Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in Saccharomyces cerevisiae

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di determinare rapidamente i requisiti genetici per la degradazione di una proteina instabile in Croce Visier. Ciò si ottiene fondendo un enzima reporter necessario per la crescita in specifiche condizioni selettive con una proteina instabile di interesse. Successivamente, le cellule wild type o mutanti che esprimono entrambe la proteina di fusione vengono coltivate su piastre di agar medie selettive.

Il test di placcatura fornisce un comodo indicatore della stabilizzazione delle proteine sulla base della crescita delle cellule di lievito al fine di confermare biochimicamente le differenze nell'abbondanza delle proteine, mentre le cellule mutanti di tipo in che ospitano la proteina di fusione vengono lisate tramite un metodo di estrazione proteica rapido e inefficiente per l'analisi Western blot. I risultati mostrano che l'abbondanza di una proteina instabile è aumentata nelle cellule con una mutazione in un gene necessario per la degradazione. Il contrario è vero per i ceppi di tipo selvatico competenti per la degradazione.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'inseguimento a impulsi e le analisi di inseguimento a ciclo heide è che è meno laboriosa e richiede tempo, consentendo la determinazione rapida e ad alta produttività dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sui requisiti di degradazione per una serie di proteine instabili. Può anche essere utilizzato per identificare i regolatori di altri aspetti dell'espressione genica come la trascrizione e la traduzione.

A dimostrare le procedure saranno Sheldon Watts e Justin Crowder. Gli studenti del mio laboratorio prima del saggio trasformano un plasmide che codifica per una proteina di fusione costituita da una proteina instabile e da un enzima reporter metabolico in un ceppo di lievito mutante. Sospettato di avere difetti genetici relativi alla regolazione della degradazione delle proteine come controllo, trasforma anche lo stesso plasmide in un ceppo di lievito di tipo selvatico.

Inoculare i trasformanti in cinque millilitri di terreno minimo che seleziona le cellule, ospitando le molecole plasmidiche. Posizionare la provetta in un rotatore inclinato e incubare per una notte a 30 gradi Celsius il giorno successivo. Misurare la densità ottica delle colture notturne, quindi equalizzare la concentrazione cellulare per tutte le cellule diluendo ciascuna coltura a un OD 600 di 0,2 con terreni freschi e provette da centrifuga sterili da 1,5 millilitri.

Per iniziare il test principale, impostare una matrice di serie di diluizioni sei volte trasferendo prima 200 microlitri di ciascun ceppo pre-diluito, partendo da un OD 600 di 0,2 in pozzetti designati nella prima colonna di una piastra sterile a 96 pozzetti in preparazione per le successive diluizioni, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 125 microlitri di acqua sterile nei pozzetti vuoti nella colonna due, tre e quattro. Quindi, trasferire 25 microlitri di lievito dalla colonna uno alla colonna due, pipettare su e giù alcune volte per mescolare le cellule in modo uniforme e procedere al trasferimento di 25 microlitri di cellule dalla colonna due alla colonna tre. Ripetere le fasi di diluizione seriale fino a quando i pozzetti nella colonna quattro non sono ben miscelati come aiuto visivo per l'individuazione delle cellule.

Stampate un modello di griglia e fissatelo con del nastro adesivo all'interno del coperchio di una piastra di Petri, iniziando dalla colonna meno concentrata nella matrice di diluizione seriale. Trasferire quattro microlitri di cellule da ogni colonna. Sulla piastra a 96 pozzetti su una piastra di agar al mezzo minimo di controllo che seleziona per il mantenimento del plasmide intracellulare Posizionare altri quattro microlitri di cellule da ciascuna colonna su una piastra di agar al terreno minima separata che seleziona entrambi i plasmidi intracellulari.

Mantenimento ed espressione della proteina di fusione instabile. Lasciare asciugare entrambe le piastre sul banco per cinque-10 minuti. Sigillare i coperchi con param per prevenire la disidratazione e incubare le cellule a 30 gradi Celsius per due-sei giorni.

Quando le colonie della coltura a crescita più rapida diventano visibili per la prima volta nel punto più diluito di una determinata piastra, rimuovere la piastra dall'incubatrice e documentare l'entità della crescita. Scattando fotografie, potrebbe essere necessario scattare fotografie di lastre diverse in giorni diversi o della stessa lastra in più giorni. Nel caso di diversi ceppi di lievito che mostrano un'ampia gamma di tassi di crescita, così biochimicamente confermati che un gene identificato nel test di crescita regola l'abbondanza proteica, iniziare trasformando ceppi di lievito wild type e mutanti con un plasmide che codifica la suddetta proteina di fusione, inoculare i trasformanti in cinque millilitri di terreno minimo che seleziona per il mantenimento del plasmide intracellulare e incubare le provette durante la notte in un rotatore inclinato di 30 gradi Celsius.

Il giorno successivo, misurare la densità ottica a 600 di ogni coltura notturna. Una volta che tutti i ceppi hanno raggiunto un OD 600 di 0,4 o superiore, diluire tutte le colture fino a 0,2 con terreno fresco in modo che il volume finale per ogni ceppo sia di 10 millilitri. Incubare le cellule su un agitatore a piattaforma a 30 gradi Celsius fino a quando tutte le colture raggiungono una crescita di 600 OD nella fase log media, compresa tra 0,8 e 1,2.

Raccogli una cellula trasferendo 2,5 unità totali OD di cellule in una provetta conica fresca da 15 millilitri. Centrifugare le celle a temperatura ambiente per cinque minuti e rimuovere il surnatante S. Quindi aggiungere un millilitro di acqua distillata, vortice o pipetta su e giù per risospendere il palato e trasferire la sospensione cellulare in una provetta fresca da 1,5 millilitri.

Isolare le cellule con la seconda centrifugazione per 30 secondi A temperatura ambiente, rimuovere la snat e risospendere le cellule in 100 microlitri di acqua distillata. Aggiungere 100 microlitri di idrossido di sodio molare 0,2 alla sospensione cellulare, pipettare su e giù alcune volte per mescolare e incubare i campioni per cinque minuti a temperatura ambiente per evitare una lisi cellulare prematura. Non agitare le celle.

Isolare nuovamente le cellule con una terza centrifugazione per 30 secondi. A temperatura ambiente, rimuovere i surnatanti dalle cellule e lisare le cellule sospendendo nuovamente il pellet in 50-100 microlitri di un tampone campione lamby denaturare tutte le proteine incubando la sospensione a 95 gradi Celsius per cinque minuti, quindi raffreddare l'intero lisato cellulare su ghiaccio per cinque minuti. Per saggiare l'abbondanza di proteine inclini all'aggregazione, come le proteine con diversi segmenti transmembrana, determinare empiricamente l'incubazione, la temperatura e il tempo di denaturazione ottimali iniziando a 70 gradi Celsius per 10 minuti invece di 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Infine, isolare la frazione solubile centrifugando il lisato per un minuto a temperatura ambiente, trasferire il nat in una provetta fresca e scartare la frazione di pellet insolubile. La frazione solubile può ora essere caricata direttamente su una pagina SDS, su un gel o conservata a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per la messa a punto di un saggio di degradazione delle proteine basato sulla crescita del lievito. Una proteina instabile a tripla fusione viene fusa con un enzima metabolico aggiuntivo che completa il background del ceppo di lievito privo dello stesso gene metabolico.

Quando la proteina di fusione è espressa nel lievito, è soggetta a eventi di traslocazione sterili sulla membrana del reticolo endoplasmatico. Questa traslocazione aberrante innesca la degradazione mediata dall'ubiquitina dell'intera proteina, compreso l'enzima metabolico, impedendo così la proliferazione cellulare. Tuttavia, nei ceppi di lievito privi di ubiquitina ligasi, la proteina di fusione è protetta dalla degradazione, anche in caso di traslocazione media consentendo alle cellule di proliferare.

Pertanto, in presenza di ubiquitina ligasi, esiste una corrispondenza tra la degradazione delle proteine che avviene all'interno delle cellule e la mancata proliferazione delle cellule di lievito sulle piastre di agar impoverite dal metabolita. D'altra parte, nel contesto di una proliferazione cellulare di ubiquitina ligasi difettosa o assente indica che la proteina di fusione è stata protetta dalla degradazione per ridurre la crescita di fondo o spuria e aumentare la rigorosità di questo test. Gli inibitori competitivi dell'enzima metabolico possono essere aggiunti al terreno di crescita per confermare i risultati osservati nel saggio di crescita del lievito.

L'evidenza diretta della degradazione della proteina di fusione può essere accertata anche con un western blot. In presenza o assenza di ubiquitina ligasi, la proteina di fusione sarà degradata o risparmiata dalla distruzione, rispettivamente. È importante ricordare che queste procedure riportano più direttamente l'abbondanza allo stato stazionario della proteina di interesse.

Dopo che queste procedure sono state condotte, possono essere eseguite analisi di inseguimento di impulsi o cicloesimidi al fine di analizzare direttamente la cinetica di degradazione delle proteine e la presenza di mutazioni che aumentano i livelli di proteine dello stato di studio.