Utilizzando impedenza Cell-substrato e imaging cellulare dal vivo per misurare i cambiamenti in tempo reale in Cellular Adesione e De-adesione indotta da Matrix Modifica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare i rapidi cambiamenti nell'adesione della matrice cellulare nelle cellule endoteliali esposte ad agenti modificanti la matrice in tempo reale utilizzando l'impedenza del substrato cellulare e l'imaging di cellule vive. In questo esperimento, l'enzima eme mielo perossidasi è impiegato come agente modificante della matrice fisiopatologicamente rilevante. Ciò si ottiene rivestendo prima le superfici con fibronectina per fornire un substrato di matrice adesiva.

mioperossidasi o MPO può quindi legarsi alla fibronectina. Successivamente, le cellule endoteliali sospese vengono posizionate sulle superfici e incubate per ottenere il massimo attacco cellulare e diffondersi sulla fibronectina. Quindi le cellule vengono esposte al perossido di idrogeno per avviare l'ossidazione della fibronectina mediata da NPO.

I successivi rapidi cambiamenti nell'adesione della matrice cellulare vengono quindi quantificati in tempo reale utilizzando l'impedenza del substrato cellulare e l'analisi dell'imaging di cellule vive. I risultati mostrano che le rapide perdite di adesione della matrice cellulare endoteliale innescate dall'ossidazione della fibronectina mediata da NPO possono essere quantificate in tempo reale con un'elevata risoluzione temporale e in modo privo di marcatura mediante impedenza del substrato cellulare e imaging di cellule vive. Ebbene, il vantaggio di queste tecniche è che possono quantificare continuamente i cambiamenti nell'adesione della matrice cellulare con un'alta risoluzione temporale, e questo significa che possono fornire nuove importanti intuizioni su come le modifiche della matrice guidano i cambiamenti a valle nella morfologia cellulare e nei processi di segnalazione dipendenti dall'adesione.

I protocolli sono di importanza più ampia in quanto possono essere facilmente adattati sostituendo l'MPO con altri agenti modificanti la matrice, come la matrice per il gating, le proteasi, o utilizzando tipi di cellule aderenti diverse dalle cellule endoteliali come le cellule epiteliali. Per iniziare, aggiungere 80 microlitri per pozzetto di fibronectina per rivestire array di microelettrodi d'oro a 96 pozzetti per le misure di impedenza del substrato cellulare, oppure aggiungere due millilitri di fibronectina ai piatti di coltura cellulare con fondo di vetro per l'analisi dell'imaging di cellule vive. Incubare le matrici e/o le piastre di coltura a 37 gradi Celsius per due ore.

Quindi, per bloccare le superfici, aggiungere lo 0,2% di BSA e incubare a 37 gradi Celsius per altre due ore. Quindi, aggiungere la mia perossidasi umana purificata in HBSS e incubare per 30 minuti. Quindi utilizzare HBSS per lavare due volte le superfici per rimuovere l'MPO non legato.

Successivamente, vedere 250.000 cellule per millilitro di cellule endoteliali sospese preparate secondo il protocollo di testo Su array di microelettrodi di impedenza del substrato di 96 celle a pozzetti con superfici rivestite di fibronectina nativa o MPO. Per le piastre di coltura cellulare con fondo di vetro da 35 millimetri, aggiungere due millilitri di 500.000 cellule per millilitro. Immediatamente dopo la semina delle celle, montare le piastre dell'array di microelettrodi sulla porta dell'incubatore di impedenza del substrato della cella a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.

E prendi una lettura in bianco per avviare l'acquisizione continua dei dati dell'indice cellulare. Trasferire le piastre di coltura cellulare con fondo in vetro da 35 millimetri in un incubatore a 35 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica. Incubare per due ore per consentire il massimo attaccamento e diffusione delle cellule.

Dopo l'incubazione, mettere in pausa le letture dell'indice cellulare e rimuovere brevemente la piastra dell'array di microelettrodi o rimuovere la piastra inferiore in vetro dall'incubatore, aspirare la fessura e aggiungere HBSS riscaldato per esaminare gli effetti di inibitori, modulatori di MPO, reazioni catalizzate o inibitori della segnalazione cellulare. Aggiungili alle culture. A questo punto, riposizionare immediatamente la piastra dell'array nella porta dell'incubatore o la piastra con fondo in vetro nell'incubatore e lasciare che le cellule si equilibrino per 30 minuti.

Per avviare l'ossidazione e l'adesione della fibronectina ipocloro-dipendente catalizzata da NPO per gli studi di impedenza cellulare, rimuovere la piastra dell'array di microelettrodi dall'incubatore e mettere in pausa le misurazioni dell'indice cellulare. Aggiungere il perossido di idrogeno all'HBSS e miscelare delicatamente mediante pipettaggio ripetuto, rimontare immediatamente l'array di microelettrodi nella porta dell'incubatore e riavviare le letture dell'indice cellulare per gli studi di imaging di cellule vive utilizzando piastre con fondo di vetro da 35 millimetri. Dopo aver rimosso la capsula dall'incubatrice, montata su un tavolino riscaldato a 37 gradi Celsius di un microscopio confocale invertito, dotato di una lente obiettivo ad acqua 63x.

E ottica DIC Per la registrazione di filmati su cellule vive, concentrarsi sulle celle e ottimizzare l'ottica DIC secondo le linee guida a cui si fa riferimento qui. Avviare il filmato DIC e registrare le letture di base delle cellule non trattate per un minuto, quindi aggiungere il perossido di idrogeno e mescolare delicatamente mediante pipettaggio ripetuto, rifocalizzare il microscopio e continuare a registrare i filmati DIC delle cellule trattate per il periodo di tempo richiesto. Per analizzare i dati sull'impedenza del substrato cellulare, iniziare esportando i dati in un foglio di calcolo per l'adesione della cella d.

Gli studi normalizzano i dati impostando i valori registrati immediatamente prima dell'inizio dell'ossidazione della fibronectina mediata da NPO a uno dei dati attuali come grafici dell'indice cellulare normalizzato rispetto al tempo necessario per analizzare i dati di imaging delle cellule vive. Aprire i filmati di imaging di cellule vive DIC registrati immediatamente prima e dopo l'inizio dell'ossidazione della fibronectina mediata da MPO in un programma di analisi delle immagini come l'immagine J in almeno due filmati DIC separati, selezionare casualmente più cellule e misurare la loro area proiettata in fotogrammi sequenziali tracciando manualmente il bordo della membrana e quantificando il numero di pixel racchiusi. Infine, presentare i dati come un grafico dell'area cellulare normalizzata rispetto al tempo: l'inserimento di sospensioni cellulari endoteliali su fibronectina o MPO contenente fibronectina determina il massimo attaccamento cellulare e la diffusione entro due ore, come giudicato da un plateau dei valori dell'indice cellulare nel substrato cellulare.

Misure di impedenza, una volta stabilita la massima adesione cellulare sulla fibronectina nativa o contenente NPO, l'ossidazione mirata della fibronectina mediata dall'acido ipocloroso catalizzato da NPO e avviata dall'aggiunta di NPO cos substrato Il perossido di idrogeno provoca una rapida diminuzione della superficie di contatto con la matrice cellulare misurata dall'impedenza del substrato cellulare e dall'imaging di cellule vive come mostrato qui, la rapida DE cellulare evidente nelle cellule endoteliali legate alla fibronectina contenente NPO in risposta al trattamento con perossido di idrogeno è assente nelle cellule trattate con solo perossido di idrogeno. L'inibizione della funzione motoria della miosina due con le statine BLE inibisce il tasso di adesione delle cellule endoteliali misurato dall'impedenza del substrato cellulare e dall'imaging delle cellule vive che identifica che l'adesione e la contrazione cellulare in risposta all'MPO catalizzano l'ossidazione della matrice subcellulare è guidata dalle forze di trazione della miosina ACTO. Poiché questi metodi possono misurare con precisione cambiamenti molto rapidi nell'adesione cellulare, possono fornire informazioni critiche sulle relazioni causali tra i cambiamenti di adesione e i cambiamenti a valle nei processi di segnalazione dipendenti dall'adesione, come la fosforilazione SARK o la segnalazione di adesione focale, che possono essere facilmente misurati in esperimenti paralleli nel tempo utilizzando il Western blotting.