. Questo apre la In-analisi finestra Fan. Segno di spunta &quot;dendriti&quot; e fare clic su Visualizza, che raffigura le lunghezze e modelli di ramificazione di dendriti per questo gruppo di topi (figura 1). </li></ol> 4. EDFI NOTA: Questo metodo permette all&#39;utente di registrare rapidamente un gran numero di immagini attraverso l&#39;asse z di ciascun campo e generare un&#39;immagine 2D che contiene tutti i pixel focalizzato durante l&#39;asse z. Il risultato sarà un&#39;immagine composita che contiene tutti i pixel focalizzato da immagini raccolte. <ol><li> Collegare il microscopio ad una camma digitaleera. Collocare le sezioni prima sulla scena scansione collegato al microscopio e poi passare ad un obiettivo 10X. Spostare il palco per l&#39;area di interesse. </li><li> Avviare un programma di cattura video. </li><li> Premere il pulsante di registrazione. Non appena viene premuto il pulsante di registrazione, usare la manopola macro-focus per passare dalla parte superiore alla parte inferiore della sezione per un totale di 4 sec. Salvare il file video risultante. </li><li> Utilizzare ImageJ freeware per convertire i file video AVI in un formato non compresso aprendo il file e salvarli in formato non compresso. </li><li> Avviare un programma di analisi di immagine e aprire il file AVI. Vai al menu &quot;Azione&quot; e fare clic su &quot;profondità di campo estesa&quot;. Selezionare il file video corrispondente. In opzioni &quot;uscita&quot;, selezionare &quot;Genera Composite Best-Focus Immagine&quot;. </li><li> In Opzioni &quot;Analisi Focus&quot;, selezionare &quot;normalizzato Illumination&quot; e le opzioni &quot;Contrasto Locale Max&quot;. Quindi, selezionare &quot;Cremangiato &quot;. L&#39;immagine risultante rappresenta tutti i pixel focalizzato durante l&#39;asse z (Figura 2). </li><li> Salvare l&#39;immagine risultante. </li></ol> 5. Generare Estremamente ad alta risoluzione Immagini NOTA: Questo metodo consente all&#39;utente di generare automaticamente basso ingrandimento e immagini estremamente alta risoluzione di immagini ad alto ingrandimento ad alta risoluzione in modo automatizzato. <ol><li> Collocare le sezioni prima sulla scena scansione collegato al microscopio. Il microscopio è collegato ad una fotocamera digitale. Spostare il palco per l&#39;area di interesse. </li><li> Avviare un programma di acquisizione delle immagini. </li><li> Utilizzare un obiettivo 10X e di acquisire e salvare ad alta risoluzione (4076 x 3116), immagini dalla regione di interesse fare in modo di avere almeno il 10% di sovrapposizione. </li><li> Immagine Eseguire Composite Editor di unire immagini. </li><li> Vai al menu File, e cliccare su &quot;New Panorama&quot;. Selezionare la cartella in cui le immagini sono stORed. Selezionare le immagini che appartengono alla stessa regione e premere &quot;OK&quot;. </li><li> Premere il pulsante &quot;Esporta su disco&quot; e salvare l&#39;immagine. Questa immagine rappresenta un&#39;immagine ad alta risoluzione estremamente dell&#39;area di interesse che potrebbero essere utilizzati per l&#39;analisi e / o dimostrazione (Figura 3). </li></ol>

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Qui, due metodi sono stati descritti per quantificare l&#39;entità del dendritica in neuroni maturi e appena nati con metodi di colorazione convenzionali in collaborazione con RTI e EDFI. L&#39;acquisizione di immagini ad alta risoluzione di neuroni fornisce un metodo estremamente utile per testare gli effetti deleteri di malattie neurodegenerative e, a sua volta, fornisce un mezzo per valutare strategie terapeutiche che colpiscono i neuroni ippocampali. Mentre il metodo RTI stato utilizzato...

Alterazioni dinamiche nel numero e la struttura delle sinapsi sono le caratteristiche distintive di sviluppo, l&#39;invecchiamento, e numerose malattie neurodegenerative 1-3. La capacità dei neuroni di ricevere e integrare le informazioni sinaptica dipende morfologia dendritica e alterazioni dinamiche connessioni sinaptiche. Infatti, esiste una correlazione positiva tra spine dendritiche e il numero di sinapsi, che sia un impatto funzione cognitiva 4. Quindi, non è sorprendente che decrementi in numero spine dendritiche sono stati associati a disfunzioni cognitive in una serie di disturbi neurologici 5-7, spingendo grande interesse spine dendritiche quantificazione. Tuttavia, la quantificazione della densità delle spine rimane un lungo e noioso compito che non riesce a generare informazioni utili per quanto riguarda la topografia e la distribuzione delle sinapsi in tutto il albero dendritiche. Fortunatamente, metodi di colorazione (ad esempio, Golgi-Cox e doublecortin (DCX)), in combinatocon tecniche di imaging sofisticate può essere utilizzata per superare gli attuali ostacoli e di produrre immagini ad alta risoluzione di dendritica in modo affidabile e rapido. Mentre metodo di colorazione Golgi-Cox può essere implementato per valutare lo stato di dendritica in tutti i neuroni 8, DCX può essere implementato di etichettare i neuroni appena nati in particolare nel giro dentato e zona subventricolare 9, una considerazione importante dato che la neurogenesi si verifica in entrambi queste regioni in tutto il ciclo di vita 10,11. Dopo la colorazione, due metodi di imaging sono stati dispiegati per valutare caratteristiche dendritiche: i) l&#39;imaging in tempo reale (RTI) e ii) ha esteso la profondità di campo dell&#39;imaging (EDFI). La tecnica RTI fornisce un mezzo per rintracciare e quantificare la lunghezza e ordine delle arborization lungo i singoli segmenti dendritiche e rami. Così permette di stimare la superficie totale e volume occupato da ciascun albero dendritico. Più specifically, nel metodo RTI l&#39;utente identifica continuamente i segmenti e riorienta iterativamente il neurone tracciamento software raccoglie x, y, z e le coordinate della struttura dendritica e ricostruisce la traiettoria della struttura dendritica in 3D. Comparativamente, il metodo EDFI fornisce un mezzo piuttosto semplici e accelerate per valutare la densità dendritica in campioni di tessuto piuttosto spesse generando un&#39;immagine composita, fornendo informazioni sull&#39;intero asse z. Per fare ciò, l&#39;utente registra file video ad alta definizione in tutto lo spessore della sezione e quindi utilizza il software per cercare i fotogrammi video per identificare i punti in cui un pixel è completamente a fuoco. Successivamente, i pixel mirati sono fusi e integrati in un ad alta risoluzione, immagini 2D composita. Questa immagine composita contiene tutti i pixel che sono stati in-fuoco indipendentemente dalla loro posizione nell&#39;asse z. Analisi qualitativa e quantitativa di queste immagini 2D può essere utilizzato successivamente per determinare la densitàdi ramificazione dendritica in ogni campo. Infine, vi presentiamo un metodo per la generazione di immagini panoramiche estremamente ad alta risoluzione per l&#39;analisi e la valutazione dei dendriti in un&#39;intera regione di interesse. Questa tecnica può essere impiegata per superare la mancanza di accesso a molto ad alta risoluzione e fotocamere digitali costose. Utilizzando questo metodo, si cattura immagini seriali in diverse località lungo la xey assi e quindi automaticamente punti insieme con un freeware (per esempio, immagine Composite Editor). In particolare, questo metodo può essere utilizzato per la valutazione qualitativa e quantitativa di dendritica in piuttosto ampio spazio.

<table><tbody><tr><td>Soluzione colorante di Golgi-cox modificata&nbsp;</td><td>Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>negozio a 4 gradi C till use</td></tr><tr><td>1x Soluzione di sviluppo (Stock 10x)</td><td>Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>negozio a 4&deg; C fino a utilizzare</td></tr><tr><td>il 30% di saccarosio,</td> <td>Sigma</td><td>CAS # 57-50-1</td><td>fare fresco &nbsp; in ddH2O</td></tr><tr><td>0,3% Gelatina</td><td>Sigma</td><td>CAS # 9000-70-8</td><td>NA</td></tr><tr><td>Soluzioni di etanolo classificate (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)</td><td>Sigma</td><td>CAS 603-003-00-5</td><td>NA</td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Sigma</td><td>CAS # 1330-20-7</td><td>NA</td></tr><tr><td>DPX Medio</td><td>EMS&nbsp;</td><td>#13510</td><td>NA</td></tr><tr><td>Superfrost (+) bianco</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>71869-10</td><td>NA</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti 22x50mm (VWR #48393-059)</td><td>VWR&nbsp;</td><td>#4811-703</td><td>NA</td></tr><tr><td>DCX Anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8066 4</td><td>C</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma CAS</td><td>Numero 91-95-2</td><td>-20</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-tek</td><td>4583</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>Numero CAS 77-86-1 &nbsp;</td><td>Na</td></tr><tr><td>ABC Lite</td><td>Vector</td><td>PK4000</td><td>NA</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera digitale</td><td>Nikon</td><td>DS-Ri1</td><td></td></tr><tr><td>12 bit Fotocamera&nbsp;</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>01 MBF2000RF-CLR-12</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Neurolucida</td><td>MBF Bioscience</td><td>V.10</td><td></td></tr><tr><td>Image Composite Editor</td><td>Microsoft</td><td>1.4.4.0</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td>F 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Image Pro Plus</td><td></td><td>Mediacy Versin 7.00</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della regione ippocampale nei topi

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

L'arborizzazione dendritica ha dimostrato di essere un marcatore affidabile per l'esame dell'integrità strutturale e funzionale dei neuroni. Infatti, la complessità e l'estensione dell'arborizzazione dendritica si correla bene con la plasticità sinaptica in queste cellule. Un metodo affidabile per la valutazione dell'arborizzazione dendritica è necessario per caratterizzare gli effetti deleteri dei disturbi neurologici su queste strutture e per determinare gli effetti degli interventi terapeutici. Tuttavia, la quantificazione di queste strutture si è rivelata un compito arduo data la loro natura complessa e dinamica. Fortunatamente, sofisticate tecniche di imaging possono essere abbinate a metodi di colorazione convenzionali per valutare lo stato dell'arborizzazione dendritica, fornendo un mezzo di valutazione più affidabile e rapido. Di seguito è riportato un esempio di come queste tecniche di imaging sono state abbinate a metodi di colorazione per caratterizzare l'arborizzazione dendritica nei topi wild type. Questi metodi di imaging complementari possono essere utilizzati per valutare qualitativamente e quantitativamente l'arborizzazione dendritica che si estende su un'area piuttosto ampia all'interno della regione ippocampale.

L&#39;entità del arborization derivanti da granuli dentati esistenti e appena nati è stato analizzato in topi wild type utilizzando Golgi-Cox o DCX colorazione (Figura 1). Segmenti di cellule dendritiche DCX-positivi sono stati trovati per essere lunga 13-36 micron. La distribuzione normale di lunghezza dendritiche è stata testata utilizzando il test Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p &lt;0,01, Liliefors p &lt;0,001; figure 4 e 5). Nell&#39;a...

Descriviamo due metodi per la visualizzazione e la quantificazione dell'arborizzazione dendritica nell'ippocampo di modelli murini: imaging in tempo reale e con profondità di campo estesa. Mentre il primo metodo consente un sofisticato tracciamento topografico e la quantificazione dell'estensione della ramificazione, il secondo consente una rapida visualizzazione dell'albero dendritico.

Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare il grado di arborizzazione dendritica nell'ippocampo di un modello murino. Questo viene ottenuto attraverso due metodi diversi. Nel primo metodo, i dendriti vengono tracciati manualmente in tempo reale lungo tutta lo spessore di ciascuna sezione.Dopo il tracciamento, l'intero albero dendritico può essere ricostruito e analizzato. L'analisi del diagramma a ventaglio di diversi diagrammi a ventaglio ottenuti da topi diversi può essere utilizzata come mezzo oggettivo di confronto. Il secondo metodo consiste nel visualizzare l'arborizzazione dendritica mediante imaging con profondità di campo estesa.Infine, viene utilizzato un metodo panoramico per assemblare insieme più immagini ad alta ingrandimento, ottenendo un'unica immagine composita ad alta risoluzione per la valutazione qualitativa e quantitativa delle dendriti in tutta la regione di interesse. A dimostrazione di questa procedura sarà GI mobi. AMI research flows dal mio laboratorio. Il vantaggio principale di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti è la facilità d'uso e la rapidità di acquisizione e raccolta dei dati.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurobiologia, come la valutazione della ramificazione dendritica nelle regioni cerebrali interessate e l’analisi degli effetti di diverse terapie sui dendriti. In questo procedimento, un giorno dopo che il cervello del mouse è stato fissato in paraformaldeide al 4%, immergerlo in soluzione di saccarosio per la disidratazione per 48 ore a quattro gradi Celsius. Rimuovere i cervelli dalla soluzione di saccarosio e posizionarli direttamente su blocchi di rame posti su ghiaccio secco.Riempire il blocco con OCT e segnare l'orientamento del cervello utilizzando il bulbo olfattivo come riferimento. Tagliare sezioni spesse 70 micron a meno 20 gradi Celsius utilizzando un criostato e collocarle in soluzione crioprotettiva, mantenendole a meno 20 gradi Celsius fino all'uso. Incubare le sezioni in perossido di idrogeno in metanolo per 30 minuti a temperatura ambiente, seguito da un riscaldamento a 37 gradi Celsius in TBS per mezz'ora.Incubare i preparati con Triton allo 0,3% e siero equino normale per 45 minuti a temperatura ambiente, prima della colorazione con l'anticorpo anti-DCX il giorno successivo. Lavare i preparati tre volte consecutivamente in TBS e incubarli con un anticorpo secondario equino biotinilato per due ore a temperatura ambiente. Lavare i preparati tre volte consecutive in TBS per 10 minuti ciascuna e incubarli con il complesso avidina-biotina (B, C light) per 1,5 ore.A temperatura ambiente, aggiungere perossido di idrogeno alla soluzione di DAB e incubare immediatamente le sezioni in questa soluzione per cinque minuti; interrompere la reazione lavandole tre volte con TBS ghiacciato seguito da un ulteriore lavaggio. Lavare in TTBS a temperatura ambiente. Disidratare le sezioni utilizzando una serie di soluzioni di etanolo.Cinque minuti ciascuno con xilene, quindi montare con DPX. Dopo che i campioni si sono completamente asciugati, rimuovere l'eccesso di DPX dalle superfici dei vetrini con una lama affilata e posizionarli uno alla volta sullo stadio di scansione del microscopio. Il sistema di visualizzazione è composto da un microscopio dotato di joystick per lo stadio di scansione e di una fotocamera a colori da 12 bit.Successivamente, avviare il programma Neuro Lucita e aprire un nuovo file di dati. Posizionare un punto di riferimento sullo schermo cliccando in qualsiasi posizione con il puntatore del mouse per attivare tutte le icone nel pannello degli strumenti della finestra del programma. Quindi fare clic sull'icona joystick libero nella barra degli strumenti e utilizzare il joystick per localizzare il giro dentato dell'ippocampo.Nella prima sezione della scheda strumenti della finestra del programma, selezionare il gestore delle sezioni seriali. Fare clic sull'icona nuova sezione nell'angolo in basso a sinistra della finestra per aprire la finestra di configurazione delle sezioni seriali. Successivamente, selezionare la finestra di configurazione delle sezioni seriali e inserire il numero totale di sezioni che contengono regioni ippocampali.Quindi selezionare l'intervallo di valutazione e inserire lo spessore della sezione. Iniziare a tracciare la regione del giro dentato facendo clic sull'icona del disegno libero del contorno presente nella barra degli strumenti. Successivamente, delineare lo strato granulare del giro dentato.Selezionare 100 x dal menu dell'ingrandimento. Quindi aggiungere una goccia di olio di immersione sulla sezione e passare all'obiettivo 100 x. Individuare i corpi cellulari e le dendriti delle cellule granulari del giro dentato con questo obiettivo.Successivamente, concentrarsi su un neurone selezionato e fare clic sull'icona di tracciamento del neurone. Sulla barra degli strumenti, tracciare la circonferenza del corpo cellulare del granulo dentato. Al termine del tracciamento, fare clic con il tasto destro per selezionare "fine corpo cellulare".Ora iniziare a tracciare manualmente i dendriti nelle direzioni X, Y e Z, seguendo ogni ramo utilizzando il joystick e la manopola del motore Z. In corrispondenza di un nodo di biforcazione o triforcazione, selezionare l'opzione corrispondente. Dal menu a tendina, tracciare ciascuno dei rami che si diramano da questi nodi, fino all'estremità di ogni ramo. Fare clic con il tasto destro e selezionare "terminazione" dal menu a tendina.Utilizzando le icone dei tasti freccia nella finestra del software. Selezionare casualmente un altro neurone granulare del giro dentato e ripetere la procedura di tracciamento come appena dimostrato. Salvare l'intero tracciamento.Ora avviare Neuro Lucita Explorer per l'analisi dei neuroni. Aprire il primo file di dati NRX dal primo topo del gruppo sperimentale. Aggiungere il file NRX del secondo topo del gruppo sperimentale e continuare finché tutti i file NRX di questo gruppo non sono stati aggiunti.Sotto la scheda di analisi, selezionare il ventilatore nel diagramma per aprire la finestra di analisi del ventilatore, selezionare con una spunta le dendriti e fare clic su "visualizza" per visualizzare i collegamenti e i modelli di ramificazione delle dendriti per questo gruppo di topi. In questa procedura, collegare il microscopio a una fotocamera digitale. Posizionare una sezione sullo stadio di scansione collegato al microscopio e passare a un obiettivo 10x.Successivamente, spostare la piastra nell'area di interesse. Avviare un programma di acquisizione video e premere il pulsante di registrazione. Non appena viene premuto il pulsante di registrazione, utilizzare la manopola macro del fuoco per spostarsi dalla parte superiore a quella inferiore della sezione per un totale di quattro secondi. Prima di salvare il file video risultante, utilizzare ora il software gratuito Image J per convertire i file video AVI in un formato non compresso.Avviare un programma di analisi delle immagini e aprire il file VI. Andare al menu elaborazione e fare clic su profondità di campo estesa. Selezionare il file video corrispondente nelle opzioni di output.Selezionare l'opzione "genera immagine composita con migliore messa a fuoco" nelle opzioni di analisi della messa a fuoco. Selezionare le opzioni di illuminazione normalizzata e massimo contrasto locale. Quindi fare clic su crea per generare un'immagine risultante, che rappresenta tutti i pixel a fuoco lungo l'asse Z.In seguito, salvare l'immagine risultante. In questo passaggio, posizionare una sezione sullo stadio di scansione collegato al microscopio. Spostare lo stadio nell'area di interesse.Quindi avviare il programma di acquisizione delle immagini utilizzando un obiettivo 10x, acquisire e salvare immagini ad alta risoluzione dalla regione di interesse, assicurandosi di avere almeno un 10% di sovrapposizione tra le immagini. Successivamente, eseguire l'editor di composizione delle immagini per assemblare le immagini. Andare al menu file e fare clic su nuova panoramica.Selezionare la cartella in cui sono memorizzate le immagini. Successivamente, selezionare le immagini che appartengono alla stessa regione e premere OK. Premere il pulsante esporta su disco e salvare l'immagine.Questa immagine rappresenta un'immagine ad altissima risoluzione dell'area di interesse che potrebbe essere utilizzata per l'analisi. Questa figura mostra la visualizzazione dell'arborizzazione dendritica con e senza i metodi EDFI. Il metodo tradizionale per individuare il piano di fuoco migliore è stato confrontato con l'EDFI, ottenendo valori significativamente più elevati dell'area dendritica.Utilizzando il metodo EDFI sono stati trovati. Qui si mostra la quantificazione della lunghezza e del volume occupati dai dendriti in diversi ordini di ramificazione. La lunghezza e il volume massimi sono stati raggiunti nel primo ordine.Di seguito è riportato un istogramma della lunghezza dendritica delle cellule granulari del giro dentato. La maggior parte dei segmenti dendritici delle DDR marcate con DCX aveva una lunghezza compresa tra 13 e 26. Questa linea tratteggiata rossa rappresenta la distribuzione normale dei dati presentati ottenuta seguendo questa procedura.Altri metodi classici, come Neuro Lucid, potrebbero essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande riguardo al volume e all'area occupati dai dendriti. Questa tecnica, che vi abbiamo mostrato qui, aiuterà notevolmente i ricercatori nel campo della neurobiologia non solo a valutare la morfologia delle strutture neuronali, ma anche a esaminare piccole strutture non neuronali come la microglia in sezioni cerebrali spesse. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come valutare l'estensione delle proiezioni neuronali in un periodo di tempo relativamente breve.

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Una tecnica di dissezione per la rimozione del giro dentato da topo adulto allo stereomicroscopio è stata dimostrata in questo video-registrato di protocollo.

Dissezione di giro dentato ippocampale di topo adulto

Descriviamo un protocollo immunoistochimica per studiare il profilo di attivazione dei neuroni dell'ippocampo seguito dell'esposizione ad un compito di apprendimento spaziale in un modello murino caratterizzato da deficit cognitivi di origine dello sviluppo neurologico. Questo protocollo può essere applicato a entrambi i modelli murini genetici o farmacologici caratterizzati da deficit cognitivi.

Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico

Qui presentiamo un protocollo Golgi-Cox in dettagli estesi. Questo metodo affidabile di macchie di tessuto consente una valutazione di alta qualità della cytoarchitettura nell'ippocampo, e in tutto il cervello, con una minima risoluzione dei problemi.

Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox

Un protocollo per accuratamente identificare e analizzare le sinapsi nelle fette hippocampal mediante immunofluorescenza è descritto in questo articolo.

Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

Questo protocollo viene illustrato come impostare un metodo affidabile di HFS in topi. Neuroni nel giro dentato dell'ippocampo sono stimolati elettricamente da HFS direttamente e indirettamente in vivo. Attività neuronale e induzione di segnali molecolari sono esaminate dal c-fos e macchiatura immunofluorescente Notch1, rispettivamente; neurogenesi è quantificata mediante analisi di etichettatura della bromodeossiuridina.

Un metodo invasivo per l'attivazione della circonvoluzione dentata del Mouse dalla stimolazione ad alta frequenza

Questo metodo descrive una preparazione cronica che consente l'accesso ottico all'ippocampo di topi viventi. Questa preparazione può essere utilizzata per eseguire l'imaging ottico longitudinale della plasticità strutturale neuronale e della plasticità cellulare evocata dall'attività per un periodo di diverse settimane.

Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

Questo è un protocollo per la preparazione a slice acuta da ippocampo di topi adulti e invecchiamento che sfrutta la perfusione transcardiale e il taglio delle fette con NMDG-aCSF ghiacciato per ridurre i danni ipossici al tessuto. Le fette risultanti rimangono sane per molte ore e sono adatte per le registrazioni di patch e field a lungo termine.

Ridurre al minimo l'ipossia nelle fette di ippocampale da topi adulti e anziani

Presentiamo un protocollo per preparare fette acute dall'ippocampo dorsale-intermedio dei topi. Confrontiamo questa preparazione trasversale con l'affezione coronale in termini di qualità delle registrazioni e conservazione delle caratteristiche morfologiche dei neuroni registrati.

Preparazione di fette acute dall'ippocampo dorsale per la registrazione a cellule intere e la ricostruzione neuronale nel giro dentato di topi adulti

Il protocollo descrive una modifica del metodo rapido Golgi, che può essere adattato a qualsiasi parte del sistema nervoso, per la colorazione dei neuroni nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale mediale del ratto.

Macchia rapida di Golgi per la visualizzazione della colonna vertebrale dendritica nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale

Il giro dentato dell'ippocampo svolge funzioni essenziali e distinte nell'apprendimento e nella memoria. Questo protocollo descrive una serie di procedure robuste ed efficienti per l'imaging in vivo del calcio di cellule granulari nel giro dentato in topi che si muovono liberamente.

Imaging in vivo del calcio delle cellule dei granuli nel giro dentato dell'ippocampo nei topi 

Impara a valutare l'arborizzazione dendritica nel giro dentato dell'ippocampo nei topi con tracciamento in tempo reale e imaging a profondità di campo estesa. Questi metodi consentono analisi dettagliate della morfologia neuronale.

Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi

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