Generazione di cellule CAR T per adottiva terapia nel contesto di Glioblastoma standard di cura

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule T murine del recettore dell'antigene chimerico geneticamente modificate e valutarne l'efficacia nel contesto dello standard di cura. Per il glioma di alto grado, ciò si ottiene iniziando lo standard di cura, la radioterapia dell'intero cervello e la somministrazione di temozolomide ai topi. Successivamente, viene prodotto un retrovirus che esprime il vettore dell'auto, quindi le cellule T murine vengono trasdotte con il retrovirus dell'auto.

Infine, le cellule T CAR vengono consegnate a topi trattati con lo standard di cura, infine la consegna di cellule T CAR in combinazione con l'irradiazione dell'intero cervello e la temozolomide. La somministrazione viene utilizzata per verificare se il condizionamento dell'ospite secondo lo standard di cura migliora l'efficacia di una piattaforma di cellule T adottive. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunoterapia dei tumori cerebrali, come l'efficacia antitumorale di nuove immunoterapie nel contesto dello standard di cura per i gliomi di alto grado.

Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sull'efficacia delle cellule mi e T geneticamente modificate contro i gliomi di alto grado. Può anche essere applicato ad altri sistemi, come la valutazione della terapia con cellule T contro il melanoma, il polmone e altri modelli tumorali di metastasi cerebrali. In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché questa procedura richiede l'esecuzione di diversi passaggi in parallelo.

Pertanto, la pianificazione e l'organizzazione delle attività sono fondamentali. A dimostrare la procedura saranno Catherine Uni e Carter's Deva, entrambe talentuose studentesse laureate del mio laboratorio. Dopo aver preparato tre milligrammi per millilitro di temozolomide o TMZ in DMSO, mettere la soluzione in un bicchiere d'acqua su una piastra calda a 65 gradi Celsius per 10-15 minuti.

Una volta che il TMZ è completamente sciolto, la soluzione dovrebbe diventare di colore giallo pallido. Caricare completamente 15 siringhe da un millilitro con la soluzione TMZ. Il TMZ deve essere somministrato entro 90 minuti dalla preparazione per garantire che nessun TMZ precipiti fuori dalla soluzione per eseguire l'intera potenza di irradiazione cerebrale sull'irradiatore a raggi X e consentirne il riscaldamento, assicurarsi che il filtro appropriato sia in posizione e inserire le impostazioni di tensione e corrente corrette.

Una volta che i topi sono stati sedati, secondo il protocollo di testo, posizionare i topi sedati sulla griglia con la testa posizionata nell'area che riceve la massima intensità di raggi X. Utilizzare tubi di piombo per proteggere i corpi dal collo in giù per bloccare l'erogazione sistemica di raggi X. Posizionare i mouse all'interno della macchina a raggi X quando l'erogazione dei raggi X è completa.

Rimuovere gli animali dall'irradiatore. Quando gli animali riacquistano sufficiente coscienza e mantengono la posizione sdraiata sternale, rimettili nelle loro gabbie appropriate. Dopo aver preparato il terreno D 10 e raccolto le cellule HEC 2 93 T secondo il protocollo di testo, aggiungere un millilitro di sospensione cellulare a 7,5 volte 10 alle sei cellule per millilitro in ciascuna delle piastre rivestite di poli-L lisina da 1610 centimetri contenenti 10 millilitri di terreno D 10 incubare per una notte il giorno successivo.

E dopo aver preparato il plasmide dell'auto e il reagente di trasfezione come indicato nel protocollo di testo, aggiungere il complesso di DNA lipidico goccia a goccia all'incubazione di cellule T HEC 2 93 per sei-otto ore. Quindi sostituire il terreno con 12 millilitri di terreno a cellule T fresche o MTC. Quindi, versare una milza su un colino cellulare a maglie di 70 micrometri e disaggregare utilizzando l'estremità smussata dell'interno di una siringa da cinque millilitri per generare una singola sospensione cellulare.

Dopo aver preparato un pool di MTC fresco, la milza disaggregata in una provetta conica da 50 millilitri in MTC e pellet, le cellule eliminano i globuli rossi utilizzando cinque millilitri di un tampone di lisi per milza per risospendere le cellule mescolando bene pipettando delicatamente su e giù. Mettere la sospensione cellulare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere la reazione di lisi dal bagno d'acqua e aggiungere MTC in un rapporto uno a uno con il tampone di lisi per neutralizzare il lavaggio di reazione centrifugando a 300 Gs per 10 minuti.

Dopo aver aspirato il surnatante, utilizzare due millilitri per milza di MTC per risospendere il pellet Per contare le cellule, aggiungere 10 microlitri di sospensione cellulare a 190 microlitri di trian blue. Una volta calcolato il numero totale di cellule, utilizzare la MTC integrata con due microgrammi per millilitro di conna A e 50 unità internazionali per millilitro di interleuchina umana ricombinante due per diluire le cellule a una concentrazione di due volte 10 per le seste cellule per millilitro. Aggiungere due millilitri o quattro volte 10 alle seste cellule a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale ben trattata da 24 e incubare per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica il giorno dopo la splenectomia.

Preparare PBS contenente 25 microgrammi per millilitro. Il frammento di fibronectina umana ricombinante o RHFF e la coltura non tissutale di rivestimento hanno trattato piastre a 24 pozzetti aggiungendo 0,5 millilitri di soluzione a ciascun pozzetto il giorno successivo. Togliere la soluzione dai pozzetti e aggiungere un millilitro per pozzetto di BSA al 2% in PBS, incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Quindi rimuovere il BSA capovolgendo saldamente la piastra prima di aggiungere due millilitri di PBS per il lavaggio. Dopo aver raccolto il surnatante virale dalle cellule T HEC 2 93, aggiungere TCM fresco a un volume finale in millilitri pari al numero di pozzetti rivestiti di RHFF, più altri tre millilitri. Rimuovere i citi della milza in coltura dall'incubatore e sospendere il resus pipettando delicatamente su e giù due o tre volte in ciascuno.

Trasferire bene le sospensioni cellulari in una provetta conica da 50 millilitri. Successivamente, risospendere i citi nel surnatante virale a una volta da 10 a sei cellule per millilitro. Quindi aggiungere un millilitro per pozzetto della sospensione completa ai pozzetti delle piastre rivestite RHFF.

Ora fai girare le piastre per 90 minuti a 32 gradi Celsius e 770 GS con un'accelerazione di quattro e un'impostazione del freno pari a zero durante la rotazione. Preparare 50 unità internazionali per millilitro di IL umano ricombinante due in MTC. Dopo la centrifuga, aggiungere un millilitro di terreno a ciascun pozzetto delle piastre e incubare per una notte.

Se le cellule T raggiungono una confluenza superiore all'80%, dividere le cellule pipettando delicatamente su e giù in ciascun pozzetto due o tre volte. Quindi trasferire un millilitro da ciascun pozzetto in nuovi pozzetti di una piastra fresca trattata con coltura tissutale a 24 pozzetti. Aggiungere un millilitro di TCM fresco con 50 unità internazionali per millilitro di IL, due volte per ciascun pozzetto, se le cellule non raggiungono una confluenza superiore all'80%, cambiare metà del terreno pipettando lentamente un millilitro di terreno dalla parte superiore di ciascun pozzetto e sostituendolo con un millilitro di TCM fresco contenente 50 unità internazionali per millilitro di IL umano ricombinante, due cellule CAR T risospese pipettando delicatamente e tre volte in ogni pozzetto e trasferire in una provetta da centrifuga da 250 millilitri.

Far girare le celle a 300 GS per 10 minuti. Quindi, aspirare completamente il surnatante senza disturbare il pellet. Utilizzare il PBS per lavare le cellule, quindi contarle prima di lavarle una seconda volta.

Una tipica resa di cellule T CAR è di circa una volta 10 volte la sesta cellula per pozzetto con PBS Resus. Sospendi le cellule a una concentrazione di cinque volte 10 al settimo per millilitro per un'iniezione di una volta 10 al settimo in un volume di 200 microlitri per iniettare nei topi portatori di tumore, usa un ago da 27 a 31 gauge per caricare da 500 a 1000 microlitri in una siringa da insulina, assicurandoti che tutte le bolle vengano espulse. Le cellule T CAR sono state generate per trasduzione con il vettore retrovirale E GFR V three CAR, che contiene il virus delle cellule staminali rine o le lunghe ripetizioni terminali MSCV.

La regione gag estesa e il sito di splicing della busta e un segnale di confezionamento virale. L'EG FFR V tre auto contenente l'umano anti EEG FRV tre frammento variabile a catena singola. 1 39 è stato clonato nel vettore retrovirale in tandem con le regioni intracellulari murine CD otto, tm CD 28 4 1 BBB e CD tre zeta Dopo la trasduzione, EG FFR V tre cellule CAR T possono essere quantificate e fenotipizzate mediante citometria a flusso con un pannello a due colori composto da una bico rina STRT coniugata biotinilata, EG FFR V tre, multier derivato e anti CD tre fit C.Utilizzando il protocollo descritto in questo video, l'espressione di car è osservata di routine nel 55-70% delle cellule T murine CD, tre.

Le cellule T CAR possono essere ulteriormente fenotipizzate mediante l'aggiunta di altri anticorpi marcati in fluorescenza al pannello dell'auto a due colori come si vede in questo esempio, la colorazione per CD otto e CD quattro mostra che il 70% delle auto trasdotte sono cellule T positive CD otto mentre il 20% sono cellule T CD quattro positive Una volta padroneggiate. Questa tecnica può essere eseguita in 12 ore per un periodo di una settimana se viene eseguita correttamente Seguendo questa procedura. Altri metodi come Elisa, Ellie spot e/o la colorazione intracellulare delle citochine possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande.

Ad esempio, le cellule T trasdotte dal recettore dell'antigene chimerico rispondono funzionalmente al riconoscimento dell'antigene e la loro funzionalità è antigene-specifica? Non dimenticare che lavorare con retrovirus, temozolomide e radiazioni a raggi X può essere estremamente pericoloso e percussioni come operare sotto bsl. Due condizioni: indossare dispositivi di protezione individuale, eseguire esperimenti nelle aree designate e ottenere una formazione adeguata per la manipolazione degli animali.

E l'uso di apparecchiature a raggi X dovrebbe sempre essere preso durante l'esecuzione di queste procedure.