Name: Experimental Glaucoma indotta da iniezione oculare di microsfere magnetiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Scopri come indurre glaucoma sperimentale nei ratti mediante iniezione di microsfere magnetiche nella camera anteriore dell'occhio. Questo metodo consente di studiare l'innalzamento sostenuto della pressione intraoculare e la morte dei neuroni retinici.

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Desideriamo ringraziare Peter Munro PhD per la sua assistenza con il sezionamento del nervo ottico. Questo studio è stato sostenuto dal Medical Research Council (G0901303) e in parte dal Dorothy Hodgkin Postgraduate Award/Medical Research Council, dall'Helen Hamlyn Trust, da Fight for Sight e dalla fiduciaria speciale di Moorfields.

Etica dichiarazione: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC), e sono stati approvati in accordo con le linee guida Regno Unito home office ( <a href="http://goo.gl/FLkirW" target="_blank">http://goo.gl/FLkirW</a> , ultimo accesso il 10 giugno , 2014) e la Dichiarazione ARVO per l&#39;uso di animali in Oftalmica e Vision Research ( <a href="http://goo.gl/4LFOjD" target="_blank">http://goo.gl/4LFOjD</a> , ultimo accesso il 10 giugno 2014). 1. ipertensione oculare Induzione <ol><li> Indurre glaucoma sperimentale elevando la pressione intraoculare (IOP) tramite iniezione unilaterale di microsfere paramagnetici nella camera anteriore di Brown Norvegia ratti, basata sul metodo di Samsel et al. 3 Altri ratti pigmentati possono essere adatti, anche se questi dovrebbero essere convalidata primo dall&#39;utente. </li><li> Casa 250-300 g femminileex-allevatore Brown Norvegia ratti in un ambiente di scarsa illuminazione costante (40-60 lux) per ridurre al minimo le fluttuazioni diurne in IOP 7, con l&#39;accesso a cibo e acqua ad libitum. </li><li> Prendere le misure IOP di base in animali svegli 8 prima anestesia e iniezione tallone, utilizzando un tonometro rimbalzo tarato per l&#39;uso negli occhi di ratto 9. IOP è preso come media di cinque letture. </li><li> Anaesthetize ratti con 37,5 mg / kg di ketamina, e 0,25 mg / kg medetomidina cloridrato consegnato per via intraperitoneale. Confermare profondità dell&#39;anestesia testando i riflessi del piede posteriore dell&#39;animale, prima dell&#39;applicazione di iodio povidone (vedi punto 1.5), e l&#39;iniezione tallone (vedi punto 1.8). Amministrare 0.5% proparacaina cloridrato per l&#39;analgesia. NOTA: Non dilatare la pupilla, in ogni fase. Questo aiuterà le perline per stabilirsi meglio nel dell&#39;angolo iridocorneale, e prevenire vincolante alla lente. Applicare pomata oculare contro l&#39;essiccamento della cornea su un-operato occhio controlaterale. </li><li> Wcenere l&#39;occhio operativa con 5% povidone iodio in acqua 10 5 min prima dell&#39;iniezione. </li><li> Dopo 5 minuti, stoppino lo iodio povidone off con garza sterile, e lavare l&#39;occhio con soluzione salina sterile allo 0,9%. Mantenere l&#39;occhio umido durante l&#39;anestesia con l&#39;applicazione regolare di soluzione salina sterile. </li><li> Posizionare un magnete toroidale intorno all&#39;occhio. </li><li> Iniettare 25 ml di una soluzione contenente 30 mg / ml di gamma-irradiazione sterilizzato 8 micron microsfere magnetiche in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) nella camera anteriore, utilizzando un ago smussato 33 G. <ol><li> Per preparare perline, lavare da ri-sospensione, poi centrifugazione 3 volte a 10.000 xg per 5 minuti con 1 ml HBSS, prima di fare la 30 mg / ml soluzione definitiva. Mantenere condizioni di sterilità in tutto. </li><li> Per l&#39;iniezione, fare attenzione ad evitare di inserire l&#39;ago l&#39;iride, per ridurre al minimo il rischio di traumi iris. Ciò può essere evitato orientando l&#39;ago tangente alla superficie corneale, come paralleladell&#39;iride possibile. Questo aiuterà anche a ridurre al minimo la perdita di tallone dal sito di iniezione. NOTA: Iniettare perle a un ritmo rapido per garantire una distribuzione uniforme intorno all&#39;angolo iridocorneale, che è fondamentale per aumentare IOP. Inoltre, negozio perline, aghi e anelli magnetici separatamente in modo che le perle non formano i cluster, che li rende difficili da caricare nella siringa e iniettare, e l&#39;ago non diventa magnetizzato. </li></ol></li><li> Lasciare l&#39;ago in posizione per 1 minuto dopo l&#39;iniezione al fine di garantire che le microsfere sistemazione in angolo iridocorneale impedire il drenaggio acquosa dal trabecolato. Leggermente angolo l&#39;ago dopo le perline hanno inizialmente risolto per consentire alcune perdite di acquosa, per ridurre al minimo aumenti transitori IOP. Al termine dell&#39;intervento lavare l&#39;ago attraverso con il primo tampone fosfato salino (PBS), poi 70% di etanolo, seguita da acqua distillata, per garantire l&#39;uso continuato dell&#39;ago in procedure separate. In alternativa, si potrebbe utilizzareaghi monouso se la combinazione calibro e la siringa corretta è disponibile. Optional: aghi possono essere affilano con una beveller per prolungare il loro utilizzo. </li><li> A questo punto, se necessario, rimuovere il magnete, e usarlo per disegnare perle in aree di copertura incompleta. </li><li> Lasciare il magnete in posizione intorno all&#39;occhio per altri 10 min dopo l&#39;iniezione per assicurare perline stabilirsi bene nel dell&#39;angolo iridocorneale. </li><li> Anestesia Reverse con 0,25 mg / kg atipemezole cloridrato. </li><li> Amministrare cloramfenicolo, o altro pomata antibiotica, per esempio gentamicina o terramycin topica per prevenire l&#39;infezione, e lo 0,5% proparacaina cloridrato per l&#39;analgesia. Lasciare gli animali a recuperare su una stuoia di calore fino a ritrovare il movimento, poi il trasferimento ad una scatola caldo e fornitura con alimentazione supplementare, come un integratore alimentare o dieta regolare inumidito fino al recupero è completo. Analgesia sistemica o locale deve essere somministrato agli animali che presentano segni di dolore 24 ore dopo l&#39;intervento chirurgico. Se These sintomi persistono nonostante il trattamento, gli animali devono essere abbattuti in modo umano. </li><li> Utilizzare l&#39;occhio controlaterale come controllo non operato. </li><li> Prendere le misure IOP ogni 2-3 giorni dopo la somministrazione tallone, e ogni 2-3 giorni successivi con un tonometro rimbalzo tarato per l&#39;uso negli occhi di ratto 9. </li><li> I criteri per l&#39;inclusione occhi a studi possono essere: se 1) la IOP è elevata al di sopra della pressione di controllo controlaterale di 5 mmHg, e 2) non superiore a 60 mmHg. </li><li> Occhi dove la pressione torna a basale (di solito da 1 settimana dopo l&#39;iniezione) non devono essere inclusi negli studi, tuttavia è possibile re-iniettare perline in occhi che non riescono a sviluppare l&#39;alta pressione intraoculare, se desiderato. </li><li> Euthanize animali di CO 2 asfissia alla fine dell&#39;esperimento. </li><li> Sezionare occhi e nervi ottici, e fissare nel 4% paraformaldeide (PFA) durante la notte per ulteriori analisi istologica. </li></ol> 2. Valutare danni alla retina Neuron Uso TUNEL STaining <ol><li> Per quantificare cellule apoptotiche in tutto il monte retinasuse test deossinucleotidil terminale transferasi-mediata dUTP nick-etichettatura (TUNEL), secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Sezionare la retina dalla oculare, lavare per 3 x 5 min in 0,3% Triton X-100 in tampone fosfato (PBS-T). </li><li> Permeabilize il tessuto in 3% T-PBS per 2 ore. </li><li> Pre-equilibrare retine in Equilibration tampone per 10 minuti, prima di incubazione in soluzione di reazione TUNEL per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Lavare il tessuto da 3 x 5 min a 0,3% T-PBS, sciacquare in 0.3% T-PBS contenente 5 micron DAPI, e TV a montare in supporti di montaggio. </li><li> Per quantificare TUNEL nuclei positivi utilizzano un microscopio confocale a prendere 10 micron z-stack attraverso lo strato di cellule gangliari a 20X di ingrandimento. Prendere 3 immagini su ciascuno dei 4 petali, in siti vicino al nervo ottico, in media periferia, e alla periferia lontano della retina, dando un totale di 12 immagini per tutta mount, il campionamento di circa 7.000 cellule. Criteri morfologici discriminati cellule non neuronali (endoteliale e gliali) dalle cellule neuronali. </li><li> Selezionare le aree per l&#39;imaging utilizzando solo il canale DAPI, e gli investigatori maschera di gruppi di trattamento. </li></ol> 3. Valutare danno del nervo ottico Utilizzando Toluidine Blu colorazione <ol><li> Fissare nervi ottici durante la notte in soluzione di Karnovsky a 4 ° C. </li><li> Trattare campioni per 2 ore a 1% (w / v) di osmio tetrossido e poi disidratato in 100% di etanolo. </li><li> Incubare nervi ottici in ossido di propilene per 30 min, e posizionare in una miscela 50:50 di ossido di propilene: overnight araldite. </li><li> Cambiare questa soluzione a 100% araldite, seguita da incubazione per una notte a 60 ° C. </li><li> Cut semisottile sezioni (0,75 millimetri di spessore) e macchia con l&#39;1% di toluidina blu / di borace (TB) in etanolo al 50% prima di esame al microscopio ottico. </li></ol> 4. Analisi statistica <ol><li> Eseguire ana statistichelisa utilizzando un apposito software di statistiche. Un ANOVA a due vie con test post-hoc di Newman-Keul può essere utilizzata per calcolare la significatività statistica per IOP cambia nel tempo. </li><li> Un valore p inferiore a 0,05 può essere considerato significativo. </li></ol>

<ol><li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li>
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<li>Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+and+sensitivity+of+the+TonoLab+rebound+tonometer+in+awake+Brown+Norway+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).</li>
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<li>Isenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+application+of+povidone-iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Eye+Health%22%5BJournal%5D)">The ocular application of povidone-iodine.</a> Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).</li>
<li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).</li>
<li>Foxton, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+is+necessary+and+sufficient+for+retinal+neuroprotection+in+models+of+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma.</a> Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).</li>
</ol>

David T. Shima è un dipendente di Hofmann-La Roche, Svizzera. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui mostriamo un metodo per indurre elevata IOP nel ratto, iniettando microsfere magnetiche nella camera anteriore dell&#39;occhio. Questo metodo è semplice da portare a termine, e richiede poca perizia chirurgica, o ore di pratica e raffinatezza. Inoltre, il procedimento è efficace; raramente richiede più di una singola iniezione di perline di indurre una forte, robusto aumento della pressione (circa il 10% tasso di reiniezione). Questo può fornire un vantaggio rispetto ai metodi inducibili esistenti, come la vena episceral tecnicamente impegnativo sclerosi 11 modelli, o laser protocollo fotocoagulazione 6, che può richiedere più procedure da mantenere sollevate IOP. Affinché il metodo per avere successo tuttavia, ci sono alcuni piccoli passi critici che devono essere prese. In primo luogo, è utile utilizzare un magnete a forma toroidale per disegnare perline in angolazione iridocorneale. Questo passo è una modifica del protocollo originale, where le perline sono state iniettate nella camera anteriore, e poi spostati a mano libera intorno all&#39;occhio 3. Utilizzando un magnete toroidale significa che microsfere dovrebbero risolvere in modo uniforme in tutto l&#39;angolo, richiedendo il minimo redistribuzione manuale. In secondo luogo, il tasso di iniezione deve essere veloce - troppo lento e le perline si accumula prevalentemente su un lato dell&#39;angolo, con conseguente copertura incompleta e potenzialmente nessun aumento di pressione. In generale però, il metodo è abbastanza semplice che l&#39;utente potrebbe facilmente apportare modifiche al protocollo, ad esempio variando la dimensione o volume delle particelle di microsfere, forse per tentare di alterare il grado di elevazione IOP. Tuttavia, uno svantaggio potenziale del metodo è che si ha poco controllo sulla misura della ipertensione, che in circa 5-10% dei casi osservati salito sopra 60 mmHg. Aumenti eccessivi di IOP può essere molto distruttivo per tessuto retinico, e può rendere lo studio dei meccanismi e biologia di morte cellulare sfidare. Tuttavia, il metodo produce una patologia neuronale consistente, sia nella retina e nervo ottico, che può essere manipolato farmacologicamente 12. Questo può rendere il modello interessante per lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento del glaucoma. Inoltre, poiché le perle sono diretti in angolo iridocorneale, questo lascia l&#39;asse visivo gratuito per l&#39;imaging dal vivo del disco retina o ottico. Prevediamo che questo modello sarà adattato e utilizzato per applicazioni future in altre specie, tra cui mouse.

Glaucoma primario è una malattia degli occhi devastante che colpisce circa 60,5 milioni di persone in tutto il mondo 1, che può portare alla perdita della vista vita che alterano e cecità 2. La ricerca sui meccanismi della malattia, e lo sviluppo di nuove terapie per il glaucoma, dipendono buoni modelli della malattia che ricapitolano alcune delle caratteristiche della patologia. Presentiamo qui un modello di ratto glaucoma basato sul metodo di Samsel et al. 3 L&#39;obiettivo generale di questa tecnica è quello di aumentare la pressione intraoculare (IOP) nell&#39;occhio iniettando microsfere magnetiche nella camera anteriore, e utilizzando un anello magnetico, diretta li in angolo iridocorneale. Questo impedisce deflusso acquosa, che aumenta IOP, con conseguente danno neuronale e perdita di cellule. Il protocollo è stato sviluppato per tentare di fornire un semplice modello inducibile del glaucoma. Questo protocollo può avere alcuni vantaggirispetto alle tecniche esistenti. Modelli genetici come topi DBA / 2J sono disponibili, che non richiedono procedure di avvio; tuttavia questi possono avere un esordio imprevedibile di progressione della malattia 4. Al contrario, i modelli inducibili, molti dei quali si basano su chirurgicamente elevando IOP nei roditori, hanno il vantaggio che l&#39;iniziazione può essere controllata dall&#39;utilizzatore. Alcuni di questi metodi possono avere inconvenienti della loro tuttavia, compreso tecnicamente impegnativo 5, e possono richiedere più procedure per mantenere elevata IOP 6. Al contrario, il metodo inducibile descritto in questo manoscritto è una tecnica semplice, efficace e riproducibile che produce stabili, robusti aumenti di pressione, con minima necessità di reiniezione. Inoltre, esso non comporta attrezzature costose, e richiede solo abilità chirurgiche di base per eseguire. Questo protocollo può essere appropriato per i lettori che stanno cercando di creare una inducibile tecnicamente meno impegnativaModello glaucoma nel loro laboratorio.

<table><tbody><tr><td>250 - 300 g femmina Brown Norway ex-breeder ratti</td><td>Harlan UK</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Tonolab Rebound Tonometer</td><td>Tiolat</td><td>TV02</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (ketamina)</td><td>Fort Dodge Salute degli animali</td><td>BN1000118</td><td>37,5 mg/kg</td></tr><tr><td>Domitor (medetomidina cloridrato)</td><td>Orion Pharma</td><td>140-999</td><td>0,25 mg/kg</td></tr><tr><td>Iodio povidone</td><td>Ecolab</td><td>BN4369LE10</td><td>5% in H2O</td></tr><tr><td>Soluzione salina minima</td><td>Bausch e Lomb</td><td>PL00033/5017</td><td></td></tr><tr><td>Magnete toroidale</td><td>Supermagnete</td><td>R-10-07-03-N</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere magnetiche</td><td>Bangs Laboratories</td><td>UMC4N/9692</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>33 G ago smussato</td><td>Hamilton</td><td>7747-01</td><td></td></tr><tr><td>Siringa con punta Luer</td> con ago personalizzato <td>Hamilton</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan (atipemezolo cloridrato)</td> <td>Orion Pharma</td><td>141-003</td><td>0,25 mg / kg</td></tr><tr><td>Unguento al cloramfenicolo</td><td>Medicom</td><td>18956-0005</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione TUNEL</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield supporti di montaggio</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

experimental glaucoma indotta da iniezione oculare di microsfere magnetiche

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

Il progresso nella comprensione della fisiopatologia e nella fornitura di nuovi trattamenti per il glaucoma dipende da buoni modelli animali della malattia. Presentiamo qui un protocollo per l'aumento della pressione intraoculare (IOP) nel ratto, iniettando microsfere magnetiche nella camera anteriore dell'occhio. L'uso di particelle magnetiche consente all'utente di manipolare le perle nell'angolo iridocorneale, fornendo così un blocco molto efficace del deflusso del fluido dalla rete trabecolare. Ciò porta a un aumento duraturo della IOP e, infine, alla morte neuronale nello strato di cellule gangliari (GCL), nonché alla patologia del nervo ottico, come osservato nei pazienti con la malattia. Questo metodo è semplice da eseguire, in quanto non richiede macchinari, competenze chirurgiche specialistiche o molte ore di pratica per essere perfezionato. Inoltre, gli aumenti di pressione sono molto robusti e di solito non è richiesta la reiniezione delle microsfere magnetiche, a differenza di altri modelli che utilizzano perline di plastica. Inoltre, riteniamo che questo metodo sia adatto per l'adattamento all'occhio del topo.

Iniezione di perline magnetiche nel angolo iridocorneale costantemente indotto un aumento prolungato e robusto in pressione (figura 1), che era facilmente osservabile al primo punto temporale, 3 giorni dopo l&#39;iniezione. Inoltre, l&#39;aumento della pressione è stata mantenuta per tutta la durata dell&#39;esperimento, e sebbene il nostro corso tempo finito a 18 giorni dopo l&#39;iniezione, altri hanno riportato che la pressione persiste a lungo termine 3. La media IOP media sulla lunghezza della esperimento di controllo, occhi non-bead-iniettati era 19,7 ± 0,3 mmHg, rispetto a 40,5 ± 2,8 mmHg per occhi branello-iniettato (P &lt;0.001). Inoltre, picco IOP è aumentato da 22.8 ± 0.3 mmHg a 49,9 ± 2,3 mmHg. Per determinare se l&#39;elevazione della PIO porta alla morte delle cellule gangliari retiniche, abbiamo effettuato TUNEL sulla retina, e istologia su sezioni trasversali del nervo ottico (Figura 2). In retina<html> abbiamo osservato un aumento della colorazione TUNEL (Figura 2A) in occhi tallone-iniettata con elevata pressione intraoculare. Il numero di nuclei apoptotici aumentato di circa 15 volte, da 1,6 ± 0,5 cellule nei controlli controlaterali, a 24,5 ± 0,5 cellule retine ipertesi (Figura 2B; P &lt;0.05). Inoltre, negli occhi in cui biglie magnetiche sono state iniettate ma pressione non è aumentato (probabilmente a causa del blocco incompleta dell&#39;angolo iridocorneale), il numero di cellule TUNEL-positivi non erano significativamente differenti da quelli dei controlli uninjected (P&gt; 0,05). Questo suggerisce che la morte cellulare era legato a pressione aumenta, non causa tossicità diretta delle microsfere magnetiche. Infine, abbiamo studiato la patologia del nervo ottico nel modello glaucoma, e visto accumulo di blu di toluidina in molti degli assoni, indicando la degenerazione di questi processi cellulari (Figura 2C). ure 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52400 / 52400fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. aumento della pressione intraoculare con microsfere magnetiche. Iniezione di microsfere magnetiche nella camera anteriore indotto un robusto, significativo aumento della pressione intraoculare (IOP) in confronto al controllo controlaterale, occhi non iniettati. Unità asse Y = millimetri di mercurio (mmHg). Dati = media ± SEM. * = P &lt;0.001; N = 12. Questo dato è stato modificato da Foxton et al, Am.. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52400/52400fig2highres.jpg" /> Figura 2. Elevazione della IOP tramite iniezione di microsfere magnetiche in angolo iridocorneale, indotta morte neuronale nello strato di cellule gangliari (GCL). (A) Immagini rappresentative della retine di controllo (a sinistra) e glaucoma (a destra) gli occhi macchiati di nuclei apoptotici da TUNEL (verde;frecce bianche) e DAPI (blu), che indica il numero di nuclei apoptotici aumentato rosa IOP. (B) Quantificazione delle cellule positive TUNEL in GCL, mostrando che gli occhi con elevata IOP (al centro), avevano cellule significativamente più apoptotici rispetto a (a sinistra). Al contrario, negli occhi perline-iniettata in cui la pressione non ha aumento (a destra), è stato osservato alcun aumento significativo TUNEL colorazione. Dati = media ± SEM. * = P &lt;0.05; N = 7 - 8 (C) Immagini rappresentative della colorazione ottico nervo, dimostrando un aumento toluidina blu accumulo (frecce nere) in assoni danneggiati da glaucoma (a destra), ma non il controllo occhi (a sinistra).. Bar scale = 50 micron. Questa cifra è stata modificata da Foxton et al., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

Presentiamo un metodo per indurre un'elevata pressione intraoculare (IOP), iniettando microsfere magnetiche nell'occhio del ratto, per modellare il glaucoma. Ciò porta a forti aumenti di pressione e a un'estesa morte neuronale. Questo protocollo è facile da eseguire, non richiede iniezioni ripetute e produce aumenti IOP stabili e duraturi.

Experimental Glaucoma indotta da iniezione oculare di microsfere magnetiche

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

Lo scopo di questa procedura è indurre un aumento della pressione intraoculare nel ratto mediante iniezione di microsfere paramagnetiche nella camera anteriore dell'occhio. Posizionare innanzitutto un anello magnetico attorno all'occhio di un animale anestetizzato, lavare le microsfere magnetiche, risospendere in soluzione e quindi caricarle in una siringa. Successivamente, iniettare le microsfere magnetiche nella camera anteriore dell'occhio.Rimuovere l'anello magnetico durante il recupero. I dati ottenuti da analisi istologiche come la colorazione TUNEL o la colorazione del nervo ottico possono misurare la morte delle cellule gangliari retiniche causata dall'aumento della pressione intraoculare. Lavare tre volte le microsfere magnetiche sterili di otto micron in un millilitro di soluzione salina tamponata di Hank mediante risospensione e centrifugazione a 10.000 ×g per cinque minuti.Quindi ri-sospendere in 0,5 millilitri di HBSS per ottenere una soluzione di 30 milligrammi per millilitro. Ora, utilizzando un sonometro a rimbalzo calibrato per l'uso nell'occhio del ratto, effettuare cinque misurazioni basali della pressione intraoculare negli animali svegli. Dopo l'anestesia, applicare un unguento oftalmico sull'occhio controlaterale non trattato per mantenerlo umido.Durante l'anestesia, applicare cloridrato di proparcaina allo 0,5%, anestetico locale, sull'occhio operato. Successivamente, lavare questo occhio con iodopovidone al 5% in acqua. Dopo cinque minuti, rimuovere lo iodopovidone e lavare l'occhio con soluzione salina sterile allo 0,9%.Mantenere l'occhio umido durante l'anestesia applicando regolarmente soluzione salina sterile. Posizionare ora un magnete sterile attorno all'occhio per ridurre al minimo il rischio di trauma all'iride e limitare la perdita della perla. Orientare l'ago in modo tangenziale alla superficie corneale, il più parallelo possibile all'iride.Procedere con l'iniezione di 25 microlitri di microsfere magnetiche irradiate con raggi gamma a una concentrazione di 30 milligrammi per millilitro nella camera anteriore. Lasciare l'ago in posizione per un minuto dopo l'iniezione per assicurare che le perle si depositino nell'angolo corneale IOC, ostacolando il drenaggio dell'umore acqueo dalla trama trabecolare. Dopo che le perle si sono inizialmente depositate, inclinare leggermente l'ago per alcuni secondi per consentire una lieve fuoriuscita dell'umore acqueo e ridurre al minimo gli aumenti transitori della pressione intraoculare.Per garantire l'uso continuato dell'ago in procedure separate, sciacquare l'ago con PBS. Successivamente con etanolo al 70%, seguito da acqua distillata in questa fase. Se necessario, rimuovere il magnete e utilizzarlo per attrarre le perle in aree con copertura incompleta.Lasciare il magnete in posizione intorno all'occhio per ulteriori 10 minuti dopo l'iniezione, al fine di garantire che le perle si depositino correttamente nell'angolo iridocorneale. Rovesciare l'anestesia utilizzando 0,25 milligrammi per chilogrammo di cloridrato di ESOL.Somministrare 0,5 cloridrato di propano per analgesia e unguento di cloramfenicolo per via topica per prevenire infezioni. Lasciare gli animali riprendere sulla stuoia riscaldata fino al recupero del movimento. Successivamente trasferirli in una scatola calda.Utilizzare l'occhio controlaterale come controllo non trattato. Ripetere le misurazioni della pressione intraoculare ogni due o tre giorni dopo la somministrazione delle microsfere e ogni due o tre giorni successivamente; definire i criteri per l'inclusione degli occhi negli studi, inclusi i casi in cui la pressione intraoculare risulta superiore di cinque millimetri di mercurio rispetto alla pressione del controllo controlaterale e in cui la pressione intraoculare non supera i 60 millimetri di mercurio. Gli occhi in cui la pressione torna ai livelli basali entro una settimana dall'iniezione non devono essere inclusi negli studi. Tuttavia, se desiderato, è possibile re-iniettare microsfere negli occhi che non sviluppano un'elevata pressione intraoculare.Fissare gli occhi dissecati e il nervo ottico in paraformaldeide al 4%, valutando il danno ai neuroni retinici mediante colorazione TUNEL e il danno al nervo ottico mediante colorazione con blu di tosina. In questo esperimento, l'iniezione di microsfere magnetiche nell'angolo iridocorneale ha indotto in modo costante un aumento prolungato e marcato della pressione. Inoltre, l'aumento della pressione è stato mantenuto per tutta la durata dell'esperimento.L'IOP medio, calcolato sull'intera durata dell'esperimento, negli occhi di controllo non iniettati con microsfere era di 19,7 ± 0,3 millimetri di mercurio e di 40,5 ± 2,8 millimetri di mercurio negli occhi iniettati con microsfere. Inoltre, l'IOP massimo è aumentato da 22,8 ± 0,3 millimetri di mercurio a 49,9 ± 2,3 millimetri di mercurio per determinare se l'aumento dell'IOP porti alla morte delle cellule gangliari retiniche. È stata eseguita una colorazione TUNEL sulle retine e un'analisi istologica su sezioni trasversali del nervo ottico nella retina.Abbiamo osservato un aumento della colorazione TUNEL negli occhi iniettati con perle in presenza di IOP elevata. Il numero di nuclei apoptotici è aumentato di circa 15 volte rispetto alle retine ipertensive controlaterali, come previsto negli occhi in cui sono state iniettate perle magnetiche senza pressione; il numero di cellule positive al TUNEL non differiva significativamente da quello dei controlli non iniettati. Un'ulteriore analisi della patologia del nervo ottico nel modello di glaucoma ha mostrato l'accumulo di blu di otorina in molti assoni, indicando la degenerazione di questi processi cellulari.

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Questo video dimostra l'induzione del glaucoma in un ratto anestetizzato iniettando soluzione salina ipertonica nella vena episclerale. La soluzione salina entra nella rete trabecolare attraverso il canale di Schlemm, causando cicatrici tissutali, che bloccano il deflusso dell'umore acqueo e aumentano la pressione intraoculare. L'elevata pressione danneggia le cellule gangliari retiniche, portando al glaucoma.

Una tecnica di iniezione di soluzione salina ipertonica per indurre il glaucoma nei ratti

In questo video, un ratto anestetizzato viene sottoposto a una procedura oculare in cui le perle magnetiche vengono iniettate nella camera anteriore sotto un campo magnetico per bloccare l'angolo iridocorneale. Questo blocco ostruisce la rete trabecolare, impedendo il drenaggio dell'umore acqueo e portando ad un aumento della pressione intraoculare, danneggiando le cellule gangliari retiniche e il nervo ottico. Questo sviluppa una condizione simile al glaucoma.

Induzione sperimentale del glaucoma tramite ostruzione dell'angolo iridocorneale in un modello murino

Source: Bosco, A., et al. Dinamiche in vivo dell'attivazione microgliale retinica durante la neurodegenerazione: imaging oftalmoscopico confocale e morfometria cellulare nel glaucoma di topo. J. Vis. Exp. (2015) Questo video dimostra l'imaging in vivo della microglia retinica in un modello murino di glaucoma. Un topo transgenico con microglia retinica fluorescente che esprime proteine è posizionato sotto un oftalmoscopio. L'illuminazione a infrarossi viene utilizzata per localizzare la testa...

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Questo video illustra un metodo, utilizzando un clinico 3 scanner T, per contrasto-enhanced RM del mouse ingenua proiezione visiva e per studi ripetitivi e longitudinali in vivo di degenerazione del nervo ottico associati a lesioni acute ottico schiacciamento del nervo e la degenerazione del nervo ottico cronica topi knock-out (p50 KO).

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Un magnetica microperla occlusione modello per indurre ipertensione oculare-Dependent Glaucoma nei topi

Il glaucoma è caratterizzato da danni alle cellule gangliari retiniche. L'induzione del glaucoma in modelli animali può fornire informazioni sullo studio di questa malattia. Qui, descriviamo una procedura che induce la perdita di RGC in un modello di ratto in vivo e dimostra la preparazione di retine a montaggio intero per l'analisi.

Glaucoma inducono Procedura in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello di ratto e tutto il montaggio Retina Preparazione

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Un modello del Glaucoma indotto da sutura Circumlimbal nei ratti e nei topi

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Un modello di ipertensione oculare indotta da olio di silicone reversibile nei topi

L'obiettivo di questo protocollo è quello di caratterizzare un nuovo modello di neurodegenerazione glaucomatosa basato sulla cauterizzazione termica a 360° del plesso vascolare limbare, inducendo ipertensione oculare subacuta.

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Experimental Glaucoma indotta da iniezione oculare di microsfere magnetiche

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