Name: Macrofagi Colesterolo Depletion e il suo effetto sulla fagocitosi di Cryptococcus neoformans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Scopri come depletere il colesterolo dai macrofagi per studiare la fagocitosi di Cryptococcus neoformans. Questo protocollo utilizza metil beta ciclodestrina e microscopia per analizzare le interazioni patogeno-ospite in vitro.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH AI56168, AI71142, AI87541 e AI100631 di MDP. Maurizio Del Poeta è Burroughs Wellcome Investigator in Malattie Infettive.

1. Colesterolo esaurimento delle Cellule J774A.1 con MβCD <ol><li> In un armadio biosicurezza sterili, 10 5 J774A.1 macrofagi come seme per bene su una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti in 200 ml di Dulbecco modificato (DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% penicillina / streptomicina (P / S). Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 O / N. </li><li> Rimuovere i supporti dal monostrato cellulare e lavare le cellule due volte con 1x tampone fosfato salino (PBS), che è stata filtrata o in autoclave. </li><li> Aggiungere 200 ml di soluzione MβCD alla concentrazione desiderata (10 mM mM o 30 in PBS) o PBS 1x come controllo e incubare per 30 min a 37 ° C con agitazione. Rimuovere il surnatante e riserva a RT per l&#39;analisi quantitativa con kit disponibile in commercio subito dopo la procedura. </li><li> Lavare le cellule due o tre volte con PBS 1x o siero DMEM gratuito e continuare con infezione o lisi delle cellule di pipetting due o tre volte con H 2 O deionizzata per l&#39;analisi mediante cromatografia su strato sottile o con un kit. NOTA: Dopo colesterolo deplezione un kit disponibile in commercio colesterolo quantificazione può essere utilizzato. Vedere la sezione Materiali per i dettagli. Seguire le istruzioni del produttore come scritto. </li></ol> 2. Osservazione di colesterolo contenuti da cromatografia su strato sottile (TLC) <ol><li> Lavare un serbatoio TLC due volte con acetone e una volta con una soluzione di etere di petrolio: etere dietilico: acido acetico (65: 30: 1 in volume). Saturare il serbatoio con l&#39;etere di petrolio: etere dietilico: acido acetico (65: 30: 1 in volume) e lasciare soluzione O / N. NOTA: Organic solventi devono essere utilizzati sotto una cappa per evitare l&#39;inalazione di vapori. Guanti e camice da laboratorio devono essere indossati in ogni momento. L&#39;acido acetico è un acido forte e deve essere usato con cautela. </li><li> In un armadio biosicurezza sterile, seme 10 6 J774A.1 i macrofagi per bene su un ce 6-benell piastra di coltura in un volume di 5 ml di DMEM calda supplementato con 10% FBS e 1% P / S. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 O / N. </li><li> Esaurire macrofagi di colesterolo seguendo i passaggi 1,2-1,4, sostituendo 1 ml per 200 microlitri se del caso per tenere conto delle dimensioni ben più grandi. </li><li> Aggiungere 500 ml di tripsina-EDTA ad ogni pozzetto, incubare per 3 minuti a 37 ° C, e raschiare delicatamente le cellule con un raschietto cellulare. </li><li> Trasferire in una provetta per microcentrifuga e aggiungere ulteriori 500 ml di DMEM caldo supplementato con 10% FBS e 1% P / S. </li><li> Spin le cellule per 5 minuti a 300 xg e rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere altri 500 ml di DMEM supplementato con calda 10% FBS e 1% P / S al pellet e risospendere accuratamente pipettando su e giù. </li><li> Rimuovere 10 ml di cellule e contare le cellule su un emocitometro. Normalizzare la concentrazione cellulare di ciascun campione e aggiungere un numero uguale di cellule di tubi di vetro. NOTA: A questo punto, si puòscegliere di combinare cellule dagli stessi gruppi di trattamento per ottenere un estratto lipidico finale più concentrato. </li><li> Cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere i supporti. </li><li> Aggiungere 2 ml di metanolo e vortex. Quindi, aggiungere 1 ml di cloroformio e vortex. Controllare lo stato di fase per assicurarsi che la soluzione in monofasica. NOTA: tubi può essere conservato a 4 ° CO / N. </li><li> Centrifugare a 1700 xg per 10 minuti a RT e trasferire il surnatante in una nuova provetta </li><li> Aggiungere un ulteriore 1 ml di cloroformio seguita da 1 ml di dH 2 O. Vortex due volte per 30 sec. Centrifugare a 1700 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Pesare un tubo di vetro ad una bilancia sensibile e utilizzare una pipetta Pasteur di vetro per trasferire la fase inferiore nel tubo di vetro del peso noto. </li><li> Asciugare giù lipidi in un evaporatore centrifuga fino a secco (circa 2 ore). Pesare tubo con lipidi secchi e calcolare il peso a secco di lipidi. NOTA: lipidi secco può essere memorizzato in -20 ° C fino al momento di effettuare TLC. </li><li> Diluire lipidi essiccati in cloroformio sufficiente per normalizzare la concentrazione di lipidi (di solito 20 - 50 microlitri) e 20 microlitri di carico del lipide diluito su una piastra di TLC silice. Carico 20 mg di colesterolo diluito in 20 ml di cloroformio come standard. </li><li> Aggiungere piastra TLC essiccato al serbatoio TLC saturi e consentire solvente migrare fino a 1 cm prima piastra di bordo. Rimuovere la piastra TLC dal serbatoio e lasciarlo asciugare circa 5 min. </li><li> Visualizza lipidi mettendo in un serbatoio vapori di iodio per controllare la migrazione. Rimuovere e consentono punti di dissolvenza per circa 10 - 15 minuti sotto il cofano. NOTA: Lo iodio è un pericolo per inalazione. Utilizzare sempre sotto una cappa aspirante. </li><li> Preparare una soluzione per la colorazione lipidi neutri combinando 60 ml di metanolo con 60 ml di H 2 O deionizzata, 4 ml di acido solforico, e 630 mg di cloruro di manganese. </li><li> Lentamente e con cautela immergere la piastra TLC nella soluzione lipidica colorazione neutra in un vassoio e rimuovere senza desquamazione della silice layer. NOTA: La soluzione lipidica colorazione neutra può essere riutilizzato più volte e in modo che possa essere recuperato dal vassoio e rimesso in una bottiglia per un uso successivo. </li><li> Lasciare piastra asciugare sotto il cofano a RT finché è scomparsa tutte le bolle. Riscaldare la piastra TLC su un set blocco termico a 160 ° C e char al colore desiderato. NOTA: Un programma densitometria come Vision Lavori LS può essere utilizzato per quantificare le bande carbonizzati per confrontare i campioni di lipidi. </li></ol> 3. L&#39;infezione dei macrofagi con C. neoformans (H99) <ol><li> In un armadio biosicurezza sterili, semi di 10 celle 5 macrofagi come per bene su una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti in 200 ml di DMEM supplementato con 10% FBS e 1% P / S. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2, 5% CO 2 O / N. NOTA: L&#39;infezione può essere effettuata anche in fondo di vetro piatti confocale per l&#39;imaging più facile; tutti gli importi rimangono gli stessi. </li><li> Crescere una cultura di C. neoformans (H99)inoculando 10 ml di YNB con una colonia ottenuto da una piastra colpito e incubando è O / N a 30 ° C con agitazione. </li><li> Lavare e contare C. neoformans (H99), le cellule. <ol><li> Centrifuga C. cultura neoformans O / N a 1.700 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il supporto e scartare. Lavare le cellule con 5 ml di 1x PBS. Centrifugare a 1.700 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere PBS e lavare con 5 ml di filtrato 1x PBS. Centrifugare a 1.700 xg per 10 min a 4 ° C. Ripetere questa operazione altre 2 volte. </li><li> Rimuovere PBS e risospendere in 5 ml di 1x PBS. </li><li> Fare diluizioni seriali in PBS per ottenere una diluizione 1: 500 della cultura lavato. <ol><li> Aggiungere 100 microlitri del campione originale 900 microlitri di PBS 1x per ottenere una diluizione 1:10. </li><li> Aggiungere 100 ml di 01:10 campione diluito a 900 ml di 1x PBS per ottenere una diluizione 1: 100. </li><li> Aggiungere 200 ml di 1: campione diluito 100 a 800 ml di PBS 1x per ottenere un 1: 500 dilutisu </li></ol></li><li> Prendere 10 ml di diluizione 1: 500 e contare su emocitometro per calcolare il numero di cellule. </li></ol></li><li> Preparare soluzione di lavoro per l&#39;attivazione dei macrofagi e opsonizzare C. neoformans. <ol><li> Diluire LPS e IFNγ 100x di soluzioni di riserva con l&#39;aggiunta di 10 ml a 990 ml. NOTA: LPS e IFNγ vengono utilizzati per migliorare l&#39;assorbimento dei fagociti, ma non sono necessari per la fagocitosi. Se c&#39;è un interesse per l&#39;attività fungicida dei macrofagi, effettuare l&#39;attivazione O / N a 37 ° C con agitazione prima dell&#39;infezione. </li><li> Per esempio combinano 7,5 ml di LPS diluito, 1,25 ml di IFNγ diluita, 1,25 ml di anticorpi GXM e il volume del C. cultura neoformans che dà 1,25 x 10 5 cellule. Portare il volume fino a 250 ml, moltiplicato per il numero di campioni con DMEM supplementato con 10% FBS e 1% P / S. </li><li> Vortex e incubare soluzione per 20 minuti a 37 ° C con agitazione. NOTA:Colesterolo esaurimento (i passaggi 1,2-1,4) può essere fatto in concomitanza con la fase di opsonizzazione. Assicurati di trattare macrofagi prima di combinare la soluzione di lavoro, in quanto le cellule opsonizzati devono essere utilizzati in modo ottimale non più di 20 minuti dopo la fase di incubazione 3.4.3. </li></ol></li><li> Infettare macrofagi <ol><li> Macrofagi lavare due volte con siero DMEM gratuito e aggiungere 200 ml di opsonizzati C. neoformans soluzione di lavoro di ogni bene. </li><li> Incubare per 2 ore a 37 ° C. </li></ol></li><li> Fix e colorare le cellule <ol><li> Rimuovere i supporti e lavare le cellule 2 volte con DMEM. </li><li> Far asciugare il monostrato cellulare per 10 minuti e aggiungere 200 ml di metanolo ghiaccio freddo per fissare le cellule. </li><li> Incubare per 15 minuti a RT e rimuovere il metanolo rimanente. </li><li> Aggiungere 200 ml di 10x Giemsa e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 2 - 3 volte con acqua deionizzata e asciugare O / N con cappuccio. NOTA: Imaging può essere fatto il giorno dopo o fino a una settimana following colorazione. </li></ol></li><li> Visualizza e Conte <ol><li> Utilizzando un microscopio, conta 300 cellule per punto dati (se ci sono 2 dello stesso trattamento contare 150 per bene) e annotare il numero di macrofagi infetti e il numero di cellule Cryptococcus inghiottito. NOTA: Per assicurare anche il campionamento per use punto dati 2 piastre per condizione, selezionare 3 aree non sovrapposte per piastra e conta 50 cellule per zona. </li><li> Calcolare indice phagocytic moltiplicando la percentuale di macrofagi infettati dal numero medio di C. neoformans per macrofagi. Normalizzare indice phagocytic esprimendo i valori in percentuale del 1x PBS trattati di controllo. Dopo diverse prove calcolare il valore medio e la deviazione standard della media per determinare le tendenze nell&#39;indice fagocitosi. Utilizzare studente t-test per stabilire significatività. </li><li> Prendere microscopio di cellule a 1,000X o 400X di ingrandimento. </li></ol></li></ol> 4. Trypan Blue Assay <ol><li> In un armadio biosicurezza sterile, sementi 10 6 i macrofagi per pozzetto su una piastra di coltura cellulare 6 pozzetti in un volume di 5 ml di mezzo minimo essenziale di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale ed 1% di penicillina / streptomicina . Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 O / N. </li><li> Esaurire macrofagi di colesterolo seguendo i passaggi 1,2-1,4 sostituendo 2 ml per 200 microlitri se del caso per tenere conto delle dimensioni ben più grandi. NOTA: Assicurarsi di includere un controllo trattato con 1x PBS, nonché un controllo che viene raschiata prima di qualsiasi trattamento. </li><li> Aggiungere 500 ml di 1x PBS in ciascun pozzetto e raschiare delicatamente le cellule con un raschietto cellulare. Trasferire in una provetta per microcentrifuga e sospendere le cellule pipettando gentilmente su e giù. </li><li> Rimuovere 10 ml di cellule e macchia con 1 ml di 4% Trypan blu. </li><li> Contare le cellule su un emocitometro e calcolare la vitalità utilizzando la seguente equazione:% redditività = [1 - (cellule blu / cellule totali)]x 100. I valori Normalizzare al controllo che è stato non trattato. Dopo diverse prove calcolare il valore medio e la deviazione standard per determinare le tendenze in redditività. Utilizzare studente t-test per stabilire significatività. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lavorando con questo protocollo è importante per ottenere il conteggio delle cellule accurate quando placcatura cellule di mammifero e opsonizzare C. cellule neoformans. Questo minimizza variazione tra prove e assicura un&#39;accurata 1: 1 bersaglio rapporto effettore tutto lo studio. È anche fondamentale per coordinare la tempistica della deplezione di colesterolo e per prevenire l&#39;infezione delle cellule di lievito o cellule opsonizzati macrofagi trattati di riposo a RT tra le procedure. Lunghi p...

Fagocitosi è un processo attraverso il quale entita extracellulari vengono internalizzati dalle cellule ospiti. Si tratta di un&#39;arma fondamentale nell&#39;arsenale del sistema immunitario a difendersi contro gli agenti patogeni, ma il processo può spesso essere sovvertita da agenti patogeni per consentire l&#39;internalizzazione e la diffusione in tutto il corpo 1. Fagocitosi è mediata da diversi eventi di segnalazione che si traducono in attacco e fagocitazione via riarrangiamenti del citoscheletro della cellula ospite. Fagociti &#39;professionali&#39; sono in grado di riconoscere e legarsi a opsonine sulla superficie del patogeno invasore di segnalare per l&#39;attacco e la formazione di lamellipodia, che fagocitare l&#39;agente patogeno e formano un phagosome 2. Tra i cosiddetti fagociti &#39;professionali&#39; sono i macrofagi. I macrofagi sono cellule altamente specializzate che svolgono funzioni di protezione che includono ricercare e eliminare gli agenti patogeni, riparare tessuti danneggiati, e mediare l&#39;infiammazione, la maggior parte deiquesti attraverso il processo di fagocitosi 1,2. Cryptococcus neoformans è una specie di lievito patogeno che provoca una grave malattia nota come Criptococcosi. Spore Cryptococcus inalazione dall&#39;host e determinano un&#39;infezione polmonare che di solito è asintomatica. Si ritiene che l&#39;esposizione è estremamente diffuso; un campione di 61 bambini dalle malattie infettive Pediatric Clinic presso il Centro Ospedaliero Bronx-Lebanon trovato che tutti gli intervistati avevano anticorpi al glucuronoxylomannan polisaccaride criptococcica e altri studi hanno dimostrato la prevalenza sia il virus dell&#39;immunodeficienza umana (HIV) non infetto e adulti infetti 3, 4. macrofagi alveolari sono la prima linea di risposta all&#39;infezione polmonare e in molti casi con successo chiaro patogeno. Tuttavia, in soggetti immunocompromessi (pazienti ad esempio, HIV e AIDS), il lievito è in grado di sopravvivere all&#39;interno dei macrofagi. In questicasi, i macrofagi possono servire come una nicchia per la replicazione del patogeno e possono facilitare la sua diffusione al sistema nervoso centrale (CNS) se la malattia diventa fatale 5 - 8. Si pensa che i macrofagi possono anche consegnare il lievito direttamente nelle meningi, aiutando il lievito di attraversare la barriera emato-encefalica tramite il modello &quot;cavallo di Troia&quot; 3,9 - 11. Pertanto, è importante comprendere il processo di fagocitosi ed i fattori che incidono su di esso, specialmente nelle infezioni da criptococco. Impieghi precedenti in altri sistemi patogeni puntare colesterolo e lipidi zattere formate da colesterolo come aventi un ruolo importante da svolgere in fagocitosi 12-15. Il colesterolo è la specie di lipidi più abbondante in cellule di mammifero e comprende 25 - 50% della membrana cellulare di mammifero 16. Si è trovato un ruolo nella modulazione della BIOPproprietà hysical di membrane di cambiare la loro rigidità 17. Colesterolo e sfingolipidi insieme formano microdomini lipidici all&#39;interno della membrana nota come zattere lipidiche. Raft lipidici sono stati trovati ad essere coinvolti nella formazione di caveolae, oltre a fornire un dominio isolato per alcuni tipi di segnalazione 16 - 18. A causa delle loro piccole dimensioni, è difficile studiare zattere lipidiche in vivo. Un modo utile per studiare il ruolo dei raft lipidici è quella di modificare i loro elettori. Metil-β-ciclodestrina (MβCD) è un composto che è stato trovato per esaurire il colesterolo dalle membrane mammiferi ed è comunemente utilizzato per studiare il ruolo dei raft lipidici 18. In questo protocollo, presentiamo un metodo per esaurire il colesterolo dalle membrane della cellula ospite e quantificare l&#39;effetto della deplezione sulla capacità delle cellule ospiti di fagocitare C. neoformans in vitro. Questo procedimento si avvale di coltura cellulare techniqUES su un macrofago immortalato come linea cellulare (J774A.1) come modello di infezione. Colesterolo deplezione stato compiuto mediante esposizione a MβCD, che ha un core idrofobico specifica alla dimensione di steroli ed è in grado di agire come un dissipatore per il colesterolo per disegnare fuori della membrana 19. Colesterolo esaurimento è stata misurata quantitativamente usando un kit disponibile in commercio e qualitativamente con una estrazione del grasso Bligh-Dyer modificato seguita da cromatografia su strato sottile (TLC) 20. . Fagocitosi è stata misurata infettando la linea cellulare con una cultura di lievito opsonizzati mescolato con un cocktail di interferone-γ e lipopolysaccharide per l&#39;attivazione dei macrofagi Cryptococcus stata opsonizzati utilizzando un anticorpo glucuronoxylomannan (GXM) 21 - 23. Colorazione e esperimenti di microscopia consentito per la visualizzazione delle cellule e calcolo dell&#39;indice fagocitaria per valutare il grado di fagocitosi. Nel loro insieme, questo protocollo dEscribes un metodo di base che integra l&#39;alterazione della composizione lipidica con un processo fisiologico.

<table><tbody><tr><td>Cabina di biosicurezza di classe II tipo A2</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 linea cellulare</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Arriva congelata. Vedere le istruzioni ATCC per la coltivazione.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Negozio a 4 &deg; C e caldo a 37 gradi C prima dell'uso</td></tr><tr><td>HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Conservare congelato a -20 &deg; C e scongelare prima di aggiungere a DMEM</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Utilizzato per integrare DMEM</td></tr><tr><td>Isotemp Incubatore per colture cellulari</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3530</td></tr><tr><td>Piatto di coltura a 96 pozzetti</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Diluire a 1 volta e filtrare o sterilizzare in autoclave prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Metil-beta;-ciclodestrina</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>Sciogliere in 1x PBS per ottenere soluzioni con concentrazioni di 10 mM e 30 mM</td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Kit per il dosaggio del colesterolo rosso</td><td>Life Technologies Sonde molecolari</td><td>A12216</td><td>Tutti i reagenti per il dosaggio del colesterolo sono contenuti nel kit. Seguire le istruzioni del produttore.</td></tr><tr><td>Piastra di analisi nera a 96 pozzetti</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre FilterMax</td><td>Dispositivi</td><td></td> molecolari <td>Modello F5</td></tr><tr><td>Camera TLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Paper</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Taglio alla misura necessaria per il serbatoio TLC</td></tr><tr><td>Cappa</td><td></td><td></td> aspirante <td>Qualsiasi cappa aspirante conforme agli standard AIHA/ANSI Piastra</td></tr> a <tr><td>6 pozzetti</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Corning Inc. Emocitometro Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coltro</td><td></td><td>Modello Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Mixer</td><td>Votex Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Modello # MS104S misura fino a 0,1 mg</td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur in vetro</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Modello # SPD2010</td></tr><tr><td>Etere di petrolio</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Etere dietilico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 con zona di concentrazione</td><td>Cromatografo analitico Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Chip di iodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di manganese</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging System</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Utilizzare il software Vision Works LS per l'analisi densitometrica</td></tr><tr><td>Piatto confocale con fondo in vetro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Ottenuto dal Duke University Medical Center</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>Vedere il produttore per le istruzioni di preparazione. Utilizzare una concentrazione di glucosio di 20 g/L.</td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Sciogliere in 1x PBS per ottenere 1 mg/ml di brodo. Conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Interferone gamma</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>Sciogliere in 1x PBS per ottenere 0,1 mg/ml di soluzione madre</td></tr><tr><td>Anticorpo glucuronossilomannano (anti-GXM)</td><td></td><td></td><td>Regalo dal laboratorio di Arturo Casadevall la concentrazione è 1,98 mg/ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>Sciogliere 0,8 g di Giemsa in 25 ml di glicerolo e riscaldare a 60 gradi; C per 1 ora. Aggiungere 25 ml di metanolo alla soluzione e lasciare invecchiare a temperatura ambiente per almeno 1 mese.</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>Observer.D1 con AxioCam MRm per l'acquisizione</td> di <td></td> immagini</tr></tbody></table>

macrofagi colesterolo depletion e il suo effetto sulla fagocitosi di<em&gt; cryptococcus neoformans</em

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Criptococcosi è un&#39;infezione pericolosa per la vita causata da funghi patogeni del genere Cryptococcus. L&#39;infezione si verifica su inalazione di spore, che sono in grado di replicare nel polmone profondo. Fagocitosi di Cryptococcus dai macrofagi è uno dei modi in cui la malattia è in grado di diffondere nel sistema nervoso centrale per causare meningoencefalite letale. Pertanto, lo studio dell&#39;associazione tra Cryptococcus e macrofagi è importante per comprendere la progressione dell&#39;infezione. Il presente studio descrive un protocollo step-by-step per studiare macrofagi infettività da C. neoformans in vitro. Usando questo protocollo, il ruolo di steroli ospitanti sulle interazioni ospite-patogeno è studiato. Diverse concentrazioni di metile - ciclodestrina (MCD) sono stati usati per esaurire il colesterolo dal murino reticolo sarcoma macrofago-come linea cellulare J774A.1. Colesterolo esaurimento è stato confermato e quantificato utilizzando sia commercialmente available kit di colesterolo quantificazione e cromatografia su strato sottile. Cellule colesterolo impoverito sono stati attivati ​​mediante Lipopolysacharide (LPS) e interferone gamma (IFNγ) e infettati con anticorpi opsonizzati Cryptococcus neoformans wild-type cellule H99 ad un rapporto effettore-to-target di 1: 1. Le cellule infette sono stati monitorati dopo 2 ore di incubazione con C. neoformans e il loro indice di fagocitosi è stato calcolato. Colesterolo deplezione determinato una significativa riduzione dell&#39;indice fagocitaria. I protocolli presentati offrono un metodo conveniente per imitare l&#39;avvio del processo di infezione in un ambiente di laboratorio e studiare il ruolo della composizione lipidica host infettività.

Colesterolo Depletion Analisi del surnatante riservato al punto 1.3 del protocollo, seguendo le istruzioni del produttore del kit Colesterolo Assay Amplex Red produce un&#39;elevata concentrazione di colesterolo nel campione MβCD trattati rispetto al controllo 1x PBS. A seconda del tipo di cellula e l&#39;esaurimento colesterolo concentrazione MβCD utilizzato può variare. Per J774 trattati con MβCD 10 mM, è stato osservato un esaurimento di circa il 50%. Depletion può essere calcolato utilizzan...

In questo articolo viene descritto un protocollo per l'infezione dei macrofagi con Cryptococcus neoformans. Inoltre, viene spiegato un metodo per la deplezione degli steroli dai macrofagi. Questi protocolli forniscono una guida per studiare le infezioni fungine in vitro ed esaminare il ruolo degli steroli in tali infezioni.

Macrofagi Colesterolo Depletion e il suo effetto sulla fagocitosi di<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

L'obiettivo generale di questa procedura è chiarire il ruolo del colesterolo nell'assunzione di Cryptococcus neoformans da parte dei macrofagi. Ciò viene ottenuto innanzitutto rimuovendo il colesterolo da una linea cellulare murina di macrofagi mediante metil-beta-ciclodestrina. Successivamente, la carenza di colesterolo viene confermata e quantificata utilizzando la cromatografia su strato sottile e un kit commercialmente disponibile.Successivamente, le cellule di *Cryptococcus neoformans* vengono opsonizzate con anticorpi specifici per il componente gluc, xlo mannosio o GXMA della capsula del *Cryptococcus*. Infine, i macrofagi privati di colesterolo vengono infettati con *Cryptococcus neoformans* opsonizzato. In ultima analisi, vengono utilizzate la microscopia a contrasto di fase e la microscopia ottica per visualizzare le cellule infette e quantificare il grado di fagocitosi.I principali vantaggi di questa tecnica sono che può essere eseguita con attrezzature di laboratorio di base in un tempo relativamente breve e comunque ottenere risultati quantitativi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della patogenesi fungina. Ad esempio, qual è il ruolo degli innesti lipidici dell'ospite nell'ottica dei patogeni fungini?Le implicazioni di questa tecnica riguardano la terapia o la gestione dell'infezione da *occus* poiché l'internalizzazione all'interno dei macrofagi rappresenta una fase critica per l'avvio di cause gravi. Sebbene questi metodi possano fornire informazioni sull'infettività dei patogeni fungini, possono essere applicati anche ad altri organismi, come nei patogeni intracellulari obbligati. In un cabinet asettico a sicurezza biologica, seminare da 10 alla quinta cellule di tipo macrofagico J774.A1 per pozzetto di una piastra da coltura a 96 pozzetti. In 200 microlitri di DMEM integrato con 10% di FBS e 1% di penicillina-streptomicina (PS), incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% di CO2; il giorno seguente.Rimuovere il mezzo dal monostrato cellulare e lavare le cellule due volte con PBS filtrato o autoclavato. Aggiungere 200 microlitri di soluzione di metil beta ciclodestrina o embeta CD alla concentrazione desiderata oppure un XPBS come controllo e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione. Rimuovere il sopranatante e conservarlo a temperatura ambiente per l'analisi quantitativa con un kit disponibile in commercio.Immediatamente dopo questa procedura, lavare le cellule due o tre volte con PBS o DMEM privo di siero, prima di procedere alla quantificazione del colesterolo o all'infezione. Eseguire il passaggio di infezione dei macrofagi privi di colesterolo all'interno di una cappa a sicurezza biologica sterile. Seminare da 10 alla quinta cellule di tipo macrofagico per pozzetto.In una piastra a 96 pozzetti, incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% CO₂ contemporaneamente. Coltivare una cultura di C neoformans H 99 isolando una singola colonia da una piastra seminata e inoculando 10 millilitri di YNB; incubare tutta la notte a 30 gradi Celsius con agitazione, il giorno successivo. Centrifugare la cultura di C neoformans a 1.700 × g e 4 gradi Celsius per 10 minuti.Rimuovere il soprannatante e aggiungere cinque millilitri di 1x PBS prima di una nuova centrifugazione. Quindi utilizzare 1x PBS filtrato per lavare le cellule altre tre volte prima di risospendere le cellule in cinque millilitri di 1x PBS. Successivamente, per preparare un’opportuna diluizione in serie della coltura lavata, aggiungere 100 microlitri del campione originale a 900 microlitri di 1x PBS.Per ottenere una diluizione 1:10, aggiungere 100 microlitri del campione diluito 1:10 a 900 microlitri di PBS 1X per ottenere una diluizione 1:100. Infine, aggiungere 200 microlitri del campione diluito 1:100 a 800 microlitri di PBS 1X. Per ottenere una diluizione 1:500, aggiungere 10 microlitri della diluizione finale a un emocitometro e contare per calcolare il numero di cellule necessarie per preparare una soluzione lavorativa per l'attivazione dei macrofagi e l'opsonizzazione di c neoformans. Diluire l'LPS e l'interferone gamma 100 volte a partire dalle soluzioni stock diluendo 10 microlitri di ciascun composto in 990 microlitri di PBS. Per ogni campione, combinare 7,5 microlitri di LPS, 1,25 microlitri di interferone gamma, 1,25 microlitri di anticorpo GXM e 1,25 volte 10 alla quinta.Visualizzare le cellule di neo forman, quindi utilizzando DMEM integrato con FBS e Ps, portare il volume a 250 microlitri per campione. Vortexare la soluzione e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione prima di infettare i macrofagi. La deplezione del colesterolo può essere eseguita dopo la deplezione del colesterolo. Utilizzare DMEM privo di siero per lavarli due volte prima di aggiungere 200 microlitri di soluzione lavorativa di Opsonize C neoformans a ciascuno.Incubare bene per due ore a 37 gradi Celsius. Quindi fissare e colorare le cellule. Dopo aver lavato le cellule due volte con DMEM e aver lasciato asciugare all'aria lo strato monocellulare per 10 minuti, aggiungere 200 microlitri di fissativo di metanolo ghiacciato per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere tutto il metanolo residuo.Successivamente, aggiungere 200 microlitri di 10 x giza e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Poi lavare due o tre volte con acqua deionizzata, lasciare il tappo aperto e fare essiccare tutta la notte il giorno successivo o fino a una settimana dopo sotto un microscopio. Contare 300 cellule per ogni punto dati e annotare il numero di macrofagi infetti e il numero di cellule di cryptococcus inglobate.Calcolare l'indice acido di PHA moltiplicando la percentuale di macrofagi infetti per il numero medio di C neoformans per macrofago. Normalizzare l'indice acido F esprimendo i valori come percentuale rispetto al controllo trattato con XPBS. Dopo diverse prove, calcolare il valore medio e la deviazione standard della media per determinare le tendenze dell'indice acido F.Utilizzare il test T di Student per determinare la significatività, come mostrato qui. L'analisi del sopranatante prelevato da cellule trattate con M beta CD ha rivelato un aumento del colesterolo rispetto al sopranatante isolato da cellule di controllo con PBS, indicando un maggiore grado di deplezione del colesterolo nelle cellule trattate con M beta CD. La deplezione può essere calcolata utilizzando i valori di colesterolo ottenuti dal sopranatante e dal lisato cellulare, come illustrato qui, per supportare i risultati relativi alla deplezione del colesterolo.L'analisi del lisato cellulare mediante TLC mostra una marcata riduzione della colorazione del colesterolo nelle cellule trattate con concentrazioni crescenti di M beta CD citometria. L'analisi della TLC evidenzia una tendenza simile a quella del saggio quantitativo: dopo l'infezione, le cellule rimangono aderenti e integre, e la morfologia cellulare rimane invariata nelle cellule infettate da neoformans rispetto alle cellule di controllo non trattate. I micrografici di cellule infettate in modo ottimale mostrano chiaramente c neoformans inglobato all'interno delle cellule mammifere.Questo grafico dimostra che, calcolato su 300 cellule di macrofagi per gruppo di trattamento, si è osservata una riduzione dell'indice F acido nelle cellule prive di colesterolo. Una volta acquisita, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore, esclusi i tempi di incubazione che devono essere effettuati durante la notte seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'estrazione di membrane resistenti ai detergenti dai macrofagi, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio se la carenza di colesterolo riduca l'ottica di Cryptococcus influenzando i trapianti lipidici dell'ospite dopo il suo sviluppo.Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle membrane e dell'immunologia per comprendere i meccanismi della fagocitosi mediata dalle interazioni tra macrofagi e patogeni nei funghi patogeni. Non bisogna dimenticare che lavorare con agenti patogeni può essere estremamente pericoloso, e si devono sempre adottare precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale, durante l'esecuzione di questa procedura.

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Esaurimento e Ricostituzione dei macrofagi nei topi

In questo video, dimostriamo un test di citotossicità per valutare l'infezione da Cryptococcus neoformans, un fungo patogeno, nei macrofagi. La citotossicità è determinata dal rilascio dell'enzima lattato deidrogenasi citoplasmatico dovuto alla lisi dei macrofagi causata dall'infezione da Cryptococcus neoformans.

Un test di rilascio di lattato deidrogenasi per rilevare l'infezione da Cryptococcus neoformans nei macrofagi

Questo video mostra un metodo per valutare l'impatto dell'aspirina e dell'ibuprofene, alle loro concentrazioni minime inibitorie, sulla fagocitosi dei macrofagi utilizzando cellule fungine colorate con colorante fluorescente sensibili al pH. I farmaci inibiscono la cicloossigenasi-2, diminuendo la formazione di prostaglandine e aumentando la fagocitosi dei macrofagi, come osservato attraverso misurazioni a fluorescenza di colorante sensibile al pH.

L'effetto dell'aspirina e dell'ibuprofane sulla capacità fagocitaria dei macrofagi

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Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Un metodo per valutare la capacità di isolato macrofagi alveolari del mouse per controllare la crescita di spore di Aspergillus fagocitati mediante microscopia confocale.

Valutare l&#39;attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

Descriviamo come visualizzare macrofagi C. neoformans (Cn) interazioni in tempo reale, con particolare enfasi sul processo di esocitosi non-litica mediante microscopia ottica digitale. Utilizzando questa tecnica individuale macrofagi infetti può essere studiato per accertare i vari aspetti di questo fenomeno.

Visualizzazione non-litica Esocitosi di Cryptococcus neoformans Dai macrofagi utilizzando la luce Microscopia Digitale

Qui presentiamo un protocollo per quantificare la fagocitosi delle particelle fluorescenti da parte di una linea cellulare di macrofagi aderenti utilizzando un metodo fluorimetrico. Questo metodo facilita una quantificazione ad alto rendimento dell'internalizzazione delle particelle e della conseguente polimerizzazione dell'actina.

Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

Viene presentato un protocollo per la coltura cellulare di macrofagi derivati da monociti umani differenziati da fattori stimolanti le colonie di macrofagi (M-CSF). Il protocollo utilizza la crioconservazione dei monociti accoppiata alla loro differenziazione di massa in macrofagi. Quindi i macrofagi raccolti possono essere seminati in pozzetti di coltura alle densità cellulari richieste per l'esecuzione degli esperimenti.

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

Descriviamo un metodo per misurare la velocità dei fagosomi che si muovono verso il centro cellulare in cellule viventi infettate con o senza il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) di tipo 1, utilizzando la microscopia a fluorescenza confocale a disco rotante per identificare le cellule infette fluorescenti e la microscopia a campo chiaro per rilevare i fagosomi.

Migrazione phagosome e velocità misurata in Live primarie macrofagi umani infettati con HIV-1

I lipidi sono noti per svolgere un ruolo importante nelle funzioni cellulari. Qui, si descrive un metodo per determinare la composizione lipidica di neutrofili, con enfasi sul livello di colesterolo, utilizzando sia HPTLC e HPLC per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi alla base di neutrofili extracellulare formazione trappola.

Metodi per studiare lipidiche Alterazioni nei neutrofili e la formazione successiva di neutrofili extracellulare Traps

Qui viene presentato un protocollo per quantificare e produrre immagini dinamiche della regolazione mediata da cellule staminali mesenchimali (MSC) della fagocitosi macrofagica (MΦ) di particelle di lievito non opsonizzato (zymosan) coniugate a una molecola fluorescente sensibile al pH.

Regolazione mesenchimale delle cellule staminali della fagocitosi dei macrofagi; Quantificazione e imaging

Scopri come depletere il colesterolo dai macrofagi per studiare la fagocitosi di Cryptococcus neoformans. Questo protocollo utilizza metil beta ciclodestrina e microscopia per analizzare le interazioni patogeno-ospite in vitro.

Macrofagi Colesterolo Depletion e il suo effetto sulla fagocitosi di

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