Name: Il In Ovo Chick corioallantoidea membrana (CAM) Saggio come un efficiente dello xenotrapianto Modello di carcinoma epatocellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Scopri il saggio CAM su membrana corioallantoidea di pulcino per lo studio del carcinoma epatocellulare. Questo modello xenotrapianto permette di ottenere tumori vascolarizzati tridimensionali con tassi di sopravvivenza embrionale fino al 93%.

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A.S. è stato parzialmente supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH), del National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) e del National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1). 
L'Howard Hughes Medical Institute ha fornito finanziamenti per M.L. attraverso il programma HHMI Medical Research Fellows.

Incubazione 1. Egg <ol><li> Ottenere 8 giorni vecchi specifici uova embrionate esenti da organismi patogeni. </li><li> Mettere le uova in rotazione vassoio dell&#39;uovo, estremità stampati rivolti verso l&#39;alto, e posizionare il vassoio rotante all&#39;interno di un incubatore uovo. Incubare le uova per 48 ore a 36 ° C e 50% di umidità. </li></ol> 2. Far cadere il CAM e apertura le uova <ol><li> Raccogliere le uova da incubatrice. Luogo uova in portauova, timbrato rivolta verso l&#39;alto, e portare alla cappa a flusso laminare. </li><li> Spegnere le luci in camera e il cappuccio. </li><li> Tenere l&#39;estremità stampata di uovo leggermente al candler uovo per esporre la vascolarizzazione del CAM nonché il sacco aereo. NOTA: Il Candler uovo è una fonte di luce usato per visualizzare l&#39;embrione in via di sviluppo e sacco aereo associati e vascolare. </li><li> Mettere un segno di matita tra due grandi vasi sanguigni. </li><li> Accendere le luci e utilizzare una puntina sterile per ottenere un foro sulla punta dell&#39;uovo sopra il sacco aereo (fine stampati) e un foro al pemark ncil. Non spingere la puntina tutto il percorso attraverso; un foro di circa 3 mm di profondità è generalmente sufficiente. </li><li> Spegnere le luci. Stringere la lampadina di sicurezza, premendo con forza l&#39;estremità aperta contro il buco sopra la sacca d&#39;aria. Applicare il vuoto per tirare l&#39;aria nel foro in corrispondenza del segno di matita, causando il CAM a cadere lontano dal serbatoio in segno di matita. </li><li> Controllare che il sacco d&#39;aria si è spostato dalla fine timbrata del uovo al foro matita marcata con il candler. Se non lo ha, utilizzare il bottone per fare entrambi i fori leggermente più profondo e poi ri-applicare il vuoto con la lampadina di sicurezza. </li><li> Accendere le luci. Tenendo l&#39;uovo in una mano, accendere lo strumento rotativo Dremel con una ruota di taglio 15/16 pollici attaccato e fare due tagli trasversali solo abbastanza in profondità per tagliare attraverso il guscio, ma non abbastanza in profondità per tagliare tutta la strada fino al depresso CAM. Fare i tagli intorno a 2 cm di lunghezza e 1 cm di distanza l&#39;uno dall&#39;altro. Fare i tagli sufficientemente ampia in modo che un anello di silicone 1 cm di diametro può passare attraversoma più sottile rispetto alla larghezza del nastro adesivo standard. </li><li> Successivamente, fare 1 taglio longitudinale e tra le estremità dei due tagli trasversali toccando leggermente il disco di taglio per il guscio. </li><li> Far scorrere pinza sterile sotto il pezzo di guscio e parallelamente alla shell. Prendete il pezzo shell con le pinze e rimuovere l&#39;intero pezzo in modo pulito. </li><li> Posizionare lo scotch sopra la finestra appena aperta, facendo attenzione a piegare una estremità su se stesso per facilità di rimozione. </li><li> Luogo uova indietro in incubatrice nel vassoio uovo (non nei rack uovo rotanti) fino al momento dell&#39;inoculazione. </li></ol> 3. Inoculazione <ol><li> Mantenere seminterrato miscela proteina di membrana, quali matrigel, in ghiaccio (per prevenire la polimerizzazione) e posto in cappuccio. </li><li> Utilizzare 2 mM EDTA per staccare le cellule (4 - 5 ml per pallone T75) e posto fiasche nel tessuto cultura incubatore per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule staccate nei media e contare con un emocitometro e trypan blu. Utilizzare tra 500.000 t2.000.000 o celle per l&#39;innesto sulla CAM, seconda linea cellulare. Ottimizzare il numero corretto di esperimenti preliminari. </li><li> Volume di misura necessaria per numero di cella appropriata e centrifugare a 500 xg per 5 min. </li><li> Gettare il surnatante e poi risospendere pellet cellulare in 40 μ l di PBS ++ e 20 μ l di miscela membrana basale. NOTA: A questo punto, le cellule possono essere trattati con farmaci o altri agenti di test come necessario per esperimenti risospendendo nella cellula / seminterrato sospensione miscela membrana. In alternativa, gli agenti possono essere pipettati sul cellulare / seminterrato sospensione miscela membrana dopo l&#39;innesto. </li><li> Recupera portauova con le uova dal termostato e posto nella cappa a flusso laminare. </li><li> Staccare il nastro della finestra, recuperare un anello di silicone 1 mm dal tappo di una fiala criogenico con pinze sterili, e rilasciare l&#39;anello attraverso la finestra. </li><li> Preparare la soluzione di cellule l 60 μ di PBS ++ e membrana basale Mixture direttamente al centro del cilindro di silicone appoggiato sul CAM. </li><li> Re-tape finestra e spostare portauova torna incubatrice. A questo punto, fare attenzione quando si spostano le uova, come l&#39;anello e la sospensione cellulare può facilmente diventare sfollati. </li><li> Lasciare i tumori a crescere per 5 a 7 giorni. </li></ol> 4. raccolta tumori <ol><li> Mettere sotto-pad in cappuccio. Preparare 35 x 10 mm piatti e contenitori paraformaldeide come necessario per l&#39;istologia. Mettere 1 ml di PBS ++ in ogni piatto mm 35 x 10. </li><li> Mettere sacchetto in cappa. Prendete le forbici dissezione sterili e inserire l&#39;estremità appuntita nell&#39;uovo al foro vicino alla fine timbrato. </li><li> Tagliare tutto l&#39;uovo intero longitudinalmente. NOTA: il CAM e il tumore con l&#39;anello dovrebbero attenersi per la metà superiore del guscio con la finestra. </li><li> Utilizzando forbici dissezione e pinze, sezionare il tumore dal CAM e posizionare tumore nel piatto mm 35 x 10. Misurare e pesare i tumori. Tumori fissi in paraformaldehyli de e poi paraffina incorporare per l&#39;uso in istologia ed immunoistochimica esperimenti. </li></ol> 5. (Facoltativo): Tumore delle cellule Dissociazione <ol><li> Usare le forbici dissezione per tritare il tumore nel piatto mm 35 x 10. Versare tumore tritati in una provetta da centrifuga da 15 ml e rimuovere quanto più PBS ++ possibile attraverso pipettaggio. </li><li> Aggiungere 2 ml di collagenasi (1 mg / ml in PBS ++), girare il tubo più volte, e incubare tubo a 37 ° C per almeno 30 min (fino a diverse ore). </li><li> Aggiungere 5 ml media per ciascuna provetta e sospendere nuovamente accuratamente pipettando su e giù 20 - 40x. Pipettaggio accurata è fondamentale per la dissociazione cellulare completo. </li><li> Lasciare sedimento di stabilirsi, e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti. Rimuovere il surnatante, lasciando dietro di pellet dissociato. NOTA: A questo punto, pellet cellulari possono essere utilizzati per vari esperimenti (citofluorimetria, lisi per uso in Western blotting, isolamento dell&#39;RNA, etc). Totale conteggio delle cellule tumorali può essere ottenuta anche utilizzando un emocitometro e trypan colorazione blu. Si noti che, cellule di forma ovale più piccole sono cellule di pollo dal CAM e non devono essere considerati come cellule tumorali. Ci dovrebbe essere un numero minimo di contaminare cellule non tumorali (CAM) se il tumore è sezionato dal CAM accuratamente. </li></ol>

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</ol>

A.S. riceve finanziamenti dall'azienda farmaceutica Advaxis per sostenere uno studio clinico avviato da un sperimentatore.

Diversi passaggi chiave di questo protocollo molto probabilmente rappresentano il miglioramento della sopravvivenza embrionale così come una maggiore affidabilità della crescita tumorale. Lasciando il CAM lontano dal serbatoio applicando aspirazione al sacco aereo è meno invasivo rispetto ad altri metodi esistenti (utilizzando un ago per rimuovere l&#39;albumina dall&#39;uovo, smussa, ecc). Utilizzando una puntina sterile per creare due piccoli fori necessari per questo metodo è la parte più impegnativa del protocollo. ...

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è la 3 ° causa principale di mortalità per cancro nel mondo 1. Attualmente solo il 30% dei pazienti con carcinoma epatico sono ammissibili per i trattamenti chirurgici potenzialmente curative 2, e la chemioterapia sistemica non è efficace 3. Pertanto, vi è una pressante necessità clinica insoddisfatta di terapie HCC romanzo, e lo sviluppo di sistemi modello adatti efficiente sperimentazione di nuovi agenti. Il corioallantoidea test pulcino membrana (CAM) fornisce una riproducibilità, costo-efficacia, e veloce metodo di medio-throughput di testare potenziali farmaci antitumorali in vivo. Il saggio CAM è stato ampiamente utilizzato per studiare l&#39;angiogenesi 4. E &#39;stato anche sviluppato con successo in un modello di xenotrapianto di tumore di tumori, tra cui 5 glioblastoma, cancro al pancreas 6, il melanoma 7-9, e osteosarcoma 10-11. Sia in ovo 12 ed ex ovo13 tecniche sono state utilizzate in letteratura, con dettagli variano da protocollo protocollo. Una sfida importante per il modello CAM xenotrapianto è relativamente alta incidenza di morte embrionale dopo la manipolazione delle uova, con tassi di mortalità embrione di pulcino pubblicati vanno 25-50 per cento 11-14. In questo articolo, si descrive lo sviluppo di un modello di xenotrapianto in ovo di HCC che produce in modo affidabile la crescita di tridimensionali, tumori vascolarizzati che istologicamente assomigliano HCC indifferenziata. Abbiamo adattato un protocollo prima descritto da Ossowski et al. 14 e abbiamo raggiunto pulcino embrionale tassi di sopravvivenza fino al 93% con altissima attecchimento del tumore.

<table><tbody><tr><td>Uova incubate Premium</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx</td></tr><tr><td>Incubatrici per uova</td><td>GQF</td><td>Hova-Bator 2362N</td><td></td></tr><tr><td>Vassoi per uova rotanti</td><td>GQF</td><td>1611 Girauova automatico Candelabro</td><td></td></tr><tr>per<td>uova</td><td>Lyon</td><td>Hi-Power 950-070</td><td></td></tr><tr><td>Utensile rotante Dremel 100 con disco da taglio 15/16</td><td>Dremel</td><td>100-N/7</td><td></td></tr><tr><td>Pinze sterili, perno di spinta, forbici da dissezione, nastro</td><td></td><td></td><td></td>adesivo</tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Fiale criogeniche, filettatura esterna con rondella in silicone</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi da Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td></td></tr></tbody></table>

il<em&gt; in ovo</em&gt; chick corioallantoidea membrana (cam) saggio come un efficiente dello xenotrapianto modello di carcinoma epatocellulare

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

La membrana corioallantoidea pulcino (CAM) comincia a sviluppare il giorno 7 dopo la fecondazione e matura di giorno 12. Il CAM è naturalmente immunodeficienti e altamente vascolarizzato, che lo rendono un sistema ideale per tumore impianto. Inoltre, il CAM contiene proteine ​​della matrice extracellulare, come fibronectina, laminina, collagene, integrina alfa (v) beta3, e MMP-2, che lo rendono un modello attraente per studiare invasione tumorale e metastasi. Gli scienziati hanno a lungo approfittato della fisiologia del CAM usandolo come modello di angiogenesi. Più di recente, il test CAM è stato modificato per lavorare come in vivo xenotrapianto sistema modello per vari tipi di cancro che colma il divario tra il lavoro di base in vitro e modelli di cancro animali più complessi. Il test permette CAM per lo studio della crescita tumorale, terapie anti-tumorali, e percorsi molecolari pro-tumorali in un sistema biologicamente rilevante che è sia in termini di costi e di tempo efficace. Qui, descriviamo lo sviluppo di Xen CAMModello ograft del carcinoma epatocellulare (HCC), con tassi di sopravvivenza embrionali fino al 93% e tumore affidabile take che porta alla crescita dei tumori vascolarizzati tridimensionali.

Immagini rappresentative di passaggi chiave nel protocollo sono mostrati qui. Figura 1A mostra l&#39;uso del candler di visualizzare l&#39;embrione in via di sviluppo, il sacco aereo, e la vascolarizzazione della CAM. Figura 1B-1C mostrano il processo di caduta del CAM facendo i due fori e quindi applicando pressione negativa con il bulbo della sicurezza, e la Figura 1D mostra una cancellati correttamente CAM con una bolla d&#39;aria sotto il foro matit...

La membrana corioallantoidea del pulcino (CAM) è immunodeficiente e altamente vascolarizzata, il che la rende un modello naturale in vivo di crescita tumorale e angiogenesi. In questo protocollo, descriviamo un metodo affidabile per la crescita di tumori di carcinoma epatocellulare (HCC) tridimensionali e vascolarizzati utilizzando il test CAM.

Il<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick corioallantoidea membrana (CAM) Saggio come un efficiente dello xenotrapianto Modello di carcinoma epatocellulare

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è sviluppare un modello xenotrapiantato di carcinoma epatocellulare utilizzando la membrana corioallantoidea (cam). Questo viene ottenuto innanzitutto incubando le uova per prepararle all'inoculazione. Come secondo passaggio, si abbassa la membrana corioallantoidea (cam) dell'uovo e si pratica un'apertura nel guscio. In seguito, l'uovo viene inoculato con cellule di carcinoma epatocellulare umano attraverso la finestra praticata nel guscio allo scopo di indurre la crescita tumorale. I risultati mostrano che tumori tridimensionali vascolarizzati sono stati ottenuti con successo utilizzando linee cellulari di carcinoma epatocellulare umano. Utilizzando questo protocollo, sono stati raggiunti tassi di sopravvivenza embrionale fino al 93%.I principali vantaggi del saggio CAM rispetto ad altre tecniche in vivo, come i modelli di tumore nel topo, sono il breve tempo sperimentale, il basso costo complessivo dell'esperimento e la facile riproducibilità. I saggi CAM possono essere utilizzati per studiare l'angiogenesi, il tumore, l'invasione cellulare e la metastasi. Possono inoltre essere impiegati per determinare l'effetto di piccole molecole e farmaci sulla crescita e sullo sviluppo dei tumori.La dimostrazione visiva di questa procedura è importante perché le diverse fasi di preparazione dell'uovo, tra cui la candeggiatura, l'identificazione della vascolarizzazione, la creazione di piccole perforazioni vicino alla camera d'aria e sulla sommità dell'uovo senza svuotarlo, possono risultare difficili per i nuovi utilizzatori. Tagliare finestre senza crepare il guscio e assicurarsi che la camera d'aria rimanga integra durante tutte le fasi del procedimento può essere particolarmente impegnativo. Per iniziare posizionare.Uova di gallina autoctona libere da patogeni specifici, di otto giorni, posizionate su un vassoio girevole con la parte stampata rivolta verso l'alto. Inserire il vassoio girevole all'interno di un'incubatrice per uova a 36 gradi Celsius con umidità al 50% e incubare le uova per 48 ore. Al termine dell'incubazione, posizionare le uova su un portauova con la parte stampata rivolta verso l'alto e inserirle in una cappa a flusso laminare.Spegnere le luci della stanza e della cappa, quindi tenere delicatamente l'estremità timbrata dell'uovo contro il candeggiatore per uova per visualizzare la vascolarizzazione della membrana corioallantoidea del pulcino, nota come CAM, e il sacco d'aria. Tracciare un segno tra i due vasi sanguigni principali con una matita. Successivamente, praticare un foro alla punta dell'uovo, sopra il sacco d'aria, all'estremità timbrata, e un secondo foro nel punto segnato con la matita.Utilizzando un ago sterile, il foro dovrebbe essere profondo circa tre millimetri. Spremere l'aria da una peretta di sicurezza e premere saldamente l'estremità aperta contro il foro al di sopra della sacca d'aria. Rilasciare lentamente la peretta per applicare una depressione che aspiri l'aria nel foro corrispondente al segno della matita, provocando il distacco del campanello dal guscio.Verificare che la camera d'aria si sia spostata dall'estremit&agrave; stampata dell'uovo fino al foro segnato con la matita, utilizzando il candler. Se cos&igrave; non fosse, rendere entrambi i fori leggermente pi&ugrave; profondi e riapplicare il vuoto con la peretta di sicurezza. Successivamente, tenere l'uovo in una mano utilizzando un utensile rotante dotato di un disco da taglio da 1516 pollici.Eseguire due tagli trasversali attraverso il guscio senza toccare la camma. I tagli devono essere lunghi due centimetri e distanti un centimetro l'uno dall'altro. Successivamente, praticare dei tagli longitudinali alle estremità dei due tagli trasversali toccando leggermente il disco di taglio al guscio.Per rimuovere il guscio, inserire una pinzetta sterile sotto il frammento di guscio e parallelamente ad esso. Afferrare il frammento con la pinzetta ed estrarlo in modo netto. Tenere un'estremità di un pezzo di nastro adesivo ripiegata su se stessa, quindi posizionare il nastro sull'apertura dell'uovo.Posizionare l'uovo in un portauova e inserire il portauova nell'incubatrice senza rotazione per non più di due o tre ore prima dell'inoculazione. Per prepararsi all'inoculazione, porre una miscela di proteine della membrana basale, come Matrigel, sul ghiaccio per prevenire la polimerizzazione. Successivamente, utilizzare quattro o cinque millilitri di una soluzione due millimolare di EDTA per ogni fiala per staccare le cellule tumorali e collocare la fiala nell'incubatrice per colture cellulari per cinque minuti.Ri-sospendere le cellule staccate nel mezzo e contare il numero di cellule. Utilizzare da 500.000 a 2 milioni di cellule per il trapianto sulla cam, a seconda della linea cellulare. Successivamente, trasferire il volume necessario per ottenere il numero appropriato di cellule in un nuovo tubo e centrifugare per cinque minuti.A 500 ×g, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 40 microlitri di PBS contenente calcio e magnesio, noto come PBS più più, e 20 microlitri di miscela della membrana basale. A questo punto, è possibile aggiungere farmaci o altri agenti di prova alla sospensione cellulare.Successivamente, posizionare il vassoio con le uova nell'incubatore a flusso laminare. Rimuovere il nastro dall'uovo e far cadere un anello di silicone sterile di un millimetro, prelevato da una provetta criogenica, attraverso l'apertura fino al tubo cam. Aggiungere la soluzione da 60 microlitri di cellule, PBS più più e miscela di membrana basale al centro dell'anello di silicone, richiudere l'apertura con il nastro, quindi spostare con attenzione il vassoio con le uova di nuovo nell'incubatore.Lasciare crescere i tumori per cinque o sette giorni. Per il prelievo dei tumori, posizionare un tappetino assorbente e un sacchetto per rifiuti biologici nell'incubatore.Preparare piastre da 35 millimetri per 10 millimetri contenenti un millilitro di PBS più più e contenitori di paraformaldeide secondo necessità per l'istologia. Inserire l'estremit&agrave; appuntita di un paio di forbici sterili da dissezione nell'uovo attraverso il foro vicino all'estremit&agrave; stampata e tagliare lungo tutta la lunghezza dell'uovo. Il cam e il tumore con l'anello dovrebbero rimanere attaccati alla met&agrave; superiore del guscio con l'apertura.Estrarre il tumore dalla cam utilizzando dissezione, forbici e pinzette, e posizionare il tumore in una piastra da 35 millimetri per 10 millimetri. Misurare e pesare il tumore. Fissare il tumore in paraformaldeide e includerlo in paraffina per l'uso in esperimenti di istologia e immunohistochimica.Dopo aver prelevato il tumore, tritare il tessuto tumorale nella piastra con forbici da dissezione. Quindi versare il tessuto tritato in una provetta centrifuga da 15 millilitri ed eliminare il PBS più più mediante pipettaggio. Aggiungere due millilitri di una soluzione di collaghenasi a un milligrammo per millilitro in PBS più più e mescolare capovolgendo più volte la provetta.Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti e fino a diverse ore. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di mezzo al tubo e mescolare accuratamente pipettando da 20 a 40 volte. Questo passaggio è fondamentale per dissociare completamente le cellule.Dopo il deposito del sedimento, trasferire il surnatante in una provetta pulita, centrifugare la provetta a 500 × g per cinque minuti e scartare il soprannatante, lasciando il pellet di cellule dissociate. Quando la cam era stata inoculata con cellule tumorali HUH7, un tumore vascolarizzato era visibile all'interno dell'anello. Dopo cinque giorni di crescita, l'analisi istologica del tumore HUH7 proveniente dal saggio CAM ha mostrato che le cellule tumorali assomigliano a cellule di carcinoma epatocellulare indifferenziato.Nel lavorare con questo metodo, è importante ricordare che potrebbero essere necessarie alcune ottimizzazioni in relazione a cellule diverse o a farmaci diversi. Ad esempio, alcune linee cellulari potrebbero richiedere densità maggiori o minori per formare tumori tridimensionali.

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Questo video dimostra l'isolamento della membrana corioallantoidea tumorale dall'embrione di pollo. Il CAM raccolto può essere utilizzato per ulteriori applicazioni a valle.

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Vi presentiamo il modello di membrana corioallantoica del pollo come modello alternativo, trapiantabile, in vivo per l'innesto di linee cellulari del cancro ginecologico e urologico e tumori derivati dal paziente.

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Scopri il saggio CAM su membrana corioallantoidea di pulcino per lo studio del carcinoma epatocellulare. Questo modello xenotrapianto permette di ottenere tumori vascolarizzati tridimensionali con tassi di sopravvivenza embrionale fino al 93%.

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