Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare la differenziazione del micro RNA, la profilazione e la convalida del Mr.NA target di una linea di cellule staminali neurali umane. Ciò si ottiene coltivando prima cellule staminali neurali umane su un sistema di coltura tridimensionale per indurre la differenziazione cellulare. Il secondo passo consiste nel quantificare la differenziazione misurando la crescita del processo degli assoni.

Successivamente, i cambiamenti nell'espressione del micro RNA vengono valutati mediante array micro R-N-A-P-C-R. Viene quindi eseguita l'analisi computazionale di microRNA differenzialmente espressi selezionati per identificare un set di mRNA bersaglio putativo. In definitiva, gli mRNA bersaglio sono convalidati dal plasmide reporter, dalla trasfezione e da un doppio saggio della luciferasi.

Quindi il metodo che viene presentato qui può aiutare a rispondere a questioni chiave nel campo delle cellule staminali neurali, come la caratterizzazione dei microRNA espressi, e prendono di mira gli RNA messaggeri nelle cellule staminali neurali umane quando sono in fase di differenziazione. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla biologia delle cellule staminali neurali. Può anche essere applicato ad altri sistemi di cellule staminali come le cellule staminali mesenchimali, le cellule staminali pluripotenti indotte o altri sistemi che richiedono l'induzione della differenziazione e della caratterizzazione molecolare.

La dimostrazione visiva di questo metodo analizza le fasi critiche del differenziamento di una linea di cellule staminali neurosali umane e l'indagine sulla profilazione dei microRNA e la convalida dell'mRNA bersaglio dimostrando parte della procedura sarà Lavania, uno scienziato del mio laboratorio. L'intera procedura deve essere eseguita in una cabina di sicurezza biologica utilizzando tecniche asettiche. Reidratare gli scaffold aggiungendo ad ogni pozzetto l'AL VX 12.

Piastra a pozzetto due millilitri di etanolo al 70% preparato utilizzando acqua per l'irrigazione. Evitare di toccare le impalcature erogando il 70% di etanolo lungo la parete di ciascuna. Aspirare bene l'etanolo al 70% e lavare immediatamente gli scaffold con due millilitri per pozzetto di D-M-E-M-F 12 per un minuto.

Ripetere la procedura di lavaggio due volte, aspirare con cura il D-M-E-M-F 12 dopo l'ultimo lavaggio. Rivestire le impalcature aggiungendo due millilitri di laminina in D-M-E-M-F 12 a ciascuna. Incubare bene la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica per un minimo di due ore.

Successivamente, lavare la piastra con semi caldi D-M-E-M-F 12 per ciascuna impalcatura con circa 500.000 cellule staminali neurali umane o H nscs in un volume di 150 microlitri di terreno RMM con fattori di crescita. Incubare la piastra per tre ore per consentire alle cellule di stabilirsi nell'impalcatura dopo tre ore. Aggiungere 3,5 millilitri di RMM a ciascun pozzetto facendo attenzione a non rimuovere le cellule dagli scaffold.

Incubare la piastra per sette o 21 giorni. Sostituire il terreno RMM dopo un giorno, che è la prima poppata e sostituire nuovamente il terreno due o tre giorni dopo la prima poppata. Sette e 21 giorni dopo la coltura 3D di H nscs.

Rimuovere il terreno RMM e fissare le cellule differenziate con aldeide paraforme al 4%. Le cellule fissate vengono quindi colorate utilizzando un anticorpo primario beta tre tubulina rilevato con un fluorocromo coniugato. I nuclei delle cellule anticorpali secondarie sono controcolorati con ganci.

Cattura immagini rappresentative delle cellule colorate con tubulina beta tre. Utilizzando un microscopio fluorescente, salvare le immagini in formato TIFF o JPEG. La misurazione della crescita del processo degli assoni viene eseguita utilizzando lo strumento di misurazione software image PRO plus seven.

Per iniziare ad aprire l'immagine, selezionare l'opzione di misurazione nella barra degli strumenti e selezionare la funzione di traccia. Per avviare la traccia, selezionare il punto iniziale sulla crescita dell'assone facendo clic con il pulsante del mouse traccia lungo l'intera lunghezza della crescita dell'assone, fare clic con il pulsante destro del mouse per terminare ogni traccia. In questo modo, misurare tutte le escrescenze degli assoni all'interno del campo visivo espresse misurazioni come pixel o micrometri.

Esportazione delle misure di lunghezza in un foglio di calcolo per l'analisi comparativa e statistica dei campioni per valutare i cambiamenti nell'espressione dei micro RNA delle HSC coltivate tridimensionalmente. Per prima cosa eseguire l'estrazione del micro RNA e la preparazione del micro RNA CD NA come descritto nel protocollo allegato. Testo immediatamente dopo l'ottenimento del micro RNA CD NA.

Preparare la miscela di componenti della PCR per la PCR in tempo reale in una provetta da 15 millilitri. Aggiungere 1375 microlitri di un master mix verde di due X-S-Y-B-R. 100 microlitri di micro RNA CD NA, 275 microlitri di primer universale e 1000 microlitri di RNA, trasferimento di acqua senza acqua.

I componenti della PCR si mescolano in un serbatoio di caricamento della PCR. Rimuovere con cautela l'array PCR su piastra a 96 pozzetti dalla sua busta sigillata. Utilizzando un pipettatore multicanale, aggiungere 25 microlitri di componenti PCR.

Mescolare in ciascun pozzetto dell'array PCR. Sostituire i puntali delle pipette dopo ogni fase di pipettaggio per evitare la contaminazione incrociata tra i sigilli dei pozzetti. La piastra a 96 pozzetti con pellicola adesiva ottica e centrifugare per un minuto a 1000 GS a temperatura ambiente per rimuovere le bolle ispeziona visivamente la piastra per assicurarsi che non siano presenti bolle nel posto dei pozzetti.

L'array PCR a 96 pozzetti nel programma di cycler in tempo reale. Il ciclatore in tempo reale di conseguenza. Successivamente, esportare i valori CT per tutti i pozzetti in un foglio di calcolo Excel vuoto per l'array PCR Analisi dei dati, un algoritmo disponibile online PIC ktar viene utilizzato per l'identificazione dei bersagli di micro RNA previsti.

Clicca su, clicca qui per la previsione di pic ktar sui vertebrati per aprire una nuova pagina nell'interfaccia web di PIC KTAR. Scegli la specie nel menu a tendina e inserisci il micro RNA di interesse nella casella ID micro RNA. Fare clic per cercare i bersagli di un micro RNA.

Verrà presentato un elenco di mRNA target classificati in base a un punteggio PIC KTAR. Le classifiche ottenute vengono poi utilizzate per compilare una tabella comparativa dei microRNA. Un doppio plasmide reporter di luciferasi viene utilizzato come strumento per convalidare l'mRNA bersaglio: le attività della lucciola e della luciferasi renale vengono misurate 24 ore dopo la trasfezione delle cellule hela.

Preparare la soluzione di lavoro uno aggiungendo 50 microlitri di substrato, uno in 10 millilitri di soluzione uno e mescolando accuratamente, rimuovere il terreno di crescita cellulare da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti e aggiungere 300 microlitri di soluzione di lavoro uno a ciascuno. Trasferire bene 100 microlitri del contenuto di ogni pozzetto. Della piastra da 24 pozzetti a tre pozzetti di una piastra da 96 pozzetti, attendere 10 minuti e quindi misurare l'attività della luciferasi della lucciola in un luminometro impostato per l'acquisizione della luminescenza.

Preparare la soluzione di lavoro due aggiungendo 50 microlitri di substrato, da due a 10 millilitri di soluzione due e mescolando accuratamente. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di lavoro due in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti che contiene già 100 microlitri di soluzione di lavoro. Si attende 10 minuti e poi si misura l'attività renale della luciferasi.

Successivamente, viene calcolato il rapporto di luminescenza dalla luciferasi della lucciola alla luciferasi renale. Microfotografie rappresentative di H NSCS su scaffold 3D sono state acquisite dopo la colorazione immunochimica per la tubulina beta tre mostrata in verde e la colorazione del contatore dei nuclei con ganci mostrati in blu La misurazione dei processi assonici è stata eseguita con l'aiuto di un software di analisi delle immagini. Un confronto della crescita del processo assonale tra le cellule staminali H cresciute con scaffold 3D e con le tradizionali colture a superficie piana o 2D mostra che a una o tre settimane le HSC differenziate 3D hanno mostrato una maggiore crescita del processo assonale.

L'analisi computazionale per la previsione del bersaglio ha portato alle informazioni presentate qui: un elenco di microRNA, i geni bersaglio previsti e il punteggio di precisione e i valori aggregati. SOX cinque e NR quattro A tre sono stati identificati come geni bersaglio putativi. Un doppio saggio reporter della luciferasi è stato utilizzato per convalidare i bersagli dei microRNA, come mostrato qui.

L'attività relativa della luciferasi da tre principali reporter UTR umani dei geni SOX 5 e NR 4 A tre è stata significativamente abbattuta in presenza dei microRNA indicati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come differenziarlo nelle cellule staminali neurali e studiare l'espressione del micro RNA e la convalida del bersaglio Messenger.RNA.