Il In Ovo Chick corioallantoidea membrana (CAM) Saggio come un efficiente dello xenotrapianto Modello di carcinoma epatocellulare

La membrana corioallantoidea del pulcino (CAM) è immunodeficiente e altamente vascolarizzata, il che la rende un modello naturale in vivo di crescita tumorale e angiogenesi. In questo protocollo, descriviamo un metodo affidabile per la crescita di tumori di carcinoma epatocellulare (HCC) tridimensionali e vascolarizzati utilizzando il test CAM.

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di sviluppare un modello affidabile di xenotrapianto di carcinoma epatocellulare. Ciò si ottiene incubando prima le uova per prepararle all'inoculazione. Come seconda fase, la membrana del carbone e della toica o la camma dell'uovo viene fatta cadere e una finestra viene tagliata nel guscio dell'uovo.

Successivamente, l'ovulo viene inoculato con cellule di carcinoma epatocellulare umano attraverso la finestra del guscio d'uovo per stabilire la crescita del tumore. I risultati mostrano che i tumori vascolarizzati tridimensionali sono stati cresciuti con successo utilizzando linee cellulari di carcinoma epatocellulare umano. Utilizzando questo protocollo, sono stati raggiunti tassi di sopravvivenza embrionale fino al 93%.

I principali vantaggi del test CAM rispetto ad altre tecniche in vivo, come i modelli tumorali murini, sono il breve tempo di analisi sperimentale, il basso costo complessivo dell'esperimento e la prontezza. I saggi CAM di riproducibilità possono essere utilizzati per studiare l'angiogenesi, il tumore, l'invasione cellulare e le metastasi. Possono anche essere utilizzati per determinare l'effetto di piccole molecole e farmaci sulla crescita e lo sviluppo dei tumori.

La dimostrazione visiva di questa procedura è importante a causa delle diverse fasi di preparazione dell'uovo, tra cui la speratura, l'identificazione della vascolarizzazione, l'esecuzione di piccole forature vicino alla sacca d'aria e sopra l'uovo senza scolarlo. Aprire le finestre senza rompere il guscio d'uovo e assicurarsi che la camma sia intatta durante tutti i processi potrebbe essere difficile per i nuovi utenti. Per cominciare luogo.

Uova di gallina autoctone prive di agenti patogeni specifici di otto giorni in un vassoio rotante per uova con un timbro rivolto verso l'alto. Posiziona il vassoio rotante all'interno di un'incubatrice per uova a 36 gradi Celsius con il 50% di umidità e incuba le uova per 48 ore. Dopo l'incubazione, mettere le uova in un portauova con un timbro stampato verso l'alto e metterle in una cappa a flusso laminare.

Spegni la stanza e le luci del cofano tengono leggermente l'estremità stampata dell'uovo sul candelabro per esporre la vascolarizzazione della membrana Chorio Allen Toic del pulcino nota come camma e sacca d'aria. Fai un segno tra i due principali vasi sanguigni con una matita. Quindi, fai un foro sulla punta dell'uovo sopra la sacca d'aria all'estremità stampata e un secondo foro sul segno della matita.

Utilizzando una puntina sterile, il foro dovrebbe essere profondo circa tre millimetri. Spremere l'aria da un bulbo di sicurezza e premere saldamente l'estremità aperta contro il foro sopra la sacca d'aria. Rilasciare lentamente la lampadina per applicare l'aspirazione, tirando l'aria nel foro in corrispondenza del segno della matita e provocando la caduta della camma dal guscio.

Verifica che la sacca d'aria si sia spostata dall'estremità stampata dell'uovo al foro segnato a matita usando il candelabro. In caso contrario, fare entrambi i fori leggermente più profondi e riapplicare l'aspirazione con il bulbo di sicurezza. Quindi, tieni l'uovo in una mano usando uno strumento rotante con un attacco per disco da taglio da 1516 pollici.

Eseguire due tagli di trasferimento attraverso il guscio senza toccare la camma. Il taglio deve essere lungo due centimetri e distante un centimetro. Quindi eseguire tagli longitudinali alle estremità dei due tagli trasversali toccando leggermente il disco da taglio con il guscio.

Per rimuovere il guscio, far scorrere una pinza sterile sotto e parallelamente al pezzo di conchiglia. Afferra il pezzo con la pinza e rimuovilo in modo pulito. Tieni un'estremità di un pezzo di nastro adesivo su se stessa, quindi posiziona il nastro sopra l'apertura dell'uovo.

Sgusciare, mettere l'uovo in un vassoio per uova e mettere il vassoio nell'incubatrice senza rotazione per non più di due o tre ore prima dell'inoculazione. Per prepararsi all'inoculazione, posizionare una miscela di proteine della membrana basale, come il matrigel, sul ghiaccio per prevenire la polimerizzazione. Quindi, utilizzare da quattro a cinque millilitri di una soluzione da due millimolari di EDTA per pallone per staccare le cellule tumorali e posizionare il pallone nell'incubatore di coltura tissutale per cinque minuti.

Reus, sospendere le cellule staccate nel mezzo e contare il numero di cellule. Utilizzare tra 500, 000 e 2 milioni di cellule per l'innesto sulla camma, a seconda della linea cellulare. Quindi, trasferire il volume necessario per ottenere il numero appropriato di cellule in una nuova provetta e centrifugare per cinque minuti.

A 500 volte la gravità, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare. In 40 microlitri di PBS contenente calcio e magnesio noto come PBS plus plus e 20 microlitri di miscela di membrane basali. A questo punto, alla sospensione cellulare possono essere aggiunti farmaci o altri agenti di prova.

Quindi, posizionare il vassoio delle uova nella cappa a flusso laminare. Staccare il nastro adesivo dall'uovo e far cadere un anello di silicone sterile da un millimetro da una fiala criogenica attraverso l'apertura e sul tubo della camma. Ho messo la soluzione da 60 microlitri di cellule, PBS plus plus e la miscela della membrana basale al centro dell'anello di silicone, ho fissato nuovamente la finestra con nastro adesivo e ho spostato con cautela il vassoio delle uova nell'incubatrice.

Lascia che i tumori crescano per cinque o sette giorni. Per il prelievo dei tumori. Metti un sottopiede e un sacchetto per il rischio biologico nel cappuccio.

Preparare piastre da 35 mm per 10 millimetri contenenti un millilitro di PBS plus plus e contenitori di para formaldeide secondo necessità per l'istologia. Inserire l'estremità appuntita della dissezione sterile, le forbici nell'uovo in corrispondenza del foro vicino all'estremità stampata e tagliare per tutta la lunghezza dell'intero uovo. La camma e il tumore con l'anello dovrebbero aderire alla metà superiore del guscio con l'apertura.

Estrarre il tumore dalla camma usando dissezione, forbici e pinze e posizionare il tumore in una piastra di 35 millimetri per 10 millimetri. Misurare e pesare il tumore. Fissare il tumore in paraforma, aldeide e paraffina incorporate per l'uso in esperimenti di istologia e immunoistochimica.

Dopo aver raccolto il tumore, tritare il tumore nella placca con le forbici da dissezione. Quindi versare il tumore macinato in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e rimuovere il PBS plus plus mediante pipettaggio. Aggiungere due millilitri di una soluzione di un milligrammo per millilitro di collagenasi in PBS plus plus e mescolare capovolgendo più volte il tubo.

Incubare la provetta a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti e fino a diverse ore. Quindi, aggiungere cinque millilitri di terreno alla provetta e mescolare accuratamente pipettando da 20 a 40 volte. Questo è fondamentale per dissociare completamente le cellule.

Dopo che il sedimento si è depositato, trasferire la stecca in una provetta nuova, centrifugare la provetta a 500 volte, per gravità per cinque minuti, e scartare il surnatante lasciando dietro di sé il pellet di cellule dissociato. Quando la camma era posizionata con HUH sette cellule tumorali, un tumore vascolarizzato era visibile all'interno dell'anello. Dopo cinque giorni di crescita, l'istologia del tumore HUH seven dal test CAM ha mostrato che le cellule tumorali assomigliano a cellule di carcinoma epatocellulare indifferenziato.

Mentre si lavora con questo metodo, è importante ricordare che potrebbero essere necessarie alcune ottimizzazioni per quanto riguarda cellule diverse o farmaci diversi. Ad esempio, alcune linee cellulari potrebbero aver bisogno di densità più alte o più basse per formare tumori tridimensionali.