Name: Generazione di cellule CAR T per adottiva terapia nel contesto di Glioblastoma standard di cura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Scopri come generare cellule CAR T specifiche per EGFRvIII e valutarne l'efficacia nel contesto della terapia standard per il glioblastoma. Questo metodo combina radioterapia cerebrale e temozolomide con immunoterapia adottiva.

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Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Laura Johnson e il dottor Richard Morgan per aver fornito il costrutto retrovirale CAR. Gli autori ringraziano anche Giao Ngyuen per la sua assistenza con la dosimetria per l'irradiazione dell'intero cervello. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione NIH NCI 1R01CA177476-01.

Questo protocollo si basa su un disegno sperimentale in cui 10 topi vengono trattati con 10 7 CAR cellule T ciascuno. Ciò significa che saranno necessari 10 8 cellule CAR T; il rendimento dovrebbe essere sovrastimata da 5 x 10 7 -1 x 10 8 per conto per la perdita di redditività. Il protocollo che segue viene scalato per generare circa 200 x 10 6 cellule. Le cellule sono poi somministrati per via endovenosa al femminile C57BL / 6 topi con 9 giorni stabiliti singenici tumori intracranici EGFRvIII-positivo, sviluppato dalle linee esistenti di cellule di melanoma KR158B astrocitoma o B16. In concomitanza con il CAR generazione di cellule T, i topi di tumore vengono somministrati dosi clinicamente rilevanti di lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) e WBI (16.5 Gy). I topi sono stati mantenuti e allevati in condizioni esenti da organismi patogeni della Duke University Medical Center (DUMC). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dalla Duke University Istituzioneal Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. La somministrazione di Temozolomide per Mice tumore-cuscinetto Giorni 0 a 4: <ol><li> Calcolare il numero totale di topi da iniettare e moltiplicare tale da 0,5 a determinare il volume di soluzione TMZ necessario (ad esempio, 30 topi x 0.5 ml = 15 ml TMZ) e aggiungere 1,5 ml di volume per tenere conto di ricaduta (16.5 ml TMZ ). </li><li> Moltiplicate questo volume totale da 3 mg / ml per determinare il peso di liofilizzato TMZ necessario (ad esempio, 16,5 x 3 = 49.5 mg TMZ). Pesare questo in una conica da 50 ml. ATTENZIONE: TMZ è tossico per inalazione, ingestione e contatto con gli occhi, la pelle e le membrane mucose. Consultare la sicurezza dell&#39;istituzione del lavoro e / o di salute ambientale e il reparto wellness per le raccomandazioni in materia di riduzione del rischio di esposizione. </li><li> Moltiplicare il volume totale di 0,15 per determinare il volume di dimetilsolfossido (DMSO) necessaria (ad esempio, 16,5 x0,15 = 2.475 ml DMSO). Filtro sterilizzare questo volume di DMSO (più altri 2 ml per spiegare ricaduta) attraverso un filtro da 0,2 micron in una provetta sterile. Aggiungere 2,475 ml di DMSO sterile per la polvere TMZ. </li><li> Posizionare la soluzione TMZ / DMSO in un becher di acqua su una piastra calda a 65 ° C per 10-15 min. Una volta TMZ è completamente sciolto, la soluzione dovrebbe diventare colore giallo paglierino; se la soluzione diventa rosa, allora il TMZ è degradata, e una nuova soluzione dovrebbe essere preparata con un nuovo sacco di TMZ. </li><li> Calcolare il volume appropriato di soluzione salina sterile necessario moltiplicando 0,85 per il volume totale (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml di soluzione salina). Aggiungere 15 ml di soluzione salina sterile per un conica da 50 ml. Mentre TMZ sta dissolvendo in DMSO, saline di calore a 65 ° C. </li><li> Vortex la soluzione / DMSO TMZ per garantire che la polvere TMZ è completamente sciolto e aggiungere lentamente salina riscaldata alla soluzione / DMSO TMZ. </li><li> Immediatamente dopo la preparazione, caricare completamente 15 x 1 ml tubercolina syringes con la soluzione TMZ per l&#39;amministrazione di quattro giorni stabiliti tumorali cuscinetto topi. </li><li> Ripetere questa procedura nei giorni da 1 a 4 per un totale di cinque amministrazioni TMZ. </li></ol> 2. Whole Brain irradiazione dei topi tumore-cuscinetto Giorni 2 a 4: <ol><li> Accendere il irradiatore X-ray e lasciarlo riscaldare-fino a piena tensione. Assicurarsi che il filtro appropriato è a posto e ingresso la tensione corretta e le impostazioni correnti (Figura 2a). NOTA: La dosimetria del irradiatore andrà stabilita anticipatamente per stabilire i provvedimenti impostazioni di tensione e layout a griglia (figura 2A, B). </li><li> Calcolare la lunghezza di tempo che è necessario per provocare 5,5 Gy X-ray irradiazione. Ad esempio, se i raggi X vengono forniti ad una velocità di 2 Gy / min, poi 2,75 min è necessario fornire un totale di 5,5 Gy. Inserire la durata di tempo adeguato. NOTA: La tabella 2 fornisce il mouse WBI dosa unnd loro equivalenti clinico nell&#39;uomo. Nel contesto di gliomi ad alto grado, 60 Gy frazionata WBI (2 frazioni Gy, 5 giorni / settimana per 6 settimane) è lo standard clinico di cura, e l&#39;equivalente murino utilizzato è 16,5 Gy (5,5 Gy x 3). </li><li> Preparare una soluzione fresca di ketamina / xylazina per anestesia sistemica aggiungendo 2 ml di ketamina e 1 ml a 17 ml xilazina soluzione salina in modo che la soluzione finale è di 10 mg / ml di ketamina e 1 mg / ml xylazina. </li><li> Pesare topi e amministrare 10 ml di ketamina / xilazina intraperitoneale per grammo di peso corporeo tale che gli animali ricevono una dose di ketamina a 100 mg / kg e 10 mg / kg xilazina. I topi dovrebbe essere pienamente sedato e visibilmente la respirazione entro 2 minuti di somministrazione / xylazina ketamina. </li><li> Per mantenere l&#39;umidità oftalmica negli animali sedati, strofinare delicatamente una piccola quantità di lacrime artificiali unguento su ciascun occhio. </li><li> Inserire topi sedati sulla griglia in modo tale che le teste sono posizionati nella zona che riceve il massimo raggi X intensity (Figura 2B, C). Corpi Shield dal collo in giù, con opportunamente dimensionate tubi di piombo per bloccare la consegna a raggi X sistemica (Figura 2D). </li><li> Inserire topi posizionati sotto il fascio di raggi X in modo che il laser indica il punto focale del fascio di raggi X è al di coordinate (0,0) sul layout della griglia. Inizia consegna X-ray. </li><li> Quando la consegna a raggi X, rimuovere gli animali dal irradiatore e posto su una piastra elettrica caldo. Non accogliere animali sedati con animali coscienti fino animali hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere prona sternale. Una volta che gli animali possono mantenere prona sternale, posizionare animali coscienti nel loro gabbie appropriate. </li><li> Ripetere questa procedura nei giorni 3 e 4 per un totale di tre dosi frazionate di radiazioni. </li></ol> 3. Trasfezione -1 ° giorno: <ol><li> Preparare supporti D10 aggiungendo 50 ml di siero bovino fetale (FBS) a 500 ml di Dulbecco Modified (DMEM). </li><li> Preparare supporti di cellule T (TCM) con l&#39;aggiunta di 5,5 ml di L-glutammina, 5,5 ml di piruvato di sodio, 5,5 ml aminoacidi non essenziali, e 5.5 ml Pencillin / di streptomicina (pen / strep) a 500 supporti ml RPMI-1640. Avanti, aggiungere 550 ml di 2-mercaptoetanolo e 550 ml gentamicina. Infine, aggiungere 50 ml di FBS. </li><li> Harvest vitro cellule in coltura HEK293T e portare a una concentrazione di 7,5 x 10 6 cellule / ml nei media D10. </li><li> La tavola 10 ml supporti D10 e aggiungere 1 ml di sospensione cellulare HEK293T in ciascuno di 16 x 10 centimetri poli-D-lisina (PDL) piastre rivestite. </li><li> Incubare per una notte a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> Giorno 0: <ol start="6"><li> Sostituire i media con 10 ml D10 fresco almeno 30 minuti prima di trasfezione le cellule. </li><li> Determinare la quantità di vettore plasmidico, PCL-Eco vettoriale, e liposomiale trasfezione reagente necessario per trasfezione moltiplicando il numero totale di piatti + 1 (16 + 1 = 17) 14.1 mgplasmide vettore (14.1 x 17 = 239,7 mg), 9.9 mg PCL-Eco vettore (9,9 x 17 = 168,3 mg), e 60 ml di reagente liposomiale trasfezione (60 x 17 = 1.020 ml). Tutti i reagenti devono essere a temperatura ambiente prima di preparare soluzioni. </li><li> Etichettare due provette A e B. In tubo A, aggiungere 239,7 mcg vettore plasmidico e 168,3 mg PCL-Eco vettore a (1,5 x 17) ML-siero ridotto modificato mezzo di Eagle (RS-MEM). Nel tubo B, aggiungere 1020 ml liposomiale trasfezione reagente (1,5 x 17) ml RS-MEM. </li><li> Incubare A e B separatamente per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Mescolare A e B insieme delicatamente (vortex per 1-2 sec capovolgere varie volte) e incubare per 20 min a temperatura ambiente per formare lipidi complessi / DNA. </li><li> Aggiungere lipidi / DNA complesso goccia a goccia per le cellule HEK293T a 10 centimetri piatto. </li><li> Incubare a 37 ° C per 6-8 ore o durante la notte (non superare 24 ore). </li><li> Dopo 6-8 ore di incubazione, sostituire medie con 12 ml di TCM fresco per la produzione virale. Questo placcato supportisaranno utilizzati al Day 2 come surnatante virale per la trasduzione di cellule T. </li></ol> 4. La splenectomia e preparazione delle cellule T Giorno 0: <ol><li> Versare 10 ml di TCM in una conica da 50 ml e posto in ghiaccio per la raccolta della milza. </li><li> Sacrifica il numero appropriato di animali da CO 2 asfissia e decapitazione secondario: Posizionare gli animali in gabbia ricevere CO 2 ad una portata di 10-30% gabbia volume / minuto, secondo le linee guida American Veterinary Medical Association (non più di 5 animali possono essere sacrificato contemporaneamente) fino termina respirazione e per due minuti successivi. Rimuovere gli animali dalla camera di CO 2 e di decapitarlo. NOTA: Uno spleen di un 6-12 settimane vecchia femmina C57BL / 6 del mouse produrrà circa 4,5-5 x 10 7 splenociti. Qui, 4 milze saranno raccolte per circa 200 x 10 6 cellule. </li><li> Posare il mouse in modo che il suo lato destro rivolto verso l&#39;alto, espruzzare con il 70% di etanolo. Con le pinze, afferrare un sottile lembo di pelle sotto la gabbia toracica sinistra e tagliare una leggera incisione con le forbici. Rimuovere la pelle, afferrare con cura un sottile piega del peritoneo con una pinza, e tagliare una piccola cavità. </li><li> La milza è un piccolo, allungato, organo rosso scuro che ricorda un fagiolo appiattita; delicatamente afferrare la milza con le pinze e le accise tagliando via il tessuto connettivo circostante. Posizionare le milze asportati nel conica contenente 10 ml di TCM su ghiaccio. </li><li> Versare milze oltre un filtro 70 micron cella maglie e disaggregare da schiacciare con l&#39;estremità smussata della parte interna di una siringa da 5 ml per generare una cella singola sospensione. Un massimo di due milze dovrebbe essere disaggregate per filtro a rete. </li><li> Utilizzare un piccolo volume di TCM di lavare accuratamente il filtro seguente disaggregazione per raccogliere eventuali splenociti rimanenti. Piscina tutto milze disaggregati in una cella singola sospensione. Portare il volume finale di 50 ml con TCM per un lavaggio did girare a 300 xg per 10 min. </li><li> Preparare una soluzione di tampone di lisi 1x aggiungendo 5 ml 10x tampone di lisi a 45 ml di acqua sterile. Per eliminare i globuli rossi, risospendere pellet in 5 ml di 1x tampone di lisi per milza in una conica da 50 ml, mescolando bene pipettando gentilmente su e giù. Se superiore a 5 milze, utilizzare un tubo da centrifuga da 250 ml. Inserire conica o tubo da centrifuga in un bagno d&#39;acqua 37 ° per 5 minuti. </li><li> Rimuovere la reazione lisi dal bagno di acqua e aggiungere TCM in un rapporto 1: 1 con tampone di lisi per neutralizzare la reazione. Lavare facendo girare a 300 xg per 10 min. </li><li> Aspirare il surnatante e pellet completamente risospendere in MTC (2 ml / milza, 8 ml totale per 4 milza) pipettando su e giù. </li><li> Contare le cellule con l&#39;aggiunta di 10 ml di sospensione cellulare a 190 ml blu trypan (1:20 diluizione). Moltiplicare il numero ottenuto in uno dei quattro quadrati reticolati da 20 x 10 x 4 volume totale (8 ml) per ottenere il numero totale di cellule (ad esempio, 125 cellule x 20 x 10 4 </sup&gt; x 8 ml = 200 x 10 6 splenociti). </li><li> Diluire le cellule ad una concentrazione di 2 x 10 6 cellule / ml in TCM, supplementato con 2 ug / ml concanavalina A (ConA) e 50 UI / ml ricombinante umano interleuchina-2 (rhIL-2). Così, per 200 x 10 6 splenociti, aggiungere 92 ml di media per 8 ml cellule, 200 mcg Cona e 5.000 UI rhIL-2. </li><li> Aggiungere 2 mL cellule in ciascun pozzetto 24 pozzetti tessuto-cultura piastre trattati, tale che 4 x 10 6 cellule sono in ogni pozzetto (es, 100 ml di cellule richiederanno circa 4 piastre). </li><li> Incubare per una notte a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> 5. Trasduzione 1 ° giorno: <ol><li> Calcolare il numero della cultura non-tessuto trattato piastre da 24 pozzetti necessari per la trasduzione moltiplicando il numero di milza raccolte da 2 (8 piastre sono necessari per 4 milza). </li><li> Successivamente, calcolare il volume richiesto di soluzione ricombinante frammento fibronectina umana (RHFF)necessario per lastre cappotto moltiplicando (numero totale di pozzi + 3) x 0,5 ml (8 piastre x 24 pozzi = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml. </li><li> Preparare 97,5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente RHFF ad una concentrazione di 25 ug / ml moltiplicando il volume totale da 25 mg (97,5 x 25 = 2437,5 mg). Aggiungi questa quantità di RHFF a 97,5 ml di PBS. </li><li> Coat coltura non-tessuto trattato piastre da 24 pozzetti aggiungendo 0,5 ml di soluzione PBS / RHFF per pozzetto. </li><li> Incubare una notte a 4 ° C. </li></ol> 2 ° giorno: <ol start="6"><li> Dump soluzione PBS / RHFF dalla cultura non-tessuto trattato piastre da 24 pozzetti. </li><li> Aggiungere 1 ml / pozzetto di albumina sierica bovina 2% (BSA) in PBS e incubare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Rimuovere BSA saldamente ribaltare piatto. Lavare con l&#39;aggiunta di 2 ml di PBS. </li><li> Raccogliere surnatante virale trasferendo file multimediali da ogni HEK293T PDL piastra in una provetta da 250 ml centrifuga e spin 10 min a 500 x g. </li><li> Trasferire accuratamente su viralepernatant in un fresco 250 ml tubo da centrifuga, assicurandosi di non disturbare il pellet che possono essersi formate. </li><li> Aggiungere TCM fresco al surnatante virale tale che il volume finale è 3 ml più che la quantità necessaria per pozzi RHFF rivestite. Ad esempio, per 192 pozzetti RHFF rivestite, portare il volume del surnatante virale a 192 + 3 ml = 195 ml. </li><li> Rimuovere splenociti coltivate dal incubatore e risospendere pipettando gentilmente su e giù 2 - 3 volte in ogni pozzetto. Trasferire in un conica 250 ml. Se si utilizza una pipetta multicanale, con un serbatoio sterile prima del trasferimento contribuirà ad accelerare questo passaggio. Conta come descritto in precedenza e far girare a 300 xg per 10 min. </li><li> Aggiungere rhIL-2 per surnatante virale ad una concentrazione di 50 UI / ml. Ad esempio, aggiungere 50 x 195 = 9.750 UI a 195 ml di surnatante virale-2 rhIL. </li><li> Risospendere splenociti di surnatante virale a 1 x 10 6 cellule / ml </li><li> Aggiungere 1 ml / pozzetto di sospensione splenocyte a piastre da 24 pozzetti RHFF rivestite. </li><li>Spin per 90 min in base alle seguenti impostazioni: 770 xg, accelerazione = 4, freno / decelerazione = 0, 32 ° C. </li><li> Preparare una soluzione TCM con 50 UI / ml rhIL-2. Ad esempio, preparare una soluzione 200 TCM aggiungendo 10.000 UI rhIL-2. Aggiungere 1 ml di rhIL-2 / TCM a ciascun pozzetto dopo centrifugazione. </li><li> Culture notte a 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 6. CAR T cellule Cultura e Harvest Giorni 3 e 4: <ol><li> Se le cellule T raggiungono&gt; 80% di confluenza, le cellule possono essere divise (questo di solito avviene il giorno 3 o 4 giorni). Per dividere le celle, delicatamente pipettare su e giù in ciascun pozzetto 2-3 volte, e passare 1 ml da ogni pozzetto in nuovi pozzetti di una 24-pozzetti trattati tessuto-coltura fresco. Quindi, aggiungere 1 ml di TCM fresca con 50 UI / ml di IL-2 in ciascun pozzetto tale che il volume finale di 2 ml in tutti i pozzetti. </li><li> Se le cellule non raggiungono&gt; 80% di confluenza, effettuare un cambiamento mezza mezzi lentamente pipettando off 1 ml del supporto dalla parte superiore di ciascun pozzetto. Evitare disturbing cellule insediate sul fondo durante la rimozione dei media. Aggiungere 1 ml di TCM fresco contenente 50 UI / ml rhIL-2. </li></ol> 5 ° giorno: <ol start="3"><li> Risospendere le cellule T CAR pipettando gentilmente su e giù per 3 volte in ogni pozzetto e il trasferimento ad un tubo da centrifuga da 250 ml. Spin cellule a 300 xg per 10 min. </li><li> Surnatante completamente aspirate senza disturbare pellet. Risciacquare una volta con PBS, contare le cellule come precedentemente descritto, e lavare con PBS una seconda volta. Una resa di cellule CAR T tipico è di circa 1 x 10 6 cellule per bene (8 piastre cellule x 24 pozzi = 192 x 10 6 CAR T). </li><li> Risospendere le cellule in PBS ad una concentrazione di 5 x 10 7 / ml per una iniezione di 1 x 10 7 in un volume di 200 mg (per esempio, per 192 x 10 6 cellule T CAR, risospendere pellet lavate in PBS 3,84 ml). </li></ol> 7. CAR T cellule Administration per Mice tumore fruttiferi 5 ° giorno: <ol><li> Transpocellule rt sul ghiaccio per stabulario per iniezione endovenosa. Load 500-1000 ml in siringa da insulina con 27-31 G ago, assicurando che tutte le bolle vengono espulsi. </li><li> Prendete un mouse alla base della coda e mettere in fermo tubi. </li><li> Estrarre la coda tesa con la vena rivolto verso l&#39;alto, e scivolare l&#39;ago di circa 1-2 mm sotto la pelle nella vena inserendolo parallelo alla vena della coda. Lentamente espellere 200 microlitri nella vena. Se l&#39;ago è correttamente inserito nella vena, il volume sarà facile flusso in; altrimenti ci sarà la resistenza e l&#39;ago dovranno essere rimossi dalla coda e ri-inserito correttamente. </li></ol>

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<li>Hughes, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+a+TCR+gene+derived+from+a+patient+with+a+marked+antitumor+response+conveys+highly+active+T-cell+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions.</a> Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

La timeline trattamento qui descritto è stato progettato per modello standard clinico di cura e di sfruttare i suoi effetti per l&#39;automobile la terapia adottiva. AUTO dosi T cellulari, regimi di TMZ, e l&#39;amministrazione radioterapia possono essere modificati per aumentare in vivo l&#39;attività delle cellule T, lymphodepletion, e tumore uccisione. Regimi TMZ può essere aumentata per produrre mieloablazione host e una maggiore espansione delle cellule adoptively trasferiti 30. Inoltre, gli eff...

Glioblastoma (GBM) è il tumore maligno al cervello primario più comune ed è invariabilmente fatale. La resezione chirurgica accoppiato con standard di non-specifica delle cure di chemioterapia e radioterapia non riesce ad eliminare completamente le cellule maligne, con conseguente prognosi infausta di meno di 15 mesi in pazienti affetti da questa malattia 1. Al contrario, l&#39;immunoterapia offre un metodo preciso per specifico le cellule tumorali, e quindi ha il potenziale per servire come piattaforma trattamento altamente efficace con un ridotto rischio di tossicità garanzie 2-4. Le cellule T progettati ex vivo per esprimere i recettori chimerici antigene (auto) offrono una strategia versatile per tumore immunoterapia. CAR vengono generati fondendo la regione variabile extracellulare di un anticorpo con la molecola di segnalazione uno o più cellule T intracellulare (s), al posto di un integrale complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) -restricted recettore delle cellule T 5. Questo modo di anticorpi come att antigeneon permette cellule T antigene-specifiche reattivi per riconoscere e rispondere ad antigeni tumorali, in assenza di MHC e possono essere adattati per un antigene repertorio virtualmente infinita. Cellule T ingegnerizzate CAR contro una varietà di antigeni tumorali hanno dimostrato l&#39;efficacia preclinica e promessa eccezionale nella clinica 6-9. In particolare, nel contesto di GBM, un CAR piattaforma di cellule T di targeting di crescita epidermico recettore del fattore di variante III (EGFRvIII), una mutazione specifica per tumore espresso sulla superficie delle cellule del 10, ha dimostrato di prolungare la sopravvivenza in glioma-cuscinetto topi 11. Nonostante la loro versatilità, tuttavia, il beneficio clinico di CAR terapia adottiva non è stato pienamente realizzato, in parte a causa immunosoppressione associata al tumore e l&#39;evasione immune 12-16 e sfide nel creare e mantenere le cellule T antigene-specifiche in vivo. Sfruttando standard di cura (SOC) con immunoterapia può potenzialmente superare molti di questi limitazioni, con conseguente maggiore efficacia sia in ambito preclinico e clinico. SOC per la post-resezione GBM consiste di temozolomide alte dosi (TMZ), un DNA agente alchilante 17, e tutta l&#39;irradiazione cerebrale (WBI) 1. Questi trattamenti si presume di sinergizzare con i vaccini tumorali attraverso upregulation di tumore MHC espressione 18-20 e lo spargimento di antigeni da parte delle cellule tumorali morte 17,19,21,22. In effetti, l&#39;aggiunta di TMZ 20,23 o 18,24 WBI porta a una maggiore efficacia antitumorale dei trattamenti a base immunitaria nel setting preclinico. Inoltre, come molti chemioterapici citotossici non specifici, TMZ è noto per provocare 25,26 linfopenia sistemica, che può essere sfruttato come mezzo di accoglienza condizionata per le piattaforme di terapia adottivi 27-29. Lymphodepletion TMZ mediata ha dimostrato di aumentare la frequenza e la funzione delle cellule T antigene-specifiche, con conseguente maggiore efficacia di un ADOPPiattaforma terapia tive contro i tumori intracranici 30. Nel contesto della terapia CAR, lymphodepletion serve come mezzo di host-condizionata sia la riduzione del numero di cellule T soppressori endogena 31, e indurre proliferazione omeostatica 32 attraverso concorrenza ridotta per citochine 33, migliorando così l&#39;attività antitumorale 11,34. Dato il rapporto sinergico tra le piattaforme SOC e immunoterapia GBM, valutare nuove terapie adottivi e piattaforme vaccino nel contesto del SOC è fondamentale per trarre conclusioni significative per quanto riguarda l&#39;efficacia. In questo protocollo, delineiamo un metodo per la generazione e la somministrazione endovenosa di cellule murine CAR T specifiche per EGFRvIII accanto TMZ e WBI in topi portatori di tumori intracranici EGFRvIII-positivi (vedi Figura 1 per il trattamento temporale). Brevemente, le cellule T sono realizzati CAR ex vivo da trasduzione retrovirale. Rene embrionale umano (HEK) 293T cellule sono trasfettate con un complesso DNA / lipide (contenente il vettore CAR e plasmidi PCL-Eco) per produrre virus, che viene poi utilizzato per trasdurre splenociti murini attivate che vengono raccolte e coltivate in parallelo. Durante il corso della generazione CAR, ospita murine recanti tumori intracranici EGFRvIII-positivi vengono somministrati frazionata tutto il cervello a raggi X irradiazione e il trattamento sistemico TMZ a dosi paragonabili a SOC clinica. Cellule T auto sono poi consegnati per via endovenosa a host lymphodepleted. La seguente procedura è descritta in sette fasi distinte: (1) La somministrazione di Temozolomide per tumore Mice, (2) irradiazione cerebrale totale di topi tumore-cuscinetto, (3) Transfection, (4) La splenectomia e T cellule Preparazione, (5 ) trasduzione, (6) Cultura celle CAR T e Harvest, e (7) la somministrazione di cellule T di topi CAR tumore-cuscinetto. Queste fasi sono costituite da diversi passaggi che si estendono 6-7 giorni e sono state compiute contemporaneamente.

<table><tbody><tr><td>pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector</td><td>Imgenex</td><td>10045P</td><td>Vettore helper per la generazione di retrovirus CAR</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2010</td><td>Mitogeno non specifico per indurre la proliferazione delle cellule T e la trasduzione virale</td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>ClonTech/Takara</td><td>T100B</td><td>Facilita la trasduzione retrovirale delle cellule T</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, piruvato</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td>Terreni di coltura HEK293</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Terreni di coltura per cellule T</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Siero ridotto</td><td>Medium Life technologies</td><td>11058-021</td><td>Terreni di trasfezione</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutammina</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td>Integratore di terreni di coltura di cellule T</td></tr><tr><td>100 mM Sodium Pyruvate</td><td>Life technologies</td><td>11360-070</td><td>Integratore di terreni di coltura di cellule T</td></tr><tr><td>100X MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali Life technologies</td><td></td><td>11140-050</td><td>Integratore di terreni di coltura di cellule T</td></tr><tr><td>55 mM 2-Mercaptoethanol</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td>Agente riducente per rimuovere i radicali liberi</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td>Integratore di terreni per colture di cellule T</td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/ml)</td><td>Life technologies</td><td>15750-060</td><td>Integratore di terreni per colture di cellule T</td></tr><tr><td>GemCell U.S. Origin Siero fetale bovino</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-500</td><td>Fornisce fattori di crescita e nutrienti per la crescita cellulare in vitro</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA), Frazione V&ndash; </td><td>Gemini Bio Products</td><td>700-100P</td> di grado standard <td>Blocca il legame non specifico del retrovirus alle piastre rivestite di retronectina</td></tr><tr><td>Lyse farmaceutica (10x concentrato)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>Lisi i globuli rossi durante l'elaborazione degli splenociti</td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtri cellulari sterili</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Filtra le particelle di tessuto di grandi dimensioni durante l'elaborazione degli splenociti</td></tr><tr><td>Piastre di coltura BioCoat da 100 mm con poli-D-lisina</td><td>Corning 356469</td><td></td><td>Promuove l'adesione delle cellule HEK293 per massimizzare la proliferazione dopo la trasfezione</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Temozolomide</td><td>Best Pharmatech</td><td>N/A</td><td>Polvere liofilizzata preparata il giorno della somministrazione</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D2650</td><td>Necessario per la completa dissoluzione della temozolomide</td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td>Hospira</td><td>IM 0132 (5/04)</td><td>Solvente per temozolomide e ketamina/xilazina</td></tr><tr><td>Ketathesia HCl</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>11695-0701-1</td><td>Soluzione di ketamina</td></tr><tr><td>AnaSed</td><td>Lloyd Inc</td><td>N/A</td><td>Soluzione sterile di xilazina 100 mg/ml</td></tr></tbody></table>

generazione di cellule car t per adottiva terapia nel contesto di glioblastoma standard di cura

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

L'immunoterapia con cellule T adottive offre una strategia promettente per mirare ed eliminare in modo specifico i gliomi maligni. Le cellule T possono essere ingegnerizzate ex vivo per esprimere recettori chimerici dell'antigene specifici per gli antigeni del glioma (cellule T CAR). L'espansione e la funzione delle cellule CAR T trasferite in modo adottivo possono essere potenziate dagli effetti linfodepletivi e tumoricidi della chemioterapia e della radioterapia standard di cura. Descriviamo un metodo per generare cellule T CAR che hanno come bersaglio EGFRvIII, un antigene specifico del glioma, e per valutarne l'efficacia quando combinato con un modello murino di glioblastoma standard di cura. Le cellule T sono ingegnerizzate per trasduzione con un vettore retrovirale contenente il gene CAR anti-EGFRvIII. Gli animali portatori di tumore sono sottoposti a condizionamento dell'ospite mediante un ciclo di temozolomide e irradiazione dell'intero cervello a regimi di dose progettati per modellare lo standard clinico di cura. Le cellule T CAR vengono quindi somministrate per via endovenosa agli ospiti innescati. Questo metodo può essere utilizzato per valutare l'efficacia antitumorale delle cellule CAR T nel contesto dello standard di cura.

Cellule T CAR sono generati dalla trasduzione con il EGFRvIII CAR vettore retrovirale 11. Questo vettore, MSGV1, è stato sviluppato dal vettore SFGtcLuc_ITE4 35, che contiene il virus cellule staminali murine (MSCV) lunghe ripetizioni terminali, la estesa regione gag e sito di splicing busta (splice donatore, sd, e splice accettore, sa), e virale Segnale di imballaggio (ψ). Il CAR EGFRvIII contenente l&#39;anti-EGFRvIII catena singola frammento umano variabile (scFv) 139, in tandem con CD8TM murino...

Gli effetti linfodepletivi e immunomodulatori della chemioterapia e dello standard di cura delle radiazioni possono essere sfruttati per migliorare l'efficacia antitumorale dell'immunoterapia con cellule T. Descriviamo un metodo per generare cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) specifiche per EGFRvIII e somministrarle nel contesto dello standard di cura del glioblastoma.

Generazione di cellule CAR T per adottiva terapia nel contesto di Glioblastoma standard di cura

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare linfociti T murini modificati geneticamente che esprimono un recettore chimerico dell'antigene e valutarne l'efficacia nel contesto del trattamento standard. Per il glioma di alto grado, ciò viene realizzato iniziando innanzitutto il trattamento standard, costituito da radioterapia cerebrale totale e somministrazione di temozolomide nei topi. Successivamente, viene prodotto un retrovirus che esprime il vettore car, quindi i linfociti T murini vengono trasdotti con il retrovirus car.Infine, le cellule T CAR vengono somministrate a topi trattati con la terapia standard, arrivando alla somministrazione delle cellule T CAR in combinazione con irradiazione cerebrale totale e temozolomide. Questa somministrazione viene utilizzata per verificare se il condizionamento dell'ospite mediante la terapia standard migliora l'efficacia di una piattaforma di terapia cellulare adottiva. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunoterapia dei tumori cerebrali, come l'efficacia antitumorale di nuove immunoterapie nel contesto della terapia standard per i gliomi di alto grado.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'efficacia delle cellule T e delle mi modificate a livello genico contro i gliomi di alto grado, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la valutazione della terapia con cellule T contro modelli tumorali di melanoma, polmone e altre metastasi cerebrali. In generale, le persone nuove a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché questa procedura richiede l'esecuzione simultanea di diverse fasi.Pertanto, pianificare e organizzare le attività è fondamentale. A dimostrare la procedura saranno Catherine Uni e Carter s Deva, entrambi brillanti studenti laureati del mio laboratorio. Dopo aver preparato tre milligrammi per millilitro di temozolomide o TMZ in DMSO, collocare la soluzione in un becher d'acqua su una piastra riscaldante a 65 gradi Celsius per 10-15 minuti.Una volta che il TMZ si è completamente disciolto, la soluzione dovrà assumere un colore giallo pallido. Riempire completamente 15 siringhe da un millilitro con la soluzione di TMZ. Il TMZ deve essere somministrato entro 90 minuti dalla preparazione per garantire che nessun precipitato di TMZ si formi in soluzione; attivare l'alimentazione per l'irradiazione cerebrale totale sull'irradiatore a raggi X e lasciarlo riscaldare, assicurarsi che il filtro appropriato sia posizionato e impostare i valori corretti di tensione e corrente.Dopo aver sedato i topi secondo il protocollo indicato, posizionare i topi sedati sulla griglia con la testa nell'area che riceve l'intensità massima di raggi X. Utilizzare tubi di piombo per schermare i corpi a partire dal collo al fine di bloccare l'esposizione sistemica ai raggi X. Collocare i topi all'interno dell'apparecchio a raggi X al termine dell'erogazione.Rimuovere gli animali dall'irradiatore. Quando gli animali riprendono una coscienza sufficiente e mantengono una posizione sterno-abdominale, riposizionarli nei rispettivi contenitori. Dopo aver preparato il mezzo D 10 e aver raccolto le cellule HEC 2 93 T secondo il protocollo descritto nel testo, aggiungere un millilitro di sospensione cellulare a una concentrazione di 7,5 × 10⁶ cellule per millilitro in ciascuna delle piastre da 10 cm rivestite con poli-L-lisina, contenenti 10 millilitri di mezzo D 10, e incubare durante la notte; il giorno seguente proseguire come indicato.Dopo aver preparato il plasmide carico e il reagente per la trasfezione come indicato nel protocollo testuale, aggiungere a gocce il complesso lipidi-DNA alle cellule T HEC 293 e incubare per sei-otto ore. Successivamente, sostituire il mezzo con 12 millilitri di mezzo fresco per cellule T o TCM. Poi, versare una milza su un filtro cellulare da 70 micrometri e disgregare utilizzando l'estremità smussata della parte interna di una siringa da cinque millilitri per ottenere una sospensione monocellulare.Dopo aver preparato una soluzione fresca di TCM, trasferire la milza dissociata in un tubo conico da 50 millilitri contenente TCM e centrifugare per ottenere il pellet cellulare. Eliminare le cellule eritrocitiche utilizzando cinque millilitri di buffer di lisi 1x per milza, risospendendo le cellule con un'accurata pipettatura su e giù. Collocare la sospensione cellulare in un bagno a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere la reazione di lisi dal bagno a ultrasuoni e aggiungere TCM in rapporto uno a uno rispetto al buffer di lisi per neutralizzare la reazione; quindi eseguire un lavaggio centrifugando a 300 G per 10 minuti.Dopo aver aspirato il soprannatante, utilizzare due millilitri per milza di TCM per risospendere il pellet. Per contare le cellule, aggiungere 10 microlitri di sospensione cellulare a 190 microlitri di trian blu. Una volta calcolato il numero totale di cellule, utilizzare TCM integrato con due microgrammi per millilitro di con A e 50 unità internazionali per millilitro di interleuchina umana ricombinante due per diluire le cellule fino a una concentrazione di due per 10 alla sesta cellule per millilitro. Aggiungere due millilitri, ovvero quattro per 10 alla sesta cellule, in ciascun pozzetto di una piastra per colture cellulari trattata da 24 pozzetti e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica il giorno successivo alla splenectomia.Preparare PBS contenente 25 microgrammi per millilitro di frammento ricombinante di fibronectina umana o RHFF e ricoprire piastre da 24 pozzetti non trattate per colture cellulari aggiungendo 0,5 millilitri della soluzione in ogni pozzetto il giorno successivo. Rimuovere la soluzione dai pozzetti e aggiungere un millilitro per pozzetto di BSA al 2% in PBS, quindi incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.Quindi rimuovere l'BSA capovolgendo con decisione la piastra prima di aggiungere due millilitri di PBS per il lavaggio. Dopo aver raccolto il sopranatante virale dalle cellule HEC 2 93 T, aggiungere TCM fresco fino a un volume finale in millilitri pari al numero di pozzetti rivestiti con RHFF, più ulteriori tre millilitri. Rimuovere le citochine spleniche coltivate dall'incubatore e risospendere pipettando delicatamente su e giù da due a tre volte in ciascuno.Trasferire le sospensioni cellulari in un tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, risospendere le cellule nel supernatante virale a una concentrazione di 1 × 10⁶ cellule per millilitro. Quindi aggiungere un millilitro per pozzetto della sospensione cellulare nei pozzetti delle piastre rivestite con RHFF.Ora centrifugare le piastre per 90 minuti a 32 gradi Celsius e 770 GS con un'accelerazione di quattro e una frenata impostata a zero durante la centrifugazione. Preparare 50 unità internazionali per millilitro di IL-2 umana ricombinante in TCM. Dopo la centrifugazione, aggiungere un millilitro di mezzo in ogni pozzetto delle piastre e incubare tutta la notte.Se le cellule T raggiungono una confluenza superiore all'80%, suddividere le cellule pipettando delicatamente su e gi&ugrave; due o tre volte in ciascun pozzetto. Successivamente, trasferire un millilitro da ogni pozzetto in nuovi pozzetti di una piastra fresca da 24 pozzetti trattata per coltura di tessuti. Aggiungere un millilitro di TCM fresco contenente 50 unit&agrave; internazionali per millilitro di IL-2 in ciascun pozzetto; se le cellule non raggiungono una confluenza superiore all'80%, sostituire met&agrave; del mezzo pipettando lentamente via un millilitro di mezzo dalla superficie superiore di ciascun pozzetto e sostituendolo con un millilitro di TCM fresco contenente 50 unit&agrave; internazionali per millilitro di IL-2 ricombinante umana. Risospendere le cellule T CAR pipettando delicatamente su e gi&ugrave; tre volte in ciascun pozzetto e trasferirle in un tubo da centrifuga da 250 millilitri.Centrifugare le cellule a 300 ×g per 10 minuti. Successivamente, aspirare completamente il soprannatante senza disturbare il pellet. Lavare le cellule con PBS, quindi contarle prima di un secondo lavaggio.Un rendimento tipico di cellule T CAR è di circa un milione di cellule per pozzetto con PBS Resus. Sospendere le cellule a una concentrazione di cinquanta milioni per millilitro per un'iniezione di dieci milioni in un volume di 200 microlitri da iniettare in topi portatori di tumore; utilizzare un ago da 27 a 31 gauge per caricare da 500 a 1000 microlitri in una siringa per insulina, assicurandosi che tutte le bolle d'aria siano espulse. Le cellule T CAR sono state generate mediante trasduzione con il vettore retrovirale CAR E GFR V tre, che contiene le ripetizioni terminali lunghe del virus dello stem cell del ratto o MSCV.La regione gag estesa, il sito di splicing dell'involucro e un segnale di impacchettamento virale. Il costrutto EG FFR V tre car contenente il frammento variabile a catena singola umano anti-EEG FRV tre 1 39 è stato clonato nel vettore retrovirale in tandem con le regioni intracellulari di CD otto murino, tm CD 28 4 1 BBB e CD tre zeta. Dopo la trasduzione, le cellule T CAR EG FFR V tre possono essere quantificate e fenotipizzate mediante citometria a flusso con un pannello a due colori composto da STRT bico rina coniugata con biotina, multimero derivato da EG FFR V tre e anti-CD tre fit C. Utilizzando il protocollo descritto in questo video, l'espressione del CAR è regolarmente osservata nel 55-70% delle cellule T murine positive per CD tre.Le cellule T con recettore chimerico (CAR T) possono essere ulteriormente fenotipizzate aggiungendo altri anticorpi marcati con fluorocromi al pannello CAR a due colori, come mostrato in questo esempio: la colorazione per CD8 e CD4 mostra che il 70% delle cellule CAR trasdotte sono linfociti T positivi per CD8, mentre il 20% sono linfociti T positivi per CD4. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in 12 ore distribuite nell'arco di una settimana, se effettuata correttamente seguendo questa procedura. Altri metodi, come ELISA, ELISPOT e/o la colorazione per citochine intracellulari, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande.Ad esempio, le cellule T trasdotte con un recettore chimerico per l'antigene rispondono funzionalmente al riconoscimento dell'antigene e la loro funzionalità è specifica per l'antigene? Non dimenticare che lavorare con retrovirus, temozolomide e radiazioni X può essere estremamente pericoloso e richiede precauzioni come operare in condizioni BSL. Due, indossare dispositivi di protezione individuale, eseguire gli esperimenti nelle aree designate e ottenere un'adeguata formazione per la manipolazione degli animali.E l'uso di apparecchiature a raggi X dovrebbe sempre essere adottato durante l'esecuzione di queste procedure.

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Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra una tecnica per la generazione ex vivo di cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) antigene specifico del tumore. I vettori retrovirali che trasportano RNA transgenico vengono mescolati con le cellule della milza in un terreno integrato con interleuchina-2 per promuovere la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule T. La miscela viene quindi trasferita su una piastra rivestita con frammenti di fibronectina umana ricombinante e centrifugata per facilitare...

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