Name: Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Scopri l'analisi computazionale dei microRNA durante la differenziazione di cellule staminali neurali umane in coltura 3D. Questo metodo combina PCR array, predizione bioinformatica e saggio dual luciferase per validare i target mRNA.

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Riconosciamo Julie Heward per aiutare nella preparazione di hNSCs, e Lavaniya Thanabalasundaram per il suo supporto tecnico con HeLa coltura e trasfezione.

1. HNSC differenziazione su Tridimensionale (3D) Culture NOTA: Isolare e derivare hNSCs, da un tessuto etico approvato, descritto in una pubblicazione precedente 2. Si prega di seguire le linee guida etiche ed istituzionali seguendo questa procedura. 1.1) La cultura 3D Utilizzando 12 pozzetti <ol><li> Utilizzare una tecnica asettica durante tutta la procedura. In un armadio di sicurezza biologica, impalcature reidratare aggiungendo 2 ml / pozzetto di etanolo al 70% preparate con acqua per l&#39;irrigazione (WFIr). Evitare di toccare i ponteggi erogando l&#39;etanolo del 70% il muro di ogni bene. </li><li> Aspirare accuratamente la etanolo al 70% e lavare immediatamente i ponteggi con 2 ml / pozzetto DMEM: F12 per 1 min. Ripetere la procedura di lavaggio due volte. Aspirare accuratamente il DMEM: F12 dopo il lavaggio finale. </li><li> Ponteggi Coat aggiungendo 2 ml / pozzetto di laminina (10 mg / ml) in DMEM: F12. Incubare la piastra a 37 ° C in un CO 2 ronzio 5%incubatrice idified per un minimo di 2 ore. Piastra Lavare con DMEM caldo: F12. </li><li> Seed ogni scaffold con circa 500.000 hNSCs in un volume di 150 ml di RMM + GF. </li><li> Incubare la piastra per 3 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5% per permettere alle cellule di stabilirsi nei ponteggi. </li><li> Aggiungere 3,5 ml di RMM per ciascun bene facendo attenzione a non staccare le cellule da impalcature. </li><li> Incubare la piastra per 7 giorni; sostituire RMM medie (3,5 ml / pozzetto) dopo 1 giorno (prima alimentazione) e dopo 2-3 giorni dalla prima alimentazione. </li><li> Dopo 7 giorni, rimuovere le medie e fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) per immunocitochimica (ICC) o aggiungere 500 ml / pozzetto di reagente di lisi per l&#39;estrazione di RNA totale (piastra di conservare a ≤ -80 ° C o procedere con l&#39;estrazione totale RNA) . </li></ol> 1.2) Misura della Axon Process escrescenza <ol><li> Stain 4% PFA fissato hNSCs differenziati secondo un protocollo standard ICC 20 con β3-tubulina (TUBB3) anticorpo primario rilevato con un anticorpo secondario coniugato fluorocromo. Nuclei delle cellule di contrasto con Hoechst (1 micron). </li><li> Cattura immagini rappresentative di cellule colorate β3-tubulina usando un microscopio a fluorescenza; salvare le immagini come tiff o jpeg. Misura del processo assonale utilizzando uno strumento di misurazione del software (ad esempio, immagine-Pro Plus). </li><li> Aprite l&#39;immagine, opzione di selezionare le misurazioni nella barra degli strumenti, e selezionare la funzione di traccia. </li><li> Per avviare la traccia, selezionare il punto di partenza sul conseguenza assone facendo clic sul pulsante del mouse. Tracciare lungo l&#39;intera lunghezza del escrescenza assone; fare clic destro per terminare ogni traccia. Ripetere per misurare tutto outgrowthswith assone nel campo visivo. </li><li> Esprimere misure come pixel o micron (in attesa di calibrazione impostato). Misure di lunghezza esportare in un programma di foglio di calcolo per l&#39;analisi comparativa e statistica del campione. </li></ol> 2. Mirna espressione utilizzando una Cellule Staminali ePercorsi di sviluppo Focused Array miRNA PCR 2.1) estrazione di RNA totale miRNA <ol><li> Eseguire estrazione miRNA sui ponteggi e campioni cresciuti 2D (differenziato e indifferenziato, il controllo hNSC). </li><li> Scongelare ponteggi, inseriti in una piastra ben 12, se necessario. Combina contenuti reagenti di lisi (500 microlitri) di 2 pozzi nella stessa 1,5 ml provetta Eppendorf, volume finale 1 ml di Lysis reattivo. Fare attenzione a lasciare il palco nel pozzo. </li><li> Per i campioni raccolti in precedenza secche cellulari pellettato 2D cresciuto (differenziate culture hNSC 2D e controllo indifferenziato) aggiungere 1 ml di reagente di lisi e trasferire il contenuto in 1,5 ml provetta. </li><li> Omogeneizzare ogni campione con una siringa da 1 ml e una breve 20 a 25 gauge. Far passare il lisato attraverso l&#39;ago utilizzando una siringa da 1 ml fino a 5 volte fino ad ottenere un lisato omogenea. </li><li> Aggiungere 200 ml di cloroformio in ogni provetta Eppendorf e tappare saldamente. Tubi Inverti e vortex permescolare il contenuto. </li><li> Centrifugare ogni 1,5 ml provetta contenente omogeneizzato per 15 minuti a ≥12,000 x g. </li><li> Trasferire la fase acquosa superiore di ciascun campione (evitare di trasferire ogni interfase, rosa liquido colorato) ad una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 750 ml di etanolo al 100%. Miscelare bene per capovolgimento. </li><li> Pipetta fino a 700 ml di ogni campione di prova, comprese eventuali precipitato, in un mini colonna in un tubo di raccolta da 2 ml. Chiudere il coperchio e centrifugare a ≥8,000 xg per circa 30 secondi a temperatura ambiente. Gettare il flow-through. Ripetere questa operazione utilizzando il resto del campione. </li><li> Eseguire un digest DNA per 15 min. </li><li> Aggiungere 700 microlitri di buffer RWT alla mini colonna e centrifugare per circa 30 secondi a ≥8,000 x g. Gettare il flow-through. </li><li> Lavare mini colonna aggiungendo 500 microlitri di buffer RPE e centrifugazione per circa 30 secondi a ≥8,000 x g. Gettare il flow-through. Ripetere wash.Centrifuge a ≥12,000 xg per 1 min per asciugare ulteriormente la membrana. </li><li> Eluire RNA totale in una provetta Eppendorf da 1,5 ml aggiungendo 40 ml di acqua RNase-free alla mini colonna e centrifugando per 1 min a ≥8,000 x g. Misurare concentrazione totale RNA con l&#39;ausilio di uno spettrofotometro adeguato. </li></ol> 2.2) miRNA cDNA Preparazione <ol><li> Preparare la master mix trascrizione inversa. Ogni campione richiede 4 ml di tampone 5x miScript Hispec, 2 ml di 10x nucleics mix, 2 microlitri miScript inversa mix trascrittasi. </li><li> Aliquota 8 ml di master mix in un tubo di PCR, aggiungere il volume richiesto di RNA totale (250 ng), e aggiungere acqua senza RNase ad un volume finale di 20 ml. </li><li> Incubare per 60 min a 37 ° C.Incubate per 5 minuti a 95 ° C per inattivare miScript trascrittasi inversa Mix. </li><li> Aggiungere 200 acqua priva di RNasi microlitri per ogni reazione di 20 microlitri inversa trascrizione, conservare a -20 ° C, o procedere con real-tiMi Pcr immediatamente. </li></ol> 2.3) Cellule staminali e dello sviluppo Pathways focalizzata miRNA PCR Array <ol><li> Preparare la componenti mix PCR in una provetta da 15 ml con l&#39;aggiunta di 1375 ml di 2x SYBR master mix verde, 100 ml miRNA cDNA preparazione, 275 ml di 10x miScript Primer universale, e 1000 ml di acqua RNase-free (volume totale 2.750 ml). </li><li> Trasferire PCR componenti mix su un carico serbatoio PCR. Rimuovere con attenzione il 96 pozzetti PCR schiera dalla confezione sigillata. </li><li> Aggiungere 25 ml componenti PCR mix in ogni pozzetto del Array PCR utilizzando una pipetta a 8 canali, o una pipetta 12 canali utilizzando solo 8 punte. Cambiare puntali seguenti ogni semina per evitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti. </li><li> Sigillare piastra con pellicola adesiva ottica, e centrifugare per 1 min a 1000 xg a temperatura ambiente (15-25 ° C) per rimuovere bolle. Ispezionare visivamente la piastra dal basso per garantire l&#39;assenza di bolle sono presenti nei pozzetti. </li><li> Posizionare la 96 pozzetti PCR array in tempo reale cycler. </li><li> Programmare il tempo reale cycler conseguenza: 1 ciclo a 95 ° C per 10 minuti, e 45 cicli di 15 secondi a 95 ° C, e 1 min a 60 ° C impostata una singola (raccolta dei dati di fluorescenza). </li><li> Esportare i valori Ct per tutti i pozzetti di un vuoto foglio di calcolo Excel per l&#39;utilizzo con la PCR Array Data Analysis Template Excel e software web-based. NOTA: Il software è disponibile in <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> . </li></ol> 3. Analisi computazionale per miRNA target Previsione e Validazione di Target mRNA da Reporter plasmidi Transfection e Ddual luciferasi Assay. 3.1) Analisi computazionale per la previsione miRNA target <ol><li> Sfoglia PicTar ( <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ) 21, disponibile online algoritmo per l&#39;identificazione di miRNA bersaglio mRNA di previsione. </li><li> Clicca su &quot;clicca qui per la previsione PicTar su vertebrati&quot;. Una nuova pagina si aprirà. </li><li> Nella nuova pagina, interfaccia web PicTar, scegliere specie nel menu a tendina e inserire miRNA di interesse nella casella di miRNA ID. Clicca ricerca di obiettivi di miRNA. </li><li> Osservare un elenco di mRNA bersaglio ordinati per punteggio aPicTar. NOTA: PicTar calcola un punteggio che riflette la probabilità che un determinato UTR sarà destinata dal miRNA selezionati, e si basa sulla complementarità delle sementi, termodinamica e una previsione combinatoria per obiettivi comuni in gruppi di co-espressi miRNA 22. </li><li> Allo stesso modo recuperare l&#39;elenco di mRNA bersaglio utilizzando DIANA-LAB ( <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ) 23, e TargetScan ( <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a> ) 24, alternativa on line disponibile algoritmi. </li><li> Compilare una tabella comparativa di miRNAs sulla base di classifica ottenute utilizzando diversi strumenti software. PicTar classifica in base al punteggio, DianaLab per la precisione (sulla base di rapporto segnale-rumore e un punteggio di precisione per la valutazione della significatività dei risultati previsti), e TargetScan da PCT aggregato (basato sulla complementarità delle sementi, termodinamico energia libera di legame, conservazione su diverse specie), vedi tabella 1. </li></ol> 3.2) Validazione dei target mRNA da Reporter plasmidi Transfection e Dual Luciferase Assay. NOTA: 3 &#39;UTR reporter luciferasi per la validazione del target mRNA è stato descritto in precedenza 25. <ol><li> Transfection <ol><li> Seme cellule HeLa con una densità di 10 5 cellule / pozzetto in 24-pozzetti. </li><li> Dopo 24 ore, co-trasfezione le cellule HeLa con 1,5 ml di reagente di trasfezione eo 100 ng di NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTR plasmide, nonché imita 20 nM miRNA (HSA-miR-96-5p per SOX5 3217; UTR, e HSA-miR-7-5p, e HSA-miR-17-5p per NR4A3 3 &#39;UTR, rispettivamente) per bene. </li><li> Pozzetti di controllo Co-trasfezione con NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTRplasmid e fluorocromi etichettata siRNA controllo negativo. La trasfezione di pozzetti di controllo con fluorocromi etichettata siRNA controllo negativo consente la valutazione di efficienza di trasfezione e rappresenta mimica miRNA 3&#39;UTR bind specificità. </li></ol></li><li> Misurazione del doppio luciferasi Attività <ol><li> Misurare Firefly e Renilla attività luciferasi 24 ore dopo la trasfezione. Togliere terreno di coltura cellulare. </li><li> Preparare la soluzione di lavoro I aggiungendo 50 ml di substrato I in 10 ml di soluzione di I; mescolare accuratamente. Aggiungere 300 ml di soluzione di lavoro che in ogni 24 bene. </li><li> Trasferire il contenuto di ogni 24 e in 3 pozzetti di una piastra bianca 96, 100 ml ciascuna. Attendere 10 min e misurare Firefly luciferasi in set luminometro per l&#39;acquisizione luminescenza. </li><li> Preparare solut lavoroion II aggiungendo 50 ml di substrato II in 10 ml di soluzione II; mescolare accuratamente. Aggiungere 100 ml di soluzione di lavoro che in ogni 96 e già contenente 100 ml di soluzione di lavoro I. </li><li> Attendere 10 min e misurare Renilla luciferasi in set luminometro per l&#39;acquisizione luminescenza. Calcolare il rapporto della luminescenza della luciferasi Firefly al luciferasi Renilla. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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Lo sviluppo di nuovi test in vitro per valutare e migliorare la differenziazione delle cellule staminali ha sempre rappresentato una sfida per lo studio delle loro funzionalità e capacità terapeutiche. A lungo termine e l&#39;attaccamento stabile di hNSCs, necessaria per lo sviluppo di un robusto 3D in vitro la differenziazione, è stata affrontata analizzando diversi substrati 3D con caratteristiche diverse in termini di materiali e strutture. Come parte dello sviluppo test abbiamo anche valutato concentrazione ottimale di semina cellulare e identificato l&#39;obbligo per i ponteggi da laminina rivestite. Sebbene i nostri hNSCs possono differenziarsi spontaneamente upon 4-OHT e il fattore di crescita di rimozione, l&#39;implementazione di un sistema di coltura 3D mostrato un miglioramento significativo nella loro capacità di differenziazione come misurato da assonale processo rispetto a hNSCs 2D differenziato standard. Per studiare l&#39;effetto di differe 3D indottantiation sull&#39;espressione hNSC miRNA abbiamo usato un array di PCR. Rispetto ai chip di microarray standard di matrice PCR offre i vantaggi di una quantificazione diretta e validazione di miRNA di interesse. Sebbene l&#39;array PCR è limitata in termini di numero totale di miRNA per elemento, per esempio qui meno di 96, può essere adattato per includere specificamente miRNA di interesse, nel nostro caso precedentemente riportato nello sviluppo delle cellule staminali. L&#39;espressione del pathway concentrata miRNA è stata profilata in 3D e 2D hNSCs differenziati rispetto a hNSCs indifferenziati. I più significativamente down-regolato miRNA sono stati selezionati e analizzati per valutare i loro presunti mRNA bersaglio con l&#39;intento di determinare la loro funzionalità e interpretazione biologica mediante algoritmi disponibili online (DIANA Lab, PicTar, e TargetScans). Un singolo miRNA può riconoscere centinaia di obiettivi e per questo motivo abbiamo convalidato interazioni miRNA con 3 &#39;UTR mRNAsthat possono essere candidati idonei in unregolazione xonal. NR4A3, un obiettivo della HSA-miR-7, e miR-17 famiglie, è un membro della famiglia dei recettori nucleari NR4A che, a seconda del loro livello di espressione, sono coinvolti nella differenziazione, sopravvivenza, apoptosi e la regolamentazione del assone ippocampale guida 26. Analogamente SOX5, un obiettivo di HSA-miR-96, è segnalato per controllare la progressione del ciclo cellulare in progenitori neurali 27 lunghezza assone 28, migrazione, differenziazione post-migratori, e proiezioni di neuroni 29. Sia SOX5 e NR4A3 sono stati identificati come bersaglio mRNA diretta di HSA-miR-96, e HSA-miR-7 e 17, rispettivamente, dal doppio saggi luciferasi giornalista. Doppia luciferasi (lucciola e Renilla) si basa su due differenti geni reporter nella stessa plasmid e offre un sistema perfezionato che consente di normalizzazione per effetti causati dalla trasfezione subottimale e effetti citotossici rispetto ad un unico sistema plasmide luciferasi. Come parte del nostro sviluppo test abbiamo anche ottimizzato il nostro trasfezione conditions per ottenere un&#39;elevata efficienza. Il protocolsdescribed qui può essere sfruttata per ottimizzare ulteriormente e caratterizzare la differenziazione in vitro hNSC che possono beimplemented protocolli intransplantation per gli studi pre-clinici e future applicazioni cliniche.

La ricerca sulle cellule staminali ha un ruolo centrale nella medicina rigenerativa, che si estende anche le discipline di ingegneria dei tessuti, biologia cellulare dello sviluppo, terapie cellulari, terapia genica, e biomateriali (scaffold e matrici). Le cellule staminali sono importanti sia in organo riparazione dei tessuti Sviluppoe; capire come le cellule staminali funzionano è fondamentale per lo sviluppo di trattamenti a base di cellule staminali nuovo 1. CTX0E03 è un clonale, cellule staminali neurali umane condizionalmente immortalato (hNSC) Linea 2 isolati dal primo trimestre corteccia fetale umano. CTX0E03 ha definito le caratteristiche di qualità che sono essenziali per il settore bancario cella clinica in buone pratiche di fabbricazione (GMP) 3. HNSCs possono differenziarsi spontaneamente in neuroni, glia, e oligodendrociti e hanno dimostrato di migliorare i deficit neurologici quando trapiantati in un modello di roditore di focale ischemia 2,4,5. Il CTX0E03 hNSCs sono attualmente in studi clinici per l&#39;ictus Disabillità (NCT01151124 6 e NCT02117635, Clinicaltrials.gov). MiRNA hanno una media di 22 nucleotidi di lunghezza e hanno dimostrato molecole regolatrici 7, non codificano proteine, ma piuttosto legare 3 prime untranslated regione (3&#39;UTR) di mRNA, regolando la loro stabilità e la traduzione in proteine. MiRNA sono segnalati per partecipare alla regolamentazione di un certo numero di processi cellulari, tra cui lo sviluppo, la proliferazione e la differenziazione 8. Molti miRNA sono stati implicati nella regolazione del destino e la specifica delle cellule staminali neurali 9. In bidimensionale (2D) cultura ambiente standard complessità dell&#39;ambiente in vivo non corrisponde, e quindi l&#39;induzione e regolazione di hNSC differenziazione non è ottimale. In vivo, le cellule sono circondate da un tridimensionale (3D) microambiente tre composta da altri cellule e ligandi extracellulari, tra cui moltitipi di collagene, laminina, e altre proteine ​​della matrice (matrice extracellulare, ECM). Hanno riferito Studi precedenti che la topografia architettonica dei materiali che mimano ECM e il loro fenotipo cellulare geometria influenza e il destino 10-15. Un certo numero di commercialmente disponibili scaffold 3D sono disponibili; abbiamo usato un ponteggio polistirene altamente porosa progettato con un&#39;architettura ben definita ed uniforme in una membrana di spessore 200 micron che fornisce uno spazio 3D in cui le cellule possono invadere e differenziarsi 16-18. Ivi saggi di differenziazione 2D e 3D sono utilizzati per valutare axonprocess escrescenza. Inoltre, si descrive un metodo per profilare l&#39;espressione miRNA di una linea di grado hNSC clinica per studiare ulteriormente gli effetti dei miRNA sulla sua differenziazione. I metodi qui illustrati sono basati su quelli originariamente descritti in 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM: F12</td><td>Invitrogen</td><td>21331-020</td><td>Per la preparazione media RMM</td></tr><tr><td>Soluzione di albumina umana&nbsp;</td><td>Baxter assistenza sanitaria limitata&nbsp;</td><td>1501052</td><td>Per il terreno RMM utilizzato a una concentrazione finale di&nbsp; 0,03%</td></tr><tr><td>Transferrina, Sigma</td><td></td><td>T8158</td> ricombinante <td>umano Per il terreno RMM utilizzato a una concentrazione finale di&nbsp; 5 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Putrescina DiHCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Per mezzo RMM utilizzato a una concentrazione finale di&nbsp; 16,2 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>di insulina, ricombinante umano&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td>Per mezzo RMM utilizzato a una concentrazione finale di&nbsp; 5 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>di progesterone</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td>Per mezzo RMM utilizzato a una concentrazione finale di &nbsp; 60 ng/ml</td></tr><tr><td>di L-Glutammina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030-24</td><td>Per terreno RMM utilizzato a una concentrazione finale di&nbsp; 2 mM</td></tr><tr><td>di selenito di sodio&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>Per mezzo RMM utilizzato ad una concentrazione finale di 40 ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Da aggiungere al terreno RMM, utilizzato ad una concentrazione finale di 10 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-188</td><td>Da aggiungere al terreno RMM, utilizzato a una concentrazione finale di 20 ng/ml</td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Da aggiungere al terreno RMM, utilizzato a una concentrazione finale di 100 nM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>AMS Biotech</td><td>3400-010-10</td><td></td></tr><tr><td>TrypZean/EDTA</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>BE02-034E</td><td></td></tr><tr><td>Acqua per l'irrigazione</td><td>Baxter Healthcare</td><td>UKF7114</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore definito della tripsina (DTI) (conservare -20&deg; C)</td><td>Piastra Invitrogen</td><td>R007-100</td><td></td></tr><tr><td>Alvetex a 12 pozzetti&nbsp;</td><td>Reinnervate Ltd</td><td>AVP002</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td>1.00986.1000</td><td></td></tr><tr><td>&beta; III anticorpo della tubulina</td><td>Sigma</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td></td><td></td>217004</tr><tr><td>DNasi senza RNasi</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>218160</td><td></td></tr><tr><td>Kit PCR verde SYBR</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>218073</tr><tr><td>Sviluppo cellulare & Differenziazione miScript miRNA PCR Array</td><td>Qiagen/ SABiosciences</td><td>MIHS-103Z</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 bianco 96 piastra</td><td>Roche</td><td>&nbsp; </td><td></td>4729692001</tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp; pellicola sigillante</td><td>Roche</td><td>&nbsp; </td><td></td>4729757001</tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Vector NR4A3 miRNA 3' UTR cloni bersaglio&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT019538-MT0</td><td></td></tr><tr><td>Vector SOX5 miRNA 3' UTR cloni bersaglio&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT017632-MT01</td><td></td></tr><tr><td>Allstars controllo negativo siRNA AF 488 (Qiagen).</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>1027284</td><td>Controllo della trasfezione di MiRNA</td></tr><tr><td>Luc-Pair miR Saggio della luciferasi</td><td>GeneCopeia</td><td>LPFR-M010</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp;</td><td>Luminometro per micropiastre Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GloMax 96</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in tre culture dimensionali, geni analisi di microrna e putativo di destinazione

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Le cellule staminali neurali (NSC) sono in grado di auto-rinnovamento e la differenziazione in neuroni, astrociti e oligodendrociti sotto specifici microambienti locali. Qui, vi presentiamo una serie di metodi utilizzati per tridimensionale (3D) la differenziazione e l&#39;analisi miRNA di una cellula staminale neurale umana (hNSC) linea clonale, attualmente in studi clinici per la disabilità ictus (NCT01151124 e NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs sono stati ricavati da un etico approvato primo trimestre corteccia fetale umano e condizionale immortalati con integrazione retrovirale di una singola copia del c-mycER TAM costruire. Descriviamo come misurare processo assonale di hNSCs differenziati sulle impalcature 3D e come quantificare i cambiamenti associati nella espressione dei miRNA con matrice PCR. Inoltre rappresentiamo analisi computazionale, con l&#39;obiettivo di selezionare miRNA target putativi. SOX5 e NR4A3 sono stati identificati come idonei bersaglio putativo miRNA di selezionati in modo significativo down-regolanod miRNA in hNSC differenziata. Validazione del target Mirna è stata effettuata su SOX5 e NR4A3 3&#39;UTRs da dual trasfezione plasmide reporter e doppio test luciferasi.

Nella figura 1 viene visualizzata la ricerca e quantificazione di hNSC differenziazione su scaffolds 3D rispetto alle culture tradizionali superficie piana (2D) e expressedas assoni misurazioni processo escrescenza. Nella figura 2 è representedthe flusso di lavoro e risultati per la quantificazione miRNA utilizzando cellule staminali e percorsi di sviluppo focalizzati matrice miRNA PCR per indagare l&#39;espressione differenziale dei miRNA in hNSCs differenziate 2D e 3D rispetto al controllo di indifferenziata. A seguito di analisi comparativa tra miRNA hNSCs differenziati e indifferenziati, e analisi computazionale per la previsione di destinazione, SOX5 e NR4A3 (Nor1) sono stati identificati come presunti mRNA bersaglio. Per studiare l&#39;interazione diretta tra i miRNA ei loro sito putativo sul 3&#39;UTR dell&#39;mRNA abbiamo usato 2 plasmidi disponibili in commercio che contengono sia SOX5 o sequenza NR4A3 3&#39;UTR inserito a valle del lucciola luciferasi gene reporter, un<html> nd contenente nello stesso plasmide renilla luciferasi gene per la normalizzazione. I risultati rappresentativi di 3 &#39;UTR attività luciferasi down-regolazione è presentato in figura 3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> Figura 1:. Differenziazione delle hNSCs su impalcature 3D, e la misurazione della crescita degli assoni processo es (A) seguito colorazione ICC standard per β3-tubulina (verde) e nuclei di contrasto con Hoechst (blu) microfotografie rappresentativi sono stati acquisiti e misurazione dei processi assoni erano eseguita con l&#39;ausilio di un software di analisi di immagine. (B) Schemi di segnalazione la misura del processo di estensione assonale eseguita in hNSCs differenziati 2D e 3D per 1 (1W) o 3 settimane (3W).com / files / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> Figura 2:. Workflow Schema di miRNA profiling in hNSCs differenziate RNA totale, tra cui miRNA, è stato estratto da entrambi hNSCs differenziati sulle impalcature 3D e culture 2D standard o di controllo indifferenziata. 250 ng di RNA totale sono stati retro-trascritto con un metodo che facilita la conversione selettiva dei miRNA maturi in cDNA adatto per miRNA quantificazione con la differenziazione delle cellule umane e lo sviluppo miScript miRNA PCR array. La geo-media di SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, e RNU6-2 è stato utilizzato per l&#39;analisi dei dati in base al metodo 2 -ΔΔct. Cambiamenti significativi sono stati definiti come +/- 1,5 ripiegare e regolazione fino a una stain misura statisticamente significativa. I dati sono stati analizzati utilizzando il software web-based disponibile presso risultati sono espressi come clustergram. Modificato da Figura 3 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> Figura 3: convalida del target miRNA previsto mRNA utilizzando un doppio test rapporto luciferasi. (A) diagramma rappresentante di una duplice plasmide giornalista luciferasi utilizzato come strumento per convalidare sequenza 3&#39;UTR come bersaglio diretto di un miRNA. (B) Micrografia Rappresentante mostrando efficienza di trasfezione. (C) &#160; Segnali, espressi come attività relativa luciferasi, da umano 3 &amp; #39; giornalisti UTR ofSOX5 e NR4A3 geni erano significativamente abbattuti in presenza di HSA-miR-96, e HSA miR-7-e 17 imita miRNA rispettivamente. Modificato dalla figura 5 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> miRNA </td><td> Gene bersaglio </td><td> Siti target / geni trovati </td><td> Precisione </td><td> Punto </td><td> Aggregato P CT </td></tr><tr><td> HSA-miR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6.74 </td> &lt;td&gt; 0.94 </td></tr><tr><td> HSA-miR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0.72 </td><td> 4.75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> HSA-miR-302A </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> HSA-miR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> HSA-miR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0.17 </td><td> NF </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> HSA-miR-20a </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.85 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><strong&gt; HSA-miR-20b </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.9 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> HSA-miR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.9 </td><td> 5.38 </td><td> 0.63 + 0.37 </td></tr><tr><td> HSA-miR-20a </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-20b </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Elenco dei miRNA mRNA previsione di destinazione. Tavolo Rappresentante dei miRNA, bersaglio geni predittivi, e l&#39;analisi di algoritmi (prevedereion / partitura / aggregati forniti utilizzando rispettivamente Diana Lab, PicTar, e TargetScan). Modificato dalla tabella 3 19.

Con l'intento di caratterizzare i cambiamenti nei miRNA su cellule staminali neurali umane differenziate (hNSC), descriviamo la differenziazione delle hNSC su un sistema tridimensionale, la valutazione dei cambiamenti nell'espressione dei microRNA mediante array PCR di miRNA e l'analisi computazionale per la previsione del bersaglio dei miRNA e la sua convalida mediante doppio saggio della luciferasi.

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare la differenziazione mediante micro RNA, il profilo e la convalida dell'RNA messaggero bersaglio di una linea cellulare di cellule staminali neurali umane. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando cellule staminali neurali umane in un sistema di coltura tridimensionale per indurre la differenziazione cellulare. Il secondo passaggio consiste nel quantificare la differenziazione misurando la fuoriuscita dei processi assonali.Successivamente, le variazioni nell'espressione dei microRNA vengono valutate mediante array di micro R-N-A-P-C-R. Viene quindi effettuata un'analisi computazionale dei microRNA espressi in modo differenziale per identificare un insieme di mRNA bersaglio putativi. Infine, gli mRNA bersaglio vengono convalidati mediante plasmide reporter, trasfezione e un saggio con luciferasi duale.Pertanto, il metodo qui presentato può contribuire a rispondere a questioni fondamentali nel campo delle cellule staminali neurali, come la caratterizzazione dei microRNA espressi e dei loro mRNA bersaglio nelle cellule staminali neurali umane durante il processo di differenziamento. Sebbene questo metodo possa fornire importanti informazioni sulla biologia delle cellule staminali neurali, può essere applicato anche ad altri sistemi di cellule staminali, come le cellule staminali mesenchimali, le cellule staminali pluripotenti indotte o altri sistemi che richiedono l'induzione del differenziamento e la caratterizzazione molecolare.La dimostrazione visiva di questo metodo illustra le fasi critiche della differenziazione di una linea cellulare di cellule staminali neurali umane e dell'analisi del profilo dei microRNA e della validazione dell'mRNA bersaglio, mostrando parte della procedura che sarà eseguita da Lavania, una ricercatrice del mio laboratorio. L'intera procedura deve essere eseguita all'interno di una cappa a sicurezza biologica utilizzando tecniche asettiche. Riidratare gli scaffold aggiungendo a ciascun pozzetto dell'AL VX 12.Piastrare due millilitri di etanolo al 70% preparato con acqua per irrigazione. Evitare di toccare gli scaffold erogando l'etanolo al 70% lungo la parete di ciascun pozzetto. Aspirare con attenzione l'etanolo al 70% e lavare immediatamente gli scaffold con due millilitri per pozzetto di D-M-E-M-F 12 per un minuto.Ripetere attentamente la procedura di lavaggio due volte, aspirando il D-M-E-M-F 12 al termine dell'ultimo lavaggio. Rivestire gli scaffold aggiungendo due millilitri di laminina in D-M-E-M-F 12 a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% per almeno due ore.Successivamente, lavare la piastra con D-M-E-M-F 12 tiepida, seminando ogni scaffold con circa 500.000 cellule staminali neurali umane o H nscs in un volume di 150 microlitri di mezzo RMM con fattori di crescita. Incubare la piastra per tre ore per permettere alle cellule di aderire negli scaffold. Dopo tre ore, aggiungere 3,5 millilitri di RMM in ogni pozzetto, avendo cura di non staccare le cellule dagli scaffold.Incubare la piastra per sette o 21 giorni. Sostituire il mezzo RMM dopo un giorno, ovvero il primo rifornimento, e sostituire nuovamente il mezzo due o tre giorni dopo il primo rifornimento. Sette e 21 giorni dopo la coltura 3D di H nscs.Rimuovere il mezzo RMM e fissare le cellule differenziate con paraformaldeide al 4%. Le cellule fissate vengono quindi sottoposte a immunomarcatura utilizzando un anticorpo primario contro la beta-tubulina III, rilevato con un anticorpo secondario coniugato a un fluorocromo. I nuclei cellulari vengono contrastati con Hoechst.Catturare immagini rappresentative delle cellule colorate per la beta tre tubulina. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, salvare le immagini in formato TIFF o JPEG. La misurazione della crescita dei prolungamenti assonali viene effettuata mediante lo strumento di misura del software Image PRO Plus 7.Per iniziare, aprire l'immagine, selezionare l'opzione di misurazione nella barra degli strumenti e scegliere la funzione di tracciamento. Per iniziare il tracciamento, selezionare il punto iniziale sulla ricrescita dell'assone facendo clic con il pulsante del mouse, quindi tracciare lungo l'intera lunghezza della ricrescita dell'assone e fare clic con il tasto destro per completare ciascun tracciato. In questo modo, misurare tutte le ricrescite dell'assone all'interno del campo visivo ed esprimere le misurazioni in pixel o micrometri.Esportare le misurazioni della lunghezza in un programma di foglio elettronico per un'analisi comparativa e statistica del campione, al fine di valutare le variazioni nell'espressione del micro RNA degli HSC coltivati in tre dimensioni. Eseguire innanzitutto l'estrazione del micro RNA e la preparazione del CD NA del micro RNA come descritto nel protocollo allegato. Testo immediatamente dopo il completamento dell'ottenimento del CD NA del micro RNA.Preparare la miscela dei componenti per la PCR in tempo reale in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere 1375 microlitri di una master mix verde 2X-S-Y-B-R, 100 microlitri di microRNA CD NA, 275 microlitri del primer universale e 1000 microlitri di acqua priva di RNA.Mescolare i componenti della PCR in una riserva di carico per PCR. Rimuovere con attenzione la piastra PCR a 96 pozzetti dalla sua confezione sigillata. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 25 microlitri dei componenti della PCR.Mescolare in ogni pozzetto dell'array PCR. Cambiare le punte della pipetta dopo ogni passaggio di pipettaggio per evitare contaminazioni incrociate tra i pozzetti. Sigillare la piastra a 96 pozzetti con pellicola ottica e centrifugare per un minuto a 1000 ×g a temperatura ambiente per rimuovere le bolle; ispezionare visivamente la piastra per assicurarsi che non siano presenti bolle nei pozzetti.La piastra PCR a 96 pozzetti nel programma del termociclatore in tempo reale. Il termociclatore di conseguenza. Successivamente, esportare i valori CT per tutti i pozzetti in un foglio di calcolo Excel vuoto per l'analisi dei dati dell'array PCR; un algoritmo disponibile online, PIC ktar, viene utilizzato per l'identificazione dei target predetti di microRNA.Fare clic su, fare clic qui per la previsione di pic ktar nei vertebrati per aprire una nuova pagina nell'interfaccia web di PIC KTAR. Selezionare la specie nel menu a tendina e inserire il micro RNA di interesse nel campo ID micro RNA. Fare clic su cerca bersagli di un micro RNA.Verrà presentata una lista di mRNA bersaglio ordinati in base al punteggio PIC KTAR. I ranghi ottenuti vengono quindi utilizzati per compilare una tabella comparativa di microRNA. Un plasmide reporter a doppia luciferasi viene utilizzato come strumento per validare gli mRNA bersaglio; le attività della luciferasi della lucciola e della luciferasi renale vengono misurate 24 ore dopo la trasfezione delle cellule HeLa.Preparare la soluzione di lavoro uno aggiungendo 50 microlitri di substrato uno a 10 millilitri di soluzione uno e mescolando accuratamente; rimuovere il mezzo di crescita cellulare da ogni pozzetto della piastra a 24 pozzetti e aggiungere 300 microlitri di soluzione di lavoro uno a ciascun pozzetto. Trasferire 100 microlitri del contenuto di ogni pozzetto della piastra a 24 pozzetti in tre pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, attendere 10 minuti e quindi misurare l'attività della luciferasi di firefly in un luminometro impostato per l'acquisizione della luminescenza.Preparare la soluzione di lavoro due aggiungendo 50 microlitri di substrato a due-10 millilitri di soluzione due e mescolando accuratamente. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di lavoro due in ciascuna pozzetta della piastra a 96 pozzette già contenente 100 microlitri di soluzione di lavoro. Attendere 10 minuti e quindi misurare l'attività renale della luciferasi.Successivamente, viene calcolato il rapporto tra la luminescenza della luciferasi di lucciola e quella della luciferasi renale. Microfotografie rappresentative di H NSCS su scaffold 3D sono state acquisite dopo la colorazione immunochimica per la beta tre tubulina, mostrata in verde, e la controcolorazione dei nuclei con hooks, mostrata in blu. La misurazione dei processi assonali è stata effettuata con l'ausilio di un software di analisi delle immagini. Un confronto tra la fuoriuscita dei processi assonali di H nscs coltivati su scaffold 3D e su superfici piane tradizionali o colture 2D mostra che, dopo una settimana o tre settimane, gli HSC differenziati in 3D hanno mostrato una maggiore fuoriuscita dei processi assonali.L'analisi computazionale per la previsione di target ha prodotto le informazioni qui presentate: un elenco di geni bersaglio predetti per i microRNA, insieme ai relativi punteggi di precisione e valori aggregati. SOX5 e NR4A3 sono stati identificati come geni bersaglio putativi. Per validare i target dei microRNA, è stato utilizzato un saggio con doppio reporter luciferasi, come mostrato qui. L'attività relativa della luciferasi da reporter dell'UTR tre primi umani dei geni SOX5 e NR4A3 è stata significativamente ridotta in presenza dei microRNA indicati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come differenziare le cellule staminali neurali e studiare l'espressione dei microRNA e la validazione dei loro mRNA bersaglio.

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Biologia dello sviluppo

Questo video mostra lo sviluppo e la differenziazione delle cellule staminali neurali umane all'interno di un'impalcatura tridimensionale. Un rivestimento di laminina sull'impalcatura favorisce l'adesione cellulare, mentre un mezzo neurale privo di fattore di crescita induce la differenziazione cellulare in cellule progenitrici neurali, che estendono i loro processi all'interno di un'architettura porosa in più direzioni, formando una coltura...

Differenziazione delle cellule staminali neuronali umane in colture 3D utilizzando un'impalcatura porosa

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Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane non transgeniche e transgeniche in cellule progenitrici neurali

In questo video, viene dimostrato un protocollo graduale per le cellule staminali embrionali umane in organoidi neurali. Il metodo prevede l'induzione della formazione di rosette neuronali, seguita da una maturazione controllata e dalla coltura finale su una membrana idrofobica per ottenere organoidi neurali completamente sviluppati.

Differenziazione e maturazione di cellule staminali embrionali umane in organoidi neurali

Un metodo è stato sviluppato per derivare direttamente le cellule staminali neurali umane da cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da cellule del sangue periferico.

Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici

Descriviamo una tecnica per utilizzare le cellule staminali embrionali murine per generare due o tre corpi embrionali tridimensionali. Abbiamo poi spiegato come indurre la differenziazione neuronale delle cellule del corpo embrionali di acido retinoico, e come analizzare il loro stato di differenziazione dal marcatore di cellule progenitrici immunofluorescenza e immunoblotting.

Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs) sono considerate un potente strumento per la screening di droga e chimica e per lo sviluppo di nuovi modelli in vitro per la sperimentazione di tossicità, compresa la neurotossicità. Qui viene descritto un protocollo dettagliato per la differenziazione di hiPSC in neuroni e glia.

Protocollo per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo in culture miste di neuroni e glia per la sperimentazione della neurotossicità

Presentato qui è un protocollo per la generazione di una coltura unicellulare di cellule staminali embrionali umane e la loro successiva differenziazione in cellule progenitrici neurali. Il protocollo è semplice, robusto, scalabile e adatto per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa.

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

Descriviamo la procedura per la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in cellule neuronali utilizzando il metodo della goccia sospesa. Inoltre, eseguiamo un'analisi fenotipica completa attraverso RT-qPCR, immunofluorescenza, RNA-seq e citometria a flusso.

Differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo

Questo studio riporta un nuovo approccio per misurare più parametri funzionali mitocondriali basati sulla citometria a flusso e sulla doppia colorazione con due reporter fluorescenti o anticorpi per rilevare cambiamenti nel volume mitocondriale, potenziale di membrana mitocondriale, livello di specie reattive dell'ossigeno, composizione della catena respiratoria mitocondriale e DNA mitocondriale.

Analisi citometrica a flusso di parametri mitocondriali multipli in cellule staminali pluripotenti indotte umane e loro derivati neurali e gliali

Scopri l'analisi computazionale dei microRNA durante la differenziazione di cellule staminali neurali umane in coltura 3D. Questo metodo combina PCR array, predizione bioinformatica e saggio dual luciferase per validare i target mRNA.

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione (Video) | JoVE Journal

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

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