Name: Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Impara un saggio di crescita su lievito per determinare i requisiti genetici della degradazione proteica in Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo combina analisi biochimiche e western blot per confermare la stabilità proteica.

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Ringraziamo i membri attuali e precedenti del laboratorio Rubenstein per fornire un ambiente di ricerca e entusiasta. Ringraziamo Ryan T. Gibson per l&#39;assistenza nella ottimizzazione dei protocolli. Ringraziamo Mark Hochstrasser (Yale University) e Dieter Wolf (Universität Stuttgart) per i ceppi di lievito e plasmidi. Ringraziamo i nostri revisori anonimi per il loro aiuto nel migliorare la chiarezza e l&#39;utilità di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un premio di ricerca del capitolo Ball State University di Sigma Xi a SGW, un National Institutes of Health sovvenzione (R15 GM111713) per EMR, un premio di ricerca Ball State University aspirano ad EMR, e fondi dalla Ball State University Ufficio di Provost e Dipartimento di Biologia.

1. Lievito crescita Assay identificare Mutanti candidati difettosi in Protein Degradation <ol><li> Transform wild-type e mutanti cellule di lievito con un plasmide codificante una proteina fusa instabili, in cornice, per un enzima giornalista metabolica. </li><li> Seminare trasformanti in 5 ml di sintetico definito (SD) terreno minimo che è selettiva per le cellule che ospitano le molecole plasmidi. Incubare per una notte a 30 ° C, rotante. </li><li> Misurare la densità ottica a 600 nm (OD 600) di ciascuna coltura durante la notte. NOTA: Dopo una notte di incubazione, le cellule in coltura può essere sia in fase di crescita logaritmica o stazionaria, ma dovrebbe aver raggiunto un diametro minimo di 600 di 0,2. Molto crescita lenta lieviti possono richiedere tempi di incubazione più di una notte, o inoculazione di un maggior numero di cellule, come determinato empiricamente. </li><li> Preparare sei diluizioni seriali di cellule di lievito trasformate in una piastra a 96 pozzetti sterili, a cominciare con le cellule diluite in unn OD 600 di 0,2. Posizionare ogni trasformante lievito per essere analizzati in una riga differente nella piastra a 96 pozzetti. <ol><li> Per ciascun trasformante, calcolare il volume di coltura overnight necessaria per diluire le cellule ad una OD 600 di 0,2 in un volume finale di 200 microlitri. Aggiungere questo volume di coltura durante la notte per pozzetto corrispondente nella colonna 1. Aggiungere la quantità appropriata di acqua sterile per portare il volume a 200 ml. </li><li> Per ciascuna fila di lievito, aggiungere 125 ml di acqua sterile ai pozzetti nelle colonne 2, 3, e 4. NOTA: piastre a 96 pozzetti sterili confezionati singolarmente possono essere forniti con coperchi sterili. I coperchi possono essere utilizzati come serbatoi per l&#39;acqua sterile che viene distribuito in questa fase. Questo consente il trasferimento simultaneo di acqua sterile a tutti i pozzetti in una data colonna con una pipetta multicanale. </li><li> Mescolare il contenuto della prima colonna (lievito diluito ad una OD 600 di 0,2) pipettando su e giù con una pipetta multicanale. </li><li> Trasfer 25 ml di lievito dalla colonna 1 alla colonna 2, utilizzando una pipetta multicanale. Mescolare pipettando su e giù. Trasferire 25 ml da Colonna 2 a colonna 3, e 25 ml di Colonna 3 Colonna 4 (mescolando bene ad ogni passo). </li></ol></li><li> Mescolare ogni campione con una pipetta multicanale. Procedendo da più diluito per almeno diluire colonne di lievito, pipetta 4 microlitri di ciascun campione su due piastre contenenti il ​​terreno selettivo appropriato. Utilizzare una piastra con mezzo che mantiene selezione plasmide (questo piatto serve come un avvistamento lievito e controllo della crescita). Utilizzare una seconda piastra con mezzo che seleziona per plasmide manutenzione e l&#39;espressione della proteina fusa instabile all&#39;enzima giornalista. Perché lievito risolvere rapidamente, mescolare le cellule pipettando su e giù a intervalli regolari. NOTA: Drier piatti saranno più facilmente assorbire il liquido di piatti preparati al momento e quindi sono consigliati per questi esperimenti. Piatti umidi possono essere essiccati per incubazione a temperatura ambiente in loumidità w per 1 - 2 giorni o incubazione più brevi in ​​una cappa a flusso laminare. Le piastre possono asciugare in modo non uniforme se il flusso d&#39;aria laminare è parallelo al banco. L&#39;uso di un modello rende più facile individuare cellule di lievito a distanze regolari. Due modelli di esempio sono forniti in Figura 1. Questi possono essere stampati, tagliati, e incollate all&#39;interno di un coperchio piatto Petri. </li><li> Lasciare le piastre ad asciugare sul banco. </li><li> Incubare le piastre a 30 ° C per 2 - 6 giorni. </li><li> Fotografa ogni piatto dopo l&#39;incubazione. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> Figura 1. Modelli per individuare le cellule di lievito su 100 mm piastre di agar. Questi modelli possono essere utilizzati per facilitare individuare lievito a distanze regolari con una pipetta multicanale. I modelli possono essere stampati, tagliati, e incollate all&#39;interno di un coperchio piatto Petri. Posizionare piastra Petri con la crescitaCoperchio all&#39;interno media con template apposto. I modelli sono contrassegnati da una tacca per monitorare l&#39;orientamento. Si raccomanda che le piastre utilizzate in saggi di crescita sono parimenti segnalate con una tacca per monitorare l&#39;orientamento. Modelli per individuare quattro (A) o cinque (B) sono previsti diluizioni seriali di cellule di lievito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione stampabile di questa figura con i modelli da 100 mm.</a> 2. Conferma biochimica di Assay Crescita Lievito <ol><li> La crescita di cellule di lievito e di post-alcalino di estrazione di proteine ​​(modificato da 31) <ol><li> Transform wild-type e mutanti cellule di lievito con un plasmide codificante la proteina instabile. </li><li> Seminare trasformanti in 5 ml di terreno SD che è selettiva per le cellule che ospitano le molecole plasmidi. Incubare per una notte a 30 ° C, rotante. </li><li> Misurare la OD 600 di ogni cu nottelture. NOTA: Dopo una notte di incubazione, le cellule possono essere sia in fase di crescita logaritmica o stazionaria, ma dovrebbe aver raggiunto un OD 600 che permetterà di diluizione per una OD 600 di 0,2 in 10 ml di terreno selettivo fresco (punto 2.1.4). Molto crescita lenta lieviti possono richiedere tempi di incubazione più di una notte, o inoculazione di un maggior numero di cellule, come determinato empiricamente. </li><li> Diluire le cellule di lievito ad una OD 600 di 0,2 in 10 ml di mezzo fresco selettiva. </li><li> Continuare a incubare cellule a 30 ° C, la rotazione o agitazione, fino a quando le culture raggiungere un diametro esterno di 600 tra 0,8 e 1,2 (cioè sono in crescita mid-logaritmica). NOTA: Se la proteina instabile di interesse sotto il controllo di un promotore regulatable, tempi ottimali per l&#39;induzione dell&#39;espressione della proteina e la raccolta delle cellule può variare secondo studi precedenti o osservazioni empiriche. </li><li> Raccogliere 2,5 OD 600 unità di cultura in 15 ml conicaal tubo mediante centrifugazione a 5000 xg per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione. NOTA: Un OD 600 unità è definita come la quantità di lievito presente in 1 ml di coltura a OD 600 di 1,0. Il volume di coltura (in ml) necessario per raccogliere 2,5 OD 600 unità (V) può essere calcolata utilizzando la seguente equazione: V = 2,5 OD 600 unità / OD 600 misurato </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml di acqua distillata. Trasferire le cellule in sospensione in una provetta. </li><li> Agglomerare cellule per centrifugazione a 6.500 xg per 30 secondi a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione. </li><li> Risospendere le cellule in 100 ml di acqua distillata pipettando su e giù o vortex, e aggiungere 100 ml 0.2 M NaOH. Mescolare pipettando su e giù. Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Cellule pellet (la maggior parte dei quali non hanno ancora rilasciato proteine ​​e sono ancora vitali) per centrifugazione a 18.000 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione. </li><li> Risospendere pellet in 50 - 100 microlitri tampone 1x Laemmli, che la lisi delle cellule, pipettando su e giù o vortex. NOTA: La rimozione del surnatante dopo la centrifugazione alcalina e successiva risospensione delle cellule in tampone campione Laemmli estrae proteine ​​a pH compatibile con sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) utilizzando un sistema tampone Tris-glicina esecuzione e western blotting. </li><li> Per denaturare completamente proteine, lisati incubare a 95 ° C per 5 min. NOTA: proteine ​​di aggregazione-inclini (ad esempio proteine ​​con diversi segmenti transmembrana) possono diventare insolubili quando incubato a 95 ° C. Pertanto, lisati devono essere incubate a temperature più basse (ad esempio 37 ° C - 70 ° C) per 10 - 30 min, come determinato empiricamente, per l&#39;analisi di tali proteine. </li><li> Lisati fresco mettendo in ghiaccio per 5 min. </li><li> Lisati centrifugare a 18.000 g per 1 minuto a temperatura ambiente a pellet materiale insolubile. Separare il surnatante (proteina estratta solubilizzato) per SDS-PAGE prima successiva analisi Western Blot (punto 2.2). In alternativa, negozio lisati a -20 ° C. </li></ol></li><li> Rappresentante Protocollo Blotting occidentale <ol><li> Caricare empiricamente determinato volume di lisati in un gel SDS-PAGE. </li><li> Eseguire gel a 200 V fino colorante anteriore ha raggiunto il fondo del gel. </li><li> Trasferire proteine ​​dai gel di fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrana mediante trasferimento bagnato a 20 V 60 - 90 min a 4 ° C. </li><li> Block membrana incubando nel latte scremato 5% in Tris-Buffered Saline (TBS), dondolo, per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Decantare soluzione bloccante. </li><li> Incubare membrana con un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse (o epitopo della stessa) in 1% di latte scremato in TBS con 0.1% Tween-20 (TBS / T) per 1 ora a camera temperature, dondolo. </li><li> Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Incubare a membrana con appropriate anticorpo secondario coniugato fluoroforo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo. NOTA: Perché fluorofori sono sensibili alla luce, diluizioni di anticorpi fluoroforo coniugati devono essere preparati al buio. Inoltre, l&#39;incubazione delle membrane in presenza di anticorpi coniugati fluoroforo deve avvenire in contenitori lightproof. Questo può essere realizzato avvolgendo vassoi di incubazione in un foglio di alluminio. </li><li> Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Acquisire immagine di membrana utilizzando Li-Cor Odyssey CLx e software Immagine Studio (o apparecchiature di imaging comparabili e software), secondo le indicazioni del produttore. </li><li> Dopo l&#39;imaging membrana, incubare la membrana con un anticorpo primario specifico per un caricoing proteina di controllo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Incubare a membrana con appropriate anticorpo secondario coniugato fluoroforo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Acquisire immagine di membrana utilizzando Li-Cor Odyssey CLx e software Immagine Studio (o apparecchiature di imaging comparabili e software), secondo le indicazioni del produttore. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La metodologia qui presentata consente la rapida determinazione e la conferma biochimica dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule di lievito. Questi esperimenti sottolineano l&#39;utilità e la potenza di lievito come organismo modello eucariote (diverse ottime recensioni di lievito biologia e compilazioni di protocolli per la gestione, la conservazione e la manipolazione cellule di lievito (ad esempio 41-44) sono disponibili per gli investigatori nuovi per l&#39;organ...

Degradazione delle proteine ​​selettiva è essenziale per la vita eucariotica, e alterata degradazione delle proteine ​​contribuisce ad una serie di condizioni mediche, tra cui diversi tipi di cancro, malattie neurodegenerative, le malattie cardiovascolari, e la fibrosi cistica 1-5. Il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), che catalizza la degradazione delle proteine ​​selettivo, è un obiettivo terapeutico emergente per queste condizioni 6-10. Ubiquitina ligases covalente attribuiscono polimeri dell&#39;acido ubiquitina 76-amino alle proteine ​​11. Le proteine ​​che sono stati marcati con catene polyubiquitin sono riconosciuti e proteolyzed dai ~ 2,5 megadalton proteasoma 26S 12. Gli studi avviati nel organismo modello eucarioti Saccharomyces cerevisiae (lievito in erba) sono fondamentale nella spiegazione dei meccanismi di degradazione delle proteine ​​nelle cellule eucariotiche. Il primo substrato fisiologico dimostrato dell&#39;UPS era il lievito repressore trascrizionale MATα2 13, 14, e molti componenti altamente conservati dell&#39;UPS stati identificate o caratterizzate dal lievito (es 15-26). Scoperte fatte in questo versatile e geneticamente trattabili organismo modello è probabile che continueranno a fornire importanti informazioni sui meccanismi conservati di degradazione ubiquitina-mediata. Il riconoscimento e la degradazione della maggior parte dei substrati UPS richiedono l&#39;azione concertata di diverse proteine. Pertanto, un obiettivo importante nel caratterizzare il degrado regolamentato di una data proteina instabile è quello di determinare i requisiti genetici per proteolisi. Approcci classici (ad esempio impulso-chase e esperimenti cicloeximide-chase 27) per il monitoraggio degradazione delle proteine ​​in cellule di mammifero o di lievito sono laborioso e richiede molto tempo. Mentre questi tipi di metodi forniscono mezzi altamente sensibili per la rilevazione degradazione delle proteine, non sono adatti per l&#39;analisi rapida di degradazione delle proteine ​​o screeni larga scalang per le mutazioni che impediscono la degradazione delle proteine. Qui, un test basato su una crescita del lievito per la rapida identificazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​instabili è presentato. Nel metodo basato su crescita del lievito per analizzare degradazione delle proteine, una proteina instabile di interesse (o segnale di degradazione) è fusa, in cornice, per una proteina che è necessario per la crescita del lievito in circostanze specifiche. Il risultato è un substrato artificiale che può servire come un potente strumento per determinare i requisiti genetici di proteine ​​degradazione della proteina instabile di interesse. Convenientemente, ceppi di lievito laboratorio più comunemente utilizzati ospitano un pannello di mutazioni nei geni che codificano enzimi metabolici coinvolti nella biosintesi di particolari amminoacidi o basi azotate (ad es 20,28-30). Questi enzimi sono essenziali per la proliferazione cellulare in assenza di metaboliti esogenamente fornite in cui sintesi enzimi partecipano. Taleenzimi metabolici possono quindi funzionare come reporter di crescita a base per la degradazione delle proteine ​​instabili a cui sono fusi. I requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​possono essere facilmente chiarita, in quanto le mutazioni che impediscono proteolisi permetteranno cellule che ospitano il giornalista degrado di crescere in condizioni selettive. Un vantaggio di crescita è un&#39;indicazione indiretta che una particolare mutazione aumenta l&#39;abbondanza della proteina di interesse. Tuttavia, l&#39;analisi biochimica diretta è necessario per confermare che una mutazione permette di crescita attraverso l&#39;aumento dei livelli di proteine, piuttosto che tramite cause indirette o artefatti. L&#39;effetto di una mutazione della proteina abbondanza può essere confermata da analisi Western Blot dei livelli di proteine ​​steady-state in cellule che fanno e non ospitano la particolare mutazione. Un metodo per l&#39;estrazione rapida ed efficace delle proteine ​​di lievito (incubazione sequenziale di cellule di lievito con idrossido di sodio e tampone) in una forma adattaper l&#39;analisi mediante western blotting è presentato anche il 31. Insieme, questi esperimenti facilitare la rapida identificazione dei regolatori candidati di degradazione delle proteine.

<table><tbody><tr><td>Ceppi di lievito desiderati, plasmidi, terreno standard e componenti</td><td></td><td></td> tampone <td>I ceppi di lievito con mutazioni desiderate possono essere generati nel laboratorio dello sperimentatore. Sono disponibili in commercio anche lieviti wild-type e una varietà di mutanti (ad es da GE Healthcare). I plasmidi che codificano per le proteine di fusione possono essere generati nel laboratorio dello sperimentatore.</td></tr><tr><td>3-ammino-1H-1,2,4-triazolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC264571000</td><td>Inibitore competitivo dell'enzima His3. Può essere incluso nel terreno per aumentare il rigore del saggio di crescita utilizzando i costrutti reporter His3.</td></tr><tr><td>Endoglicosidasi H (forma ricombinante da Streptomyces plicatus)</td><td>Roche</td><td>11088726001</td><td>Può essere utilizzato per valutare la N-glicosilazione delle proteine; compatibile con le concentrazioni di SDS e beta-mercaptoetanolo trovate in 1x tampone campione Laemmli.</td></tr><tr><td>Provette monouso in vetro borosilicato</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Disponibile da una varietà di produttori</td></tr><tr><td>Incubatore a temperatura regolata (ad es. Incubatore Heratherm Modello IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Disponibile da una varietà di produttori</td></tr><tr><td>Tamburo intercambiabile New Brunswick per tubi da 18 mm (rullo per tubi)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Il rullo tubolare è consigliato per mantenere in sospensione le colture starter di lievito durante la notte. Un agitatore a piattaforma o un rullo tubolare possono essere utilizzati per mantenere colture più grandi in sospensione.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Tamburo a rulli 120V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>Per l'uso con il rullo tubolare</td></tr><tr><td>Spettrofotometro SmartSpec Plus</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Disponibile da una varietà di produttori</td></tr><tr><td>Piastre sterili per microtest a fondo piatto a 96 pozzetti con coperchio confezionate singolarmente</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td>Disponibile da una varietà di produttori</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 e Mu; l</td><td>Gilson</td><td>F14401</td><td>Disponibile da una varietà di produttori &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &mu; l</td><td>Gilson</td><td>F14403</td><td>I pipettatori monocanale e multicanale vengono utilizzati in varie fasi del protocollo. Mentre i pipettatori multicanale riducono il carico di pipettaggio in diverse fasi, i pipettatori a canale singolo possono essere utilizzati in tutto il protocollo. Disponibile da una varietà di produttori.</td></tr><tr><td>Centrifuga 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216</td><td>Rotore venduto con l'unità contiene provette per microcentrifuga da 1,5 e 2,0 ml. Il rotore può essere sostituito con uno che contiene provette coniche da 15 ml e 50 ml.</td></tr><tr><td>Sistema di imaging per lastre (ad es. Sistema Gel Doc XR+)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8195</td><td>È possibile utilizzare una varietà di sistemi per l'imaging delle lastre, tra cui sofisticati sistemi di imaging, scanner per computer e telefoni con fotocamera.</td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso F-35-6-30 con coperchio e adattatori per centrifuga modello 5430/R, provette coniche da 15/50 ml, 6 posti</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml serigrafato tubo con tappo a vite 17 x 20 mm conico, polipropilene</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Disponibile da una varietà di produttori</td></tr><tr><td>provetta flessibile da 1,5 ml, PCR clean, provette per microcentrifuga naturale</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Disponibile da una varietà di produttori</td></tr><tr><td>Riscaldatore analogico per Dri-Bath Fisher</td><td>Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Il bagno d'acqua bollente con piastra riscaldante può essere utilizzato anche per denaturare le proteine</td></tr><tr><td>SDS-PAGE in esecuzione e trasferire apparati, alimentatori e apparecchiature di imaging o camere oscure per SDS-PAGE e trasferimento a membrana</td><td></td><td></td><td>Varia in base al laboratorio e all'applicazione</td></tr><tr><td>Sistema di imaging Western blot (ad es. scanner Li-Cor Odyssey CLx e software Image Studio)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Varia in base al laboratorio e all'applicazione</td></tr><tr><td>EMD Membrane di trasferimento in PVDF Millipore Immobilon</td> Fisher <td>Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Varia in base al laboratorio e all'applicazione</td></tr><tr><td>Anticorpi primari (ad es Anticorpo monoclonale fosfoglicerato chinasi (Pgk1), (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Varia in base al laboratorio e all'applicazione</td></tr><tr><td>Anticorpi secondari (ad es Alexa-Fluor 680 Coniglio Anti-Topo IgG (H+L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Varia in base al laboratorio e all'applicazione</td></tr></tbody></table>

determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per protein degradazione in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regolamentato degradazione delle proteine ​​è fondamentale per praticamente ogni funzione cellulare. Inizialmente Molto di ciò che è noto circa i meccanismi molecolari e requisiti genetici per eucariotica degradazione delle proteine ​​è stato fondato nel Saccharomyces cerevisiae. Analisi classici di degradazione delle proteine ​​hanno fatto affidamento su metodologie pulse-chase e cicloeximide-chase biochimici. Mentre queste tecniche prevedono mezzi sensibili per osservare la degradazione delle proteine, sono complessi, in termini di tempo, e bassa produttività. Questi approcci non sono suscettibili di screening rapido o su larga scala per le mutazioni che impediscono la degradazione delle proteine. Qui, un test basato su una crescita del lievito per l&#39;identificazione facile dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​è descritto. In questo saggio, un enzima giornalista necessari per la crescita in condizioni selettive specifiche è fuso ad una proteina instabile. Le cellule privi del giornalista enzima endogeno, ma che esprimono la proteina di fusione può crescere sotto selecondizioni ctive solo quando la proteina di fusione è stabilizzato (cioè quando la degradazione delle proteine ​​è compromessa). Nel saggio di crescita qui descritto, diluizioni seriali di wild-type e le cellule di lievito mutanti che ospitano un plasmide codificante una proteina di fusione sono macchiati su terreno selettivo e non selettivo. Crescita in condizioni selettive è coerente con la degradazione compromissione da una determinata mutazione. Una maggiore abbondanza di proteine ​​deve essere confermata biochimicamente. Un metodo per la rapida estrazione di proteine ​​di lievito in una forma adatta per elettroforesi e western blotting è anche dimostrato. Una lettura di crescita a base per la stabilità proteica, combinato con un semplice protocollo per l&#39;estrazione di proteine ​​per l&#39;analisi biochimica, facilita la rapida identificazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine. Queste tecniche possono essere adattate per monitorare la degradazione di una varietà di proteine ​​di breve durata. Nell&#39;esempio presentato, l&#39;enzima HIS3, che è richiesto per la biosintesi istidina, è stata fusaa Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 è mirato per la degradazione dopo si innesta aberrante reticolo endoplasmatico translocon. Le cellule che ospitano Deg1 -Sec62-HIS3 sono stati in grado di crescere in condizioni selettive quando la proteina è stato stabilizzato.

Per illustrare questa metodologia, l&#39;enzima HIS3 è stato fuso al carbossi-terminale del modello reticolo endoplasmatico (ER) di degradazione associata (ERAD) substrato, Deg1 -Sec62 (Figura 2A) per creare Deg1 -Sec62-HIS3 (Figura 3) . Deg1 -Sec62 rappresenta uno dei membri fondatori di una nuova classe di substrati ERAD che sono indirizzate a seguito persistente, associazione aberranti con il translocon, il canale principale responsabile per lo spostamento ...

Questo articolo descrive un saggio basato sulla crescita del lievito per la determinazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine. Dimostra anche un metodo per l'estrazione rapida delle proteine del lievito, adatto al western blotting per confermare biochimicamente i requisiti di degradazione. Queste tecniche possono essere adattate per monitorare la degradazione di una varietà di proteine.

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di determinare rapidamente i requisiti genetici per la degradazione di una proteina instabile in Croce Visier. Ciò si ottiene fondendo un enzima reporter necessario per la crescita in specifiche condizioni selettive con una proteina instabile di interesse. Successivamente, le cellule wild type o mutanti che esprimono entrambe la proteina di fusione vengono coltivate su piastre di agar medie selettive.Il test di placcatura fornisce un comodo indicatore della stabilizzazione delle proteine sulla base della crescita delle cellule di lievito al fine di confermare biochimicamente le differenze nell'abbondanza delle proteine, mentre le cellule mutanti di tipo in che ospitano la proteina di fusione vengono lisate tramite un metodo di estrazione proteica rapido e inefficiente per l'analisi Western blot. I risultati mostrano che l'abbondanza di una proteina instabile è aumentata nelle cellule con una mutazione in un gene necessario per la degradazione. Il contrario è vero per i ceppi di tipo selvatico competenti per la degradazione.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'inseguimento a impulsi e le analisi di inseguimento a ciclo heide è che è meno laboriosa e richiede tempo, consentendo la determinazione rapida e ad alta produttività dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sui requisiti di degradazione per una serie di proteine instabili. Può anche essere utilizzato per identificare i regolatori di altri aspetti dell'espressione genica come la trascrizione e la traduzione.A dimostrare le procedure saranno Sheldon Watts e Justin Crowder. Gli studenti del mio laboratorio prima del saggio trasformano un plasmide che codifica per una proteina di fusione costituita da una proteina instabile e da un enzima reporter metabolico in un ceppo di lievito mutante. Sospettato di avere difetti genetici relativi alla regolazione della degradazione delle proteine come controllo, trasforma anche lo stesso plasmide in un ceppo di lievito di tipo selvatico.Inoculare i trasformanti in cinque millilitri di terreno minimo che seleziona le cellule, ospitando le molecole plasmidiche. Posizionare la provetta in un rotatore inclinato e incubare per una notte a 30 gradi Celsius il giorno successivo. Misurare la densità ottica delle colture notturne, quindi equalizzare la concentrazione cellulare per tutte le cellule diluendo ciascuna coltura a un OD 600 di 0,2 con terreni freschi e provette da centrifuga sterili da 1,5 millilitri.Per iniziare il test principale, impostare una matrice di serie di diluizioni sei volte trasferendo prima 200 microlitri di ciascun ceppo pre-diluito, partendo da un OD 600 di 0,2 in pozzetti designati nella prima colonna di una piastra sterile a 96 pozzetti in preparazione per le successive diluizioni, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 125 microlitri di acqua sterile nei pozzetti vuoti nella colonna due, tre e quattro. Quindi, trasferire 25 microlitri di lievito dalla colonna uno alla colonna due, pipettare su e giù alcune volte per mescolare le cellule in modo uniforme e procedere al trasferimento di 25 microlitri di cellule dalla colonna due alla colonna tre. Ripetere le fasi di diluizione seriale fino a quando i pozzetti nella colonna quattro non sono ben miscelati come aiuto visivo per l'individuazione delle cellule.Stampate un modello di griglia e fissatelo con del nastro adesivo all'interno del coperchio di una piastra di Petri, iniziando dalla colonna meno concentrata nella matrice di diluizione seriale. Trasferire quattro microlitri di cellule da ogni colonna. Sulla piastra a 96 pozzetti su una piastra di agar al mezzo minimo di controllo che seleziona per il mantenimento del plasmide intracellulare Posizionare altri quattro microlitri di cellule da ciascuna colonna su una piastra di agar al terreno minima separata che seleziona entrambi i plasmidi intracellulari.Mantenimento ed espressione della proteina di fusione instabile. Lasciare asciugare entrambe le piastre sul banco per cinque-10 minuti. Sigillare i coperchi con param per prevenire la disidratazione e incubare le cellule a 30 gradi Celsius per due-sei giorni.Quando le colonie della coltura a crescita più rapida diventano visibili per la prima volta nel punto più diluito di una determinata piastra, rimuovere la piastra dall'incubatrice e documentare l'entità della crescita. Scattando fotografie, potrebbe essere necessario scattare fotografie di lastre diverse in giorni diversi o della stessa lastra in più giorni. Nel caso di diversi ceppi di lievito che mostrano un'ampia gamma di tassi di crescita, così biochimicamente confermati che un gene identificato nel test di crescita regola l'abbondanza proteica, iniziare trasformando ceppi di lievito wild type e mutanti con un plasmide che codifica la suddetta proteina di fusione, inoculare i trasformanti in cinque millilitri di terreno minimo che seleziona per il mantenimento del plasmide intracellulare e incubare le provette durante la notte in un rotatore inclinato di 30 gradi Celsius.Il giorno successivo, misurare la densità ottica a 600 di ogni coltura notturna. Una volta che tutti i ceppi hanno raggiunto un OD 600 di 0,4 o superiore, diluire tutte le colture fino a 0,2 con terreno fresco in modo che il volume finale per ogni ceppo sia di 10 millilitri. Incubare le cellule su un agitatore a piattaforma a 30 gradi Celsius fino a quando tutte le colture raggiungono una crescita di 600 OD nella fase log media, compresa tra 0,8 e 1,2.Raccogli una cellula trasferendo 2,5 unità totali OD di cellule in una provetta conica fresca da 15 millilitri. Centrifugare le celle a temperatura ambiente per cinque minuti e rimuovere il surnatante S. Quindi aggiungere un millilitro di acqua distillata, vortice o pipetta su e giù per risospendere il palato e trasferire la sospensione cellulare in una provetta fresca da 1,5 millilitri.Isolare le cellule con la seconda centrifugazione per 30 secondi A temperatura ambiente, rimuovere la snat e risospendere le cellule in 100 microlitri di acqua distillata. Aggiungere 100 microlitri di idrossido di sodio molare 0,2 alla sospensione cellulare, pipettare su e giù alcune volte per mescolare e incubare i campioni per cinque minuti a temperatura ambiente per evitare una lisi cellulare prematura. Non agitare le celle.Isolare nuovamente le cellule con una terza centrifugazione per 30 secondi. A temperatura ambiente, rimuovere i surnatanti dalle cellule e lisare le cellule sospendendo nuovamente il pellet in 50-100 microlitri di un tampone campione lamby denaturare tutte le proteine incubando la sospensione a 95 gradi Celsius per cinque minuti, quindi raffreddare l'intero lisato cellulare su ghiaccio per cinque minuti. Per saggiare l'abbondanza di proteine inclini all'aggregazione, come le proteine con diversi segmenti transmembrana, determinare empiricamente l'incubazione, la temperatura e il tempo di denaturazione ottimali iniziando a 70 gradi Celsius per 10 minuti invece di 95 gradi Celsius per cinque minuti.Infine, isolare la frazione solubile centrifugando il lisato per un minuto a temperatura ambiente, trasferire il nat in una provetta fresca e scartare la frazione di pellet insolubile. La frazione solubile può ora essere caricata direttamente su una pagina SDS, su un gel o conservata a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per la messa a punto di un saggio di degradazione delle proteine basato sulla crescita del lievito. Una proteina instabile a tripla fusione viene fusa con un enzima metabolico aggiuntivo che completa il background del ceppo di lievito privo dello stesso gene metabolico.Quando la proteina di fusione è espressa nel lievito, è soggetta a eventi di traslocazione sterili sulla membrana del reticolo endoplasmatico. Questa traslocazione aberrante innesca la degradazione mediata dall'ubiquitina dell'intera proteina, compreso l'enzima metabolico, impedendo così la proliferazione cellulare. Tuttavia, nei ceppi di lievito privi di ubiquitina ligasi, la proteina di fusione è protetta dalla degradazione, anche in caso di traslocazione media consentendo alle cellule di proliferare.Pertanto, in presenza di ubiquitina ligasi, esiste una corrispondenza tra la degradazione delle proteine che avviene all'interno delle cellule e la mancata proliferazione delle cellule di lievito sulle piastre di agar impoverite dal metabolita. D'altra parte, nel contesto di una proliferazione cellulare di ubiquitina ligasi difettosa o assente indica che la proteina di fusione è stata protetta dalla degradazione per ridurre la crescita di fondo o spuria e aumentare la rigorosità di questo test. Gli inibitori competitivi dell'enzima metabolico possono essere aggiunti al terreno di crescita per confermare i risultati osservati nel saggio di crescita del lievito.L'evidenza diretta della degradazione della proteina di fusione può essere accertata anche con un western blot. In presenza o assenza di ubiquitina ligasi, la proteina di fusione sarà degradata o risparmiata dalla distruzione, rispettivamente. È importante ricordare che queste procedure riportano più direttamente l'abbondanza allo stato stazionario della proteina di interesse.Dopo che queste procedure sono state condotte, possono essere eseguite analisi di inseguimento di impulsi o cicloesimidi al fine di analizzare direttamente la cinetica di degradazione delle proteine e la presenza di mutazioni che aumentano i livelli di proteine dello stato di studio.

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