Experimental Glaucoma indotta da iniezione oculare di microsfere magnetiche
2 febbraio 2015
Presentiamo un metodo per indurre un'elevata pressione intraoculare (IOP), iniettando microsfere magnetiche nell'occhio del ratto, per modellare il glaucoma. Ciò porta a forti aumenti di pressione e a un'estesa morte neuronale. Questo protocollo è facile da eseguire, non richiede iniezioni ripetute e produce aumenti IOP stabili e duraturi.
L'obiettivo di questa procedura è indurre un'elevata pressione intraoculare nel ratto utilizzando l'iniezione di microsfere paramagnetiche nella camera anteriore dell'occhio. Per prima cosa posizionare un anello magnetico attorno all'occhio di un animale anestetizzato, lavare le microsfere magnetiche, risospenderle in soluzione e quindi caricarle in una siringa. Quindi, iniettare le microsfere magnetiche nella camera anteriore dell'occhio.
Rimuovere l'anello magnetico durante il recupero. I dati di processo ottenuti da analisi istologiche come la colorazione del tunnel o del nervo ottico possono misurare la morte delle cellule gangliari retiniche che deriva dall'aumento della pressione intraoculare. Lavare tre volte le microsfere magnetiche sterilizzate da otto micron in un millilitro di soluzione salina tamponata di matassa mediante reus, sospendendo e centrifugando a 10.000 volte G per cinque minuti.
Quindi sospendere in 0,5 millilitri di HBSS per una soluzione di 30 milligrammi per millilitro. Ora, utilizzando un ecometro a rimbalzo calibrato per l'uso nell'occhio del ratto, eseguire cinque misurazioni IOP di base negli animali svegli. Dopo l'anestesia, i ratti applicano un unguento oculare sull'occhio controlaterale non classificato per mantenerlo umido.
Durante l'anestesia applicare lo 0,5% di propano cloridrato, anestetico locale all'occhio operatorio. Quindi, lava questo occhio con il 5% di iodio povidone in acqua. Dopo cinque minuti, eliminare lo iodio povidone e lavare l'occhio con una soluzione salina sterile allo 0,9%.
Mantenere l'occhio umido durante l'anestesia con l'applicazione regolare di soluzione fisiologica sterile. Ora posiziona un magnete steroideo intorno all'occhio per ridurre al minimo il rischio di traumi dell'iride e ridurre al minimo la perdita di perline. Orientare l'ago tangenzialmente alla superficie corneale il più parallelamente possibile all'iride.
Procedere all'iniezione di 25 microlitri da 30 milligrammi per millilitro, microsfere magnetiche irradiate con raggi gamma nella camera anteriore. Lasciare l'ago in posizione per un minuto dopo l'iniezione per assicurarsi che le perle si depositino nell'angolo corneale IOC per impedire il drenaggio acquoso dalla rete trabecolare. Lavorare leggermente inclinando l'ago alcuni secondi dopo che le perle si sono inizialmente depositate per consentire una certa fuoriuscita di acqua e per ridurre al minimo gli aumenti transitori della pressione intraoculare.
Per garantire l'uso continuato dell'ago in procedure separate, sciacquare l'ago con PBS. Quindi etanolo al 70%, seguito da acqua distillata in questa fase. Se necessario, rimuovere il magnete e utilizzarlo per disegnare le perline nelle aree di copertura incompleta.
Lasciare il magnete in posizione intorno all'occhio per altri 10 minuti dopo l'iniezione. Per garantire che le perle si depositino bene nell'angolo corneale iride. Anestesia inversa utilizzando 0,25 milligrammi per chilogrammo di ESOL cloridrato.
Somministrare 0,5 propano cloridrato per analgesia e unguento al cloramfenicolo per via topica per prevenire l'infezione. Lascia che gli animali si riprendano su un tappetino termico fino a quando non riacquistano il movimento. Quindi trasferire in una scatola calda.
Utilizzare l'occhio controlaterale come controllo non classificato. Ripetere le misurazioni della IOP ogni due o tre giorni dopo la somministrazione delle perle e successivamente ogni due o tre giorni, definire i criteri per includere gli occhi negli studi, incluso la IOP è elevata al di sopra della pressione di controllo controlaterale di cinque millimetri di mercurio e la IOP non supera i 60 millimetri di occhi di mercurio in cui la pressione ritorna al basale entro una settimana dopo l'iniezione non dovrebbe essere inclusa negli studi. Tuttavia, se lo si desidera, è possibile reiniettare le perline negli occhi che non riescono a sviluppare una IOP elevata.
Fissare gli occhi sezionati e il nervo ottico con paraldeide al 4%, valutando il danno ai neuroni retinici mediante colorazione del tunnel e il danno al nervo ottico mediante blu di toine. Macchiatura. In questo esperimento, l'iniezione di perline magnetiche nell'angolo corneale iride ha costantemente indotto un aumento prolungato e robusto della pressione. Inoltre, l'aumento della pressione è stato mantenuto per tutta la durata dell'esperimento.
La IOP media sull'intera durata dell'esperimento per gli occhi di controllo non iniettati con perline era di 19,7 più meno 0,3 millimetri di mercurio e 40,5 più meno 2,8 millimetri di mercurio per gli occhi iniettati con perline. Inoltre, il picco di IOP è aumentato da 22,8 più meno 0,3 millimetri di mercurio a 49,9 più meno 2,3 millimetri di mercurio per determinare se l'aumento della IOP porta alla morte delle cellule gangliari retiniche. La colorazione del tunnel è stata eseguita sulla retina e sull'istologia sulle sezioni del nervo ottico trasverso nella retina.
Abbiamo osservato un aumento della colorazione del tunnel negli occhi iniettati con IOP elevata. Il numero di nuclei apoptotici è aumentato di circa 15 volte rispetto alle retine ipertese di controllo controlaterale come previsto negli occhi in cui le microsfere magnetiche sono state iniettate senza pressione, il numero di cellule positive al tunnel non era significativamente diverso da quello dei controlli non iniettati. Ulteriori indagini sulla patologia del nervo ottico nel modello di glaucoma hanno mostrato l'accumulo di blu odine in molti degli assoni, indicando la degenerazione di questi processi cellulari.
Panoramica
Questo studio presenta un metodo per indurre un aumento della pressione intraoculare (IOP) nei ratti mediante iniezione di microsfere magnetiche nella camera anteriore dell'occhio, riproducendo il modello del glaucoma. La procedura determina un significativo incremento della pressione e la morte neuronale, garantendo un aumento stabile e duraturo della IOP senza la necessità di iniezioni ripetute.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oftalmologia
- Ricerca sul glaucoma
Sfondo
- Un aumento della PIO è un fattore di rischio importante per il glaucoma.
- I modelli attuali richiedono spesso interventi multipli.
- Le microsfere magnetiche offrono un approccio innovativo per indurre un aumento della PIO.
- Comprendere la morte neuronale nel glaucoma è fondamentale per lo sviluppo di trattamenti.
Scopo dello studio
- Stabilire un modello affidabile per lo studio del glaucoma nei ratti.
- Valutare l'impatto dell'aumento della PIO sulla morte delle cellule gangliari retiniche.
- Valutare gli effetti a lungo termine delle iniezioni di microsfere magnetiche sulla PIO.
Metodi Utilizzati
- Iniezione di microsfere paramagnetiche nell'occhio del ratto.
- Misurazione della PIO mediante tonometria a rimbalzo.
- Analisi istologica dei danni alla retina e al nervo ottico.
- Valutazione della morte cellulare apoptotica mediante colorazione TUNEL.
Risultati principali
- Elevato e sostenuto aumento della PIO negli occhi iniettati con microsfere.
- Aumento della morte delle cellule gangliari retiniche correlato all'innalzamento della PIO.
- Evidenza istologica di degenerazione del nervo ottico.
- Gli occhi di controllo hanno mantenuto livelli normali di PIO per tutta la durata dello studio.
Conclusioni
- Il metodo modella efficacemente il glaucoma nei ratti.
- L'aumento della PIO provoca danni neuronali significativi.
- Questo modello può essere utilizzato per future ricerche sul glaucoma e per la sperimentazione di terapie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo fornisce un modello solido e riproducibile per indurre un aumento sostenuto della pressione intraoculare nei ratti, consentendo studi meccanicistici sulla fisiopatologia del glaucoma. Supporta la validazione degli obiettivi collegando l'aumento della pressione alla morte delle cellule gangliari retiniche e alla degenerazione del nervo ottico, offrendo un valore predittivo per lo screening terapeutico neuroprotettivo. La semplicità del modello e il suo effetto duraturo riducono la variabilità sperimentale, facilitando la collaborazione interfunzionale nei percorsi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette di indagare la relazione causale tra pressione intraoculare e glaucoma inducendo un aumento sostenuto della pressione.
- Valore operativo: Fornisce un fenotipo costante per valutare il legame con il bersaglio nei percorsi patogenetici.
- Valore scientifico: Supporta la validazione funzionale dei bersagli coinvolti nella regolazione della trama trabecolare e nella dinamica dell'umore acqueo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera parametri quantificabili di PIO e risultati istopatologici per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Fornisce misurazioni riproducibili della PIO basale e aumentata per campagne di screening di composti.
- Valore scientifico: Consente la valutazione dose-risposta di agenti riduttori della PIO mediante monitoraggio longitudinale della pressione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Riproduce patologie chiave del glaucoma, inclusa l'apoptosi delle cellule gangliari retiniche e la degenerazione degli assoni del nervo ottico.
- Valore operativo: Consente la valutazione preclinica di composti neuroprotettivi e modulatori della pressione intraoculare in un sistema rilevante per la malattia.
- Valore scientifico: Favorisce l'allineamento dei biomarcatori attraverso l'analisi correlativa tra livelli di pressione intraoculare e parametri di morte neuronale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello si inserisce nel percorso di scoperta del glaucoma, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla sperimentazione preclinica dell'efficacia, grazie alla sua capacità di generare un aumento misurabile della PIO e una successiva neurodegenerazione.
- Biologia della scoperta: Permette la verifica di ipotesi sui meccanismi legati alla pressione intraoculare (IOP) nella patologia retinica e del nervo ottico.
- Screening: Fornisce la pressione intraoculare (IOP) come biomarcatore farmacodinamico per valutare gli effetti dei composti sull’efflusso dell’umore acqueo.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative della pressione intraoculare (IOP) e parametri istopatologici per l’analisi comparativa delle condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega l’aumento della pressione intraoculare (IOP) a una neurodegenerazione rilevante per l’uomo, sostenendo la continuità traslazionale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l’induzione della pressione intraoculare (IOP), adattabile a diversi modelli di roditori per studi longitudinali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile sulla causalità tra IOP e glaucoma attraverso un'elevazione sostenuta della pressione e neurodegenerazione.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità mediante tecniche standardizzate di iniezione di microsfere e posizionamento magnetico.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione riducendo la variabilità biologica negli studi di efficacia basati sull'IOP.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei farmaci per il glaucoma adeguata al rischio, basata sui profili di riduzione dell'IOP e di neuroprotezione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia oculare su roditori e nella misurazione della pressione intraoculare mediante tonometria a rimbalzo.
- Dipende dall'accesso a microsfere magnetiche sterili, attrezzature per la sterilizzazione e reagenti per la colorazione istologica.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo ai criteri di aumento della pressione intraoculare e ai protocolli di valutazione istologica.
- Comporta considerazioni di adattamento legate all'anatomia dell'occhio del topo e al volume più ridotto della camera anteriore.
- È limitato dalla necessità di un monitoraggio postoperatorio per escludere risponditori transitori alla pressione e garantire la coerenza del modello.
