Name: Una procedura chirurgica per la resezione Rib Mouse: Un modello per le grandi ossa lunghe Repair (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Scopri la procedura chirurgica di resezione della costa nel topo come modello per studiare la riparazione ossea su larga scala. Questo metodo permette di osservare gli eventi cellulari e molecolari durante la guarigione scheletrica in vivo.

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Ringraziamo i membri del laboratorio Mariani per la lettura critica del manoscritto. Le nostre fonti di finanziamento erano: la Baxter Medical Scholar Research Fellowship (a M.K.S.), le borse di studio universitarie USC e il Provost, Dean Joan M. Schaeffer, e le Rose Hills Fellowships, (a M.K.S.). Riconosciamo anche una borsa di studio CIRM BRIDGES attraverso il Pasadena City College (a T.T.T). e il James H. Zumberge Research and Innovation Fund, l'USC Regenerative Medicine Initiative e il NIAMS NIH con il numero di premio R21AR064462 (a F.V.M).

NOTA: Tutte le procedure sono in accordo con un protocollo animali approvato dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso la University of Southern California. 1. Preparazione per la chirurgia <ol><li> Lay out gli strumenti e le forniture chirurgici necessari (sterilizzato, articoli 1-18 nella lista dei materiali) e di organizzare un microscopio da dissezione e una fibra ottica trans-illuminatore in un cappuccio o su un tavolo downdraft. </li><li> Posizionare un mouse sessualmente matura (20 - 30 g, 1 - 3 mesi) di una camera di induzione con 4% isoflurano per indurre l&#39;anestesia. </li><li> Confermare anestesia con una zampa e / o test di coda pizzico. </li><li> Applicare una pomata per gli occhi del topo per evitare secchezza oculare durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Spostare il mouse alla fase microscopio. Posizionare il mouse nel naso cono del tubo manutenzione e posizionare lateralmente. Fornire un sacchetto riscaldamento adiacente all&#39;animale per aiutare a mantenere la temperatura corporea. NONE:. Posizione del mouse è dipendente da preferenze personali e / o manualità del chirurgo, lato a destra oa sinistra va bene. </li><li> Regolare isoflurano al 2 - 3% per la manutenzione, e guardare la frequenza respiratoria. </li><li> Iniettare buprenorfina (0,05 mg / kg) per via sottocutanea (fianco laterale della gamba) per dolore post-operatorio con un ago 25 G. La gamba può contrarsi, che è una risposta normale. </li></ol> Incisione 2. Apertura <ol><li> Rileva la costola voluta da palpazione, e ripulire l&#39;area di capelli con un rasoio. NOTA: Ribs 8-10 sono raccomandati dal costole 1-7 sono più vicini ai polmoni e 11-13 sono notevolmente più brevi. Contando le costole dovrebbe iniziare con la costola più rostrale come numero 1. </li><li> Preparare la zona con alternanza iodopovidone e isopropanolo (70%) tampone (3x è spesso raccomandato dai protocolli di utilizzo degli animali). </li><li> Tagliare un&#39;incisione di 2 cm attraverso la pelle, direttamente sopra e parallela alla costola desiderata con le forbici microchirurgia medie dimensioni. Incise attraverso gli strati muscolari e adipose sottostanti. </li><li> Mettere tutti 3 strati (pelle, muscoli, grasso) in un riavvolgitore per esporre l&#39;area chirurgica, riducendo al minimo la dimensione della incisione. </li></ol> 3. ablazione del Rib <ol><li> Tagliare i muscoli intercostali sovrastanti la sezione desiderata della costola con un bisturi 5,0 millimetri. Posizione questa incisione attorno a 5 mm prossimale al giunto chondrocostal come questo è dove la costola non è così altamente curvo. Separare con cura il muscolo dall&#39;osso con una pinza a punta fine. </li><li> Per creare una resezione mantenendo periostio nell&#39;animale, tagliare il periostio, lungo la lunghezza della nervatura con un bisturi 5,0 millimetri. Separare con cura il periostio dall&#39;osso sottostante lateralmente con una pinza a punta fine. Procedere con cautela, come periostio è molto delicata e ha una consistenza gelatinosa. </li><li> Successivo fare una sezione trasversale attraverso l&#39;osso ad una estremità con sottili micro-forbici. Se necessario, misurare la resezione conun reticolo nel microscopio o un manometro tipo righello. Quindi sollevare con attenzione l&#39;osso dal periostio e tagliare l&#39;altra estremità. NOTA: Procedere con cautela. Questo è il passo più delicato, come tirare senza asportare la costola di seguito si strappare la membrana pleurica e il risultato in un pneumotorace. Se la membrana pleurica è strappata questo sarà immediatamente evidente come l&#39;interno della cavità toracica diventa visibile. </li><li> Se l&#39;emorragia si verifica come risultato di taglio dell&#39;osso, applicare pressione alla fine del taglio con un panno di cotone per 4 - 5 sec per fermare l&#39;emorragia. NOTA: Nelle rare occasioni che il sanguinamento continua, può essere necessario per fermare e eutanasia dell&#39;animale come significativa perdita di sangue comprometterà recupero (senza sostituzione di liquidi, il volume massimo di sangue che può essere tranquillamente essere perso è del 10% del volume totale del sangue 7,7 -. 8 microlitri / g Per 25 g del mouse, questo è equivalente a circa 180-200 microlitri 9). </li><li> Porre immediatamente la nervatura rimosso in4% PFA per le analisi future. NOTA: Se la resezione sia l&#39;osso e periostio deve essere effettuata, omettere l&#39;incisione periostio e la separazione (passo 3.2). Dal momento che il periostio è molto strettamente attaccato alla membrana pleurica procedere con cautela, prendere in giro la costola di distanza dalla membrana pleurica con una pinza per evitare strappi. </li></ol> 4. Chiusura della incisione <ol><li> Suturare la muscoli intercostali sopra la parte superiore del manicotto periostio restante con 9-0 suture (2 suture sono generalmente sufficienti). Posizionare i punti di sutura direttamente sopra le estremità tagliate della costola, di agire come indicatori per posizione chirurgia. </li><li> Rimuovere il divaricatore. Suturare il muscolo sovrastante e grasso con 9-0 punti di sutura (3 - 4 punti di sutura sono generalmente sufficienti). In topi con particolarmente spessi strati muscolari e / o grasso, suturare ogni strato separatamente (ad esempio, 1 strato di suture per lo strato muscolare e 1 strato di suture per lo strato grasso). </li><li> Chiudere ilpelle con 7-0 punti di sutura (4 - 5 punti di sutura sono generalmente sufficienti). </li><li> Fissare l&#39;incisione con la colla sutura, pizzicando i bordi con le grandi pinze. </li><li> Lentamente svezzare il mouse fuori isoflurano per primo adeguamento al 1% per alcuni minuti e poi si spegne. </li><li> Posizionare il mouse sotto una lampada di calore e lasciare fino coscienza è recuperato, 5 - 10 min. Dopo la coscienza è riconquistato e per tutto il periodo di guarigione, il mouse dovrebbe muoversi e deambulare normalmente e non mostrano segni di sofferenza. </li></ol> 5. Recupero e analisi <ol><li> Fornire la gestione del dolore post-operatorio compresa la somministrazione di buprenorfina in forma di gelatina orale a 0,5 mg / kg ogni 12 ore per 48 ore. La somministrazione orale non richiede immobilizzare l&#39;animale che potrebbe causare dolore alla regione toracica. </li><li> Mantenere il mouse in una gabbia con libero accesso a cibo e acqua durante il periodo di guarigione. Dopo l&#39;incisione è asciutto, le femmine possono essere co-ospitati durante maschios deve restare isolato per evitare lotte. </li><li> Dopo il periodo di guarigione, seguire la procedura approvata per l&#39;eutanasia. Rimuovere la gabbia toracica per la fissazione e l&#39;analisi. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

La prima volta che l&#39;apprendimento di questo protocollo, determinando dove localizzare l&#39;incisione iniziale può essere impegnativo. Tuttavia, la pratica sui topi eutanasia aiuta il chirurgo imparare dove posizionare l&#39;incisione iniziale ed esporre la costola desiderato da asportato. Lavorare su cadaveri migliora anche le capacità fine-motorie necessarie per rimuovere la parte toracica, con o senza il periostio. Inoltre, qualcuno di nuovo a questa procedura potrebbe trovare manipolare le belle strumenti e sut...

Debilitante lesioni scheletriche, osteoartrite cronica, ei gravi problemi connessi con la chirurgia ricostruttiva impatto produttività economica, benessere familiare, e la qualità della vita. Mentre piccole pause e le lesioni possono guarire abbastanza bene, gli esseri umani non sono in grado di riparare grandi difetti e quindi deve fare affidamento su procedure ricostruttive per ripristinare la struttura e la funzione. La ricostruzione può comportare innesti allogenici o heterogeneic, osso morcellized, ponteggi impiantati, o distrazione osteogenesi. Sfortunatamente, non solo vi sono fattori di morbilità persistenti associati a questi trattamenti, ma la forza originaria dell&#39;osso riparato è raramente raggiunto. Pertanto, sono necessari nuovi approcci clinici. Senso unico per sviluppare metodi innovativi per il trattamento di difetti segmentali è quello di studiare le situazioni in cui la riparazione su larga scala avviene naturalmente. Anfibi notoriamente in grado di rigenerare gli elementi scheletrici, mentre i mammiferi sono considerate limitate in thè la capacità. Tuttavia, dal momento che la prima parte del 20 ° secolo, alcuni rapporti di rigenerazione della costola umana sono stati pubblicati suggerisce che gli esseri umani non possono essere limitati così 1-4. Attualmente questo fenomeno è meglio conosciuto da chirurghi plastici che usano materiale costola per mascella, viso e orecchio ricostruzione, ma non è più ampiamente apprezzato 5. Per studiare questa riparazione più in dettaglio, abbiamo sviluppato un modello chirurgica utilizzando il mouse. Usando questo protocollo, i ricercatori possono individuare i fattori innati coinvolti e utilizzare queste informazioni per facilitare la guarigione scheletrico in altri luoghi. Ci sono molti vantaggi di utilizzare le costole come modello per lo studio di riparazione scheletrica. Innanzitutto, le nervature circostanti offrono un fissatore naturale (rispetto alla resezione del femore 6,7). Questo riduce il rischio di morbilità fissatori interni ed esterni e semplifica la procedura chirurgica. In secondo luogo, gli strati muscolari sottili degli wa pettoll fornire un facile accesso e una visibilità eccellente che fanno il test paragonabile alla comodità di resezioni cranica 8. In terzo luogo, in contrasto con la Calvariae che costituiscono da ossificazione intramembranosa, forma nervature da encondrale e crescere in lunghezza tramite allungamento a placche di crescita situati alle due estremità di un diafisi centrale. Pertanto, la riparazione delle costole può essere più paragonabile a riparazione delle ossa lunghe dello scheletro appendicolare. Inoltre, abbiamo trovato che rispetto al femore, il periostio della nervatura è più spessa e può essere più facilmente manipolato. Così, gli investigatori che vogliono saggiare riparazione ossea al fine di studiare il periostio o testare terapie cellulari, gli agenti farmacologici e / o impalcature tissutali potrebbero trovare questo modello chirurgica utile. In sintesi, questo modello di resezione costola fornisce un contesto all&#39;interno del quale studiare la riparazione ossea larga scala naturale nei mammiferi in quanto tale modello in uso generale attualmente esistente.

<table><tbody><tr><td>Forbici per microdissezione di medie dimensioni (Vannas-T&uuml; Forbici a molla bingen 5 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per micro-dissezione fine (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-04</td><td>punta curva è utile</td></tr><tr><td>Micro-bisturi 5,0 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>10315-12</td><td>altri bisturi fini possono essere sostituiti</td></tr><tr><td>Dumont 55 pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Divaricatore&nbsp;</td><td>La regolazione di Fine Science Tools</td><td>17004-05</td><td>è conveniente</td></tr><tr><td>Porta-aghi</td><td>Fine Science Tools</td><td>12060-01</td><td></td></tr><tr><td>9.0 suture in nylon (Ethilon), punto di conicità migliore</td><td>Ethicon</td><td>2819G o punto di</td><td>conicità simile migliore, ma anche il taglio inverso è buono</td></tr><tr><td>suture in prolene 7.0 (Prolene)</td> <td>Ethicon</td><td>8700H o simile</td><td>6-0 può essere utilizzato anche, la punta dell'ago può variare</td></tr><tr><td>Pinze grandi (Adson Forceps)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td>altre marche vanno bene</td></tr><tr><td>Lubrificante Unguento per gli occhi (Akwa Tears)</td><td>Akorn</td><td>17478-062-35</td><td></td></tr><tr><td>Colla per sutura (GLUture Topical Tissue Adhesive)</td><td>Abbot</td><td>32046-01</td><td>ha un eccellente tempo di lavoro</td></tr><tr><td>Rasoio</td><td>Wahl</td><td>9918-6171 o simile</td><td></td></tr><tr><td>Lampada a morsetto</td><td>Zoo Med</td><td>LF-5</td><td></td></tr><tr><td>Lampadina a infrarossi, 75W</td><td>Zoo Med</td><td>RS-75</td><td></td></tr><tr><td>RC2 Sistema di anestesia per roditori</td><td>VetEquip&nbsp;</td><td>922100</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurano)</td><td>Abbot</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (Buprenex)</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Frederick</td><td>67618015017</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina aromatizzata,</td><td>gelatina</td> di lamponi <td>B000E1FYL0</td><td>composta solida, fino alla consistenza di 'jigglers'</td></tr></tbody></table>

una procedura chirurgica per la resezione rib mouse: un modello per le grandi ossa lunghe repair

A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

Questo protocollo introduce ricercatori di un nuovo modello di grande riparazione ossea utilizzando la costola del mouse. Dettagli La procedura seguente: preparazione del animale per la chirurgia, aprendo la parete del corpo toracica, esponendo la nervatura desiderato dai muscoli intercostali circostanti, asportare la sezione desiderata della costola senza indurre un pneumotorace, e chiudendo le incisioni. Rispetto alle ossa dello scheletro appendicolare, le nervature sono altamente accessibile. Inoltre, nessun fissatore interno o esterno è necessario in quanto le nervature adiacenti forniscono una fissazione naturale. L&#39;intervento utilizza commercialmente scorte disponibili, è semplice da imparare, e ben tollerato dall&#39;animale. La procedura può essere eseguita con o senza rimuovere il periostio circostante, e quindi il contributo del periostio di riparazione può essere valutata. I risultati indicano che se il periostio viene mantenuta, riparazione robusto si verifica in 1 - 2 mesi. Ci aspettiamo che l&#39;uso di questo protocollo saràstimolare la ricerca in riparazione costola e che i risultati faciliteranno lo sviluppo di nuovi modi per stimolare la riparazione ossea in altre località in tutto il corpo.

Animali tipicamente recuperare rapidamente da questa procedura, l&#39;incisione guarisce bene, e gli animali mostrano un comportamento normale. La procedura utilizza materiali di consumo disponibili sul mercato e dopo la pratica, può essere completato in meno di 1 ora. Prima di utilizzare questa procedura per generare dati sperimentali, è importante analizzare resezione al punto di tempo di giorno 0 per determinare se eventuali grandi frammenti ossei potrebbero rimanere all&#39;interno della zona di resezione. Un modo p...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di resecare con successo una porzione di osso dalla costola di un topo. La procedura è stata sviluppata come modello per studiare la riparazione delle ossa lunghe su larga scala.

Una procedura chirurgica per la resezione Rib Mouse: Un modello per le grandi ossa lunghe Repair

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation ...

Lo scopo di questa procedura è creare una resezione su larga scala nella porzione ossea di una costola, come modello per la riparazione scheletrica. Questo viene ottenuto innanzitutto creando e aprendo un'incisione attraverso la cute sul lato laterale dell'animale. Il secondo passaggio consiste nell'esporre l'osso della costola che deve essere rimosso.Successivamente, una porzione dell'osso costale viene rimossa insieme alla guaina di tessuto connettivo circostante o al periostio, oppure lasciando il periostio in sede. L'ultimo passaggio consiste nella chiusura delle incisioni e nel permettere all'animale di riprendersi. In definitiva, questo modello di riparazione ossea può essere utilizzato per mostrare gli eventi cellulari e molecolari che si verificano durante la riparazione su larga scala del tessuto scheletrico.In un mammifero, la dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la manipolazione degli strumenti chirurgici richiede precisione e un intervento chirurgico di successo presuppone la conoscenza della localizzazione dei diversi tessuti. A dimostrare la procedura saranno Marissa Roar e Nikita Tripper, entrambi studenti laureati nel mio laboratorio. Dopo aver preparato l'area chirurgica e gli strumenti e materiali sterili necessari, indurre l'anestesia posizionando un topo adulto in una camera di induzione con il 4% di isoflurano.Dopo aver anestetizzato il topo, applicare un unguento sugli occhi del topo e verificare la profondità dell'anestesia. Eseguendo una compressione del dito del piede, non dovrebbe esserci alcuna reazione alla compressione. Posizionare il topo sopra o accanto a un tappetino riscaldante sul piano di un microscopio stereoscopico, con il cono nasale del tubo per il mantenimento dell'anestesia posizionato sul naso del topo.Assicurarsi che il topo sia in posizione laterale. Regolare l'isoflurano al due-tre percento per il mantenimento e monitorare la frequenza respiratoria. Quindi iniettare buprenorfina per via sottocutanea mediante un ago da 25 gauge.Per il dolore postoperatorio preventivo, la gamba può contrarsi involontariamente, un fenomeno che rappresenta una risposta normale. Per prima cosa, selezionare la costola desiderata palpeggiando a partire dalla costola più rostrale, che viene conteggiata come numero uno. In questo video, verrà rimossa una porzione della decima costola.Rasare l'area sopra la costola e quindi pulirla con iodopovidone, seguito da isopropanolo per tre volte. Dopo aver praticato un'incisione di due centimetri attraverso gli strati di pelle, muscolo e grasso sopra la costola da escindere, posizionare tutti e tre gli strati in un retraore per esporre l'area chirurgica riducendo al minimo le dimensioni dell'incisione. Successivamente, utilizzare un bisturi da cinque millimetri per tagliare i muscoli intercostali sopra la costola in un punto situato cinque millimetri in prossimità dell'articolazione chocos, dove la curvatura della costola è meno accentuata. Quindi, separare con attenzione il muscolo dall'osso utilizzando pinzette a punta fine.Successivamente, per creare una resezione mantenendo il periostio nell'animale, tagliare il periostio lungo tutta la lunghezza della costola. Quindi utilizzare pinzette a punta fine per separare con molta attenzione il delicato periostio lateralmente dall'osso sottostante. Se necessario, misurare la resezione con un micrometro nel microscopio o con un calibro di tipo riga.Quindi utilizzare forbici microchirurgiche fini per effettuare una sezione trasversale attraverso l'osso. A un'estremità, sollevare con attenzione l'osso dal periostio e tagliare immediatamente l'altra estremità. Posizionare la costola rimossa in paraformaldeide al 4% per analisi future.Se si verifica un sanguinamento a seguito del taglio dell'osso, applicare pressione all'estremità tagliata con un bastoncino di cotone per quattro o cinque secondi per arrestare il sanguinamento. Per chiudere l'incisione, suturare i muscoli intercostali sopra la guaina periostea residua con tre o 4 suture singole separate di 9 0. Posizionare le suture direttamente al di sopra delle estremità tagliate della costola in modo da fungere da indicatori della sede dell'intervento chirurgico.Rimuovere il retractor e quindi suturare il muscolo e il tessuto adiposo sovrastanti con punti separati di diametro zero. Suturare ogni strato separatamente nei topi con strati particolarmente spessi di muscolo o tessuto adiposo. Chiudere la cute con quattro o cinque punti di diametro 7-0 e quindi fissare l'incisione con un adesivo tissutale.Pizzicare i bordi insieme con pinze di grandi dimensioni. Ridurre gradualmente l'anestetico isoflurano regolando la concentrazione al 1% per alcuni minuti, quindi spegnere l'isoflurano. Posizionare il topo sotto una lampada riscaldante e lasciarlo fino al recupero della coscienza.Dopo il recupero della coscienza e per tutto il periodo di guarigione, il topo deve muoversi e deambulare normalmente, senza mostrare segni di malessere. Una volta che l'incisione è asciutta, alloggiare il topo in una gabbia pulita con libero accesso a cibo e acqua. Le femmine possono essere alloggiate insieme, ma i maschi devono essere alloggiati singolarmente per evitare combattimenti; fornire una gestione del dolore postoperatorio, inclusa l'amministrazione di buprenorfina in forma orale gelatinosa a 0,5 milligrammi per chilogrammo ogni 12 ore per 48 ore.L'amministrazione orale non richiede il contenimento dell'animale, che potrebbe causare dolore alla regione toracica. Questa immagine mostra una resezione di 4,5 millimetri di una costola raccolta immediatamente dopo l'intervento chirurgico. Non vengono lasciati frammenti ossei.Il campione è stato colorato con rosso zarin e chiarito in glicerolo al 80%. La freccia indica la posizione delle estremità tagliate. Questa è la porzione di costola rimossa dalla gabbia toracica nell'immagine precedente, senza il periostio ad essa aderente.La sezione istologica colorata con ematina ed eosina mostrata qui illustra che esiste un periostio minimo attaccato all'osso, come indicato dalla freccia gialla a sinistra, e nessun periostio a destra. L'asterisco giallo indica la cavità del midollo osseo. Questa immagine mostra una porzione di costola rimossa con il periostio ancora attaccato, e questa sezione istologica mostra il periostio integro sovrastante l'osso, come indicato dalla parentesi gialla.L'asterisco giallo indica nuovamente la cavità del midollo osseo. Questa immagine mostra un preparato scheletrico dopo due mesi di guarigione seguiti a resezione con periostio intatto all'interno del topo; si può osservare un ripristino completo della regione. Questa sezione istologica del preparato scheletrico appena mostrato dimostra il ripristino delle pareti ossee lamellari e della cavità del midollo osseo.Questa immagine mostra una preparazione scheletrica dopo tre mesi di guarigione. Dopo aver rimosso una porzione di costola e il periostio circostante, si è verificato solo un minimo ripristino all'estremità tagliata, mostrata a sinistra del pannello. La freccia gialla indica l'articolazione chocos.Questa sezione istologica del preparato scheletrico mostrato in precedenza evidenzia granulazione, tessuto adiposo e cellule muscolari che riempiono il sito di resezione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora se si segue correttamente questa procedura. Altri metodi, come la creazione di una resezione nella porzione cartilaginea della costola, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio: come avviene la riparazione su larga scala della cartilagine?Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una resezione nella porzione ossea della costola al fine di studiare la riparazione scheletrica.I.

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