Valutazione non invasiva della efficacia di nuove terapie per patologie intestinali Utilizzando Serial Imaging endoscopica Live Mice

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di testare l'efficacia di nuove terapie in modelli di colite e cancro attraverso l'induzione di malattie nei topi per studiare terapie che inibiscono la patologia indotta. La terapia viene somministrata a scopo profilattico. In questo video, la proteina 11 dell'interleuchina umana ricombinante viene utilizzata destrano solfato di sodio o DSS viene quindi somministrato nell'acqua potabile per provocare danni acuti alla mucosa e molte delle caratteristiche istopatologiche associate alla malattia infiammatoria intestinale.

Successivamente, i cambiamenti nella malattia vengono monitorati mediante endoscopia al fine di determinare l'efficacia terapeutica. In definitiva, i risultati mostrano una riduzione del carico di malattia sulla base del monitoraggio endoscopico e del punteggio dopo il trattamento terapeutico di topi con patologia indotta dalla malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è la possibilità di monitorare un singolo topo nel corso dell'esperimento rispetto alle tecniche standard per l'istologia.

È richiesto l'esame di più coorti di animali. Questa metodologia può aiutarci a porre e rispondere a domande chiave in termini di infiammazione e cancro del colon, e in particolare a cercare di stabilire una migliore manipolazione della segnalazione delle citochine che può influenzare la progressione della malattia. È importante utilizzare questi modelli preclinici per valutare l'efficacia di farmaci e composti, e questo ci permette di testare lo stesso topo in più momenti e di vedere se questi composti hanno un'attività.

Dimostrerò questa procedura con Giovanni CI Ciano, un tecnico animale del nostro istituto. Il primo giorno, somministrare la terapia di interesse e i controlli appropriati del veicolo. In questa dimostrazione, cinque microgrammi di proteina interleuchina 11 umana ricombinante sono stati disciolti in 200 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato e somministrati per via intraperitoneale per determinare i tempi e la frequenza delle somministrazioni, che dipenderanno dal profilo farmacocinetico stabilito per il reagente terapeutico che si sta testando. Qui è mostrato uno schema del trattamento profilattico utilizzando iniezioni intraperitoneali due volte al giorno nel corso dell'esperimento.

Monitora la consistenza delle feci e la presenza di sangue e pesa ogni topo ogni giorno. Nei giorni del trattamento, la pesatura deve coincidere con quella del farmaco terapeutico per ridurre al minimo lo stress per i topi causato da manipolazioni ripetute. Il terzo giorno, preparare una soluzione di destrano solfato di sodio al 2,5% o DSS nell'acqua potabile fornita abitualmente ai topi dalla struttura animale.

Per l'esperimento sono necessari circa cinque millilitri per topo al giorno di soluzione DSS. Il consumo dell'acqua DSS può variare se la temperatura ambiente della struttura per animali fluttua. Fornisci DSS fresco ai topi.

Aggiungi Liam in bottiglie d'acqua pulite per cinque giorni consecutivi la sera del quinto giorno. Fornire normale acqua potabile oltre a pellet di cibo schiacciato e un integratore proteico fornito in piccole piastre di Petri. La mattina dell'ottavo giorno.

Procedere con l'eutanasia murina come descritto nel protocollo testuale per raccogliere i tessuti per la successiva analisi istologica. Eseguire i test di routine per stabilire il dosaggio DSS appropriato ed eludere la variazione da lotto a lotto. Il dosaggio appropriato dovrebbe essere basato sulla perdita di peso e sull'istopatologia della colite confermata.

Regolare la dose di DSS tra l'uno e il 4% in peso per volume. A seconda della microflora della struttura animale e del lotto di DSS. L'apparecchiatura endoscopica deve essere assemblata secondo le procedure standard.

Sterilizzare e pulire la sonda dell'endoscopio con etanolo al 70% o un lubrificante antibatterico. I video possono essere registrati utilizzando un computer portatile o desktop e software multimediali standard come iMovie. Un monitor di computer standard piuttosto che un monitor di livello medico è sufficiente per visualizzare il colon durante la procedura endoscopica.

Anestetizzare gruppi di cinque o sei topi contemporaneamente in una camera con il 3% di fluoro in ossigeno al 100% a una velocità compresa tra 0,2 e 0,4 litri al minuto. Una volta che i topi sono anestetizzati, il che è confermato dal pizzicamento delle dita dei piedi, i livelli di fluoro devono essere modificati tra lo 0,5 e il 2% Per il mantenimento, rimuovere un singolo topo dalla camera e posizionarlo con il lato ventrale rivolto verso l'alto con la testa fissata in un cono nasale, l'anestesia completa deve essere monitorata e le zampe posteriori devono essere regolate in modo che siano distese dietro il topo. Luogo. Unguento veto sugli occhi dei topi per prevenire la secchezza.

Tieni la coda del topo nel punto in cui incontra la colonna vertebrale inferiore per rivelare chiaramente l'ano. Il flusso d'aria consentirà al colon di gonfiarsi se il flusso d'aria è troppo forte. L'aria verrà pompata nello stomaco del topo.

Inserire con cautela la guaina rigida dell'endoscopio nel retto. Generalmente, l'endoscopio può essere inserito fino a tre centimetri, punto in cui il colon nei topi si curva e non è accessibile all'endoscopio rigido. Una difficoltà comune durante le procedure endoscopiche è il blocco dell'accesso al lume del colon a causa della materia fecale.

Evita questo massaggiando delicatamente la pancia dei topi prima della procedura per incoraggiare la defecazione. Avvia la registrazione video in qualsiasi fase della procedura endoscopica. Il punteggio della malattia può essere registrato da un assistente esperto durante la procedura o in un momento successivo dai file video, assicurandosi che queste procedure siano eseguite da uno scienziato esperto.

Ogni procedura endoscopica richiederà circa due minuti per topo dopo l'esame endoscopico. Rimetti i topi nella loro gabbia e monitorali durante il recupero dall'anestesia. Gli animali vengono generalmente risvegliati mobili entro due minuti dalla rimozione dall'isof Lorraine che somministra il cono nasale mostrato qui sono risultati rappresentativi di topi esposti a DSS per modellare la malattia infiammatoria intestinale acuta.

All'ottavo giorno del protocollo non trattato. I topi wild type hanno la colite come previsto perdita di peso, vengono mostrati le immagini endoscopiche e i punteggi della colite endoscopica dei topi di controllo e di quelli sottoposti a trattamento con la proteina 11 dell'interleuchina umana ricombinante. La perdita di peso viene utilizzata come parametro standard per monitorare la malattia associata alla colite, che viene utilizzata di routine per monitorare la salute generale dei topi come visualizzato attraverso la diminuzione del punteggio della colite endoscopica.

La riduzione della malattia è evidente in seguito al trattamento terapeutico di topi con patologia indotta dalla malattia. Quindi, una volta che hai padroneggiato questa tecnica, dovrebbe essere un, dovresti essere in grado di valutare il mouse in circa due minuti. E in generale, ciò che ti permette davvero è di testare in modo molto efficace se questi trattamenti hanno o meno un effetto sull'infiammazione e sul cancro in un modello preclinico rilevante.