Mass quantitativa spettrometrica Profiling di proteomi cancro-cellulari derivate da liquido e tumori solidi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di chiarire i profili di espressione proteica dei tumori liquidi e solidi. Ciò si ottiene arricchendo prima le cellule tumorali da campioni di sangue o tessuto derivati dal paziente. Nella seconda fase, le proteine vengono isolate dalle cellule tumorali e quindi mescolate con uno standard di quantificazione del susac specifico per il tumore.

Nella fase finale, la miscela proteica viene digerita. In definitiva, la spettrometria di massa viene utilizzata per mostrare i profili di espressione proteica da tumori liquidi e solidi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'oncologia e della patologia, ad esempio come si possono identificare i bersagli farmacologici e i meccanismi di resistenza alla terapia?

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla scoperta di biomarcatori, può essere applicato anche ad altri sistemi come l'indagine su diversi tumori, solidi e liquidi. A dimostrare la procedura saranno il Dr.Hannibal Berger Institute for Pathology e il Dr.Christophe Lanz del mio laboratorio Per preparare le cellule tumorali liquide per la selezione fluorescente mediante citometria a flusso, iniziare citando Ali citando un millilitro del campione di cellule mononucleate umane sospeso in PBS più il 2% di FBS per il controllo negativo e un millilitro per ogni colorante fluorescente utilizzato nella colorazione finale. Successivamente, incubare le cellule con gli anticorpi appropriati per isolare la popolazione di cellule leucemiche e per i controlli di compensazione sul ghiaccio.

Dopo 30 minuti, lavare le celle due volte con PBS più 2% FCS. Quindi aggiungere un colorante di vitalità cellulare alle provette appropriate e ordinare le cellule secondo lo schema. Raccolta dei campioni in IMDM più 10%FCS per raccogliere tumori solidi mediante microdissezione a cattura laser.

Innanzitutto, utilizzare un microtomo per tagliare sezioni spesse da cinque a 10 micrometri da campioni inclusi in paraffina fissata con formina. Successivamente, montare le sezioni su vetrini a membrana ricoperti di pellicola e asciugare i campioni a 37 gradi Celsius dopo un'ora. Distribuire e reidratare le sezioni mediante incubazioni successive di un minuto in etanolo assoluto xilene, etanolo al 70% e acqua.

Quindi colorare le sezioni con ematina per 20 secondi. Sciacquarli con acqua di rubinetto e raccogliere le cellule di interesse con il sistema di microdissezione a cattura laser per estrarre le proteine dalle cellule tumorali liquide selezionate. Centrifugare il campione tre volte, lavando le cellule in 500 microlitri di PBS freddo durante le seconde due centrifugazioni.

Successivamente, incubare le cellule in 40 microlitri di tampone di lisi per una volta 10 per le sei cellule. Dopo 15 minuti, centrifugare il lisato e trasferire il lisato chiaro contenente surnatante in una nuova provetta di reazione per estrarre la proteina dalle cellule tumorali solide micro sezionate. Incubare il campione di tessuto con 60 microlitri di tampone di lisi tissutale a 72 gradi Celsius.

Dopo 15 minuti, prelevare il fluido mediante una breve centrifugazione e trasferire il surnatante in una nuova provetta di reazione. Quindi sonicare il lisato su ghiaccio per tre minuti, seguito da un'incubazione con 15 microlitri che hanno il 20% di solfato ESAL di sodio a 99 gradi Celsius in un blocco riscaldante con 600 giri/min di agitazione. Dopo un'ora, centrifugare il lisato e trasferire la Sinatina in una nuova provetta.

Successivamente, determinare le concentrazioni proteiche dello standard cellulare e super SLAC eliminato, quindi mescolare quantità uguali di pezzi di cellule tumorali con lo standard super SLAC, seguito dal litio. Eseguire il tampone solfato desalinico al 25% del volume del campione e l'agente riducente al 10% del volume del campione. Quindi riscaldare la soluzione risultante in un blocco riscaldante per 10 minuti a 72 gradi Celsius.

Per misurare la concentrazione proteica del lisato tumorale solido su un lettore di piastre, miscelare una serie standard di soluzioni di diluizione di albumina sierica bovina, il lisato e lo standard super SLAC appropriato con un saggio proteico disponibile in commercio e una piastra a 96 pozzetti. Dopo un minuto di agitazione, incubare il campione per il periodo di tempo appropriato e misurare l'assorbanza come indicato dal produttore. Quindi mescolare quantità uguali di lisato chiarificato e lo standard super SLAC con 200 microlitri di urea in un'unità filtrante e centrifugare i campioni per 30 minuti.

Analizzare i lisati delle cellule tumorali mediante cromatografia liquida e analisi spettrometrica di massa. Iniziare risolvendo i peptidi di interesse in 30 microlitri di tampone di carico per cinque minuti in un bagno di sonicazione. Quindi far girare la proteina e trasferire il surnatante chiaro in una fiala di campionatore automatico per spettrometria di massa.

Successivamente, iniettare cinque microlitri di campione per analisi nel nano lc, nel sistema ms MS autos, nel campionatore e nel concentrato e desalinizzare i peptidi online in una configurazione di colonna preco preco a fase invertita C 18 montata e ventilata. Infine, separare i peptidi su una microcolonna C 18 a fase invertita in una colonna di spruzzo nanos autogestita. Utilizzando un gradiente di 90 minuti dal 5 al 35% di acetil nitrile rispetto allo 0,1% di acido formico acquoso a 300 nanolitri al minuto, quindi utilizzare una fonte di ioni nano spray per trasferire ient e analizzare i peptidi.

Utilizzando un metodo di acquisizione dipendente dai dati tra i primi 15, è possibile utilizzare diversi tipi di spettrometri di massa per analizzare i peptidi. La profilazione proteomica di tumori liquidi e solidi di pazienti è un approccio promettente per la scoperta di nuovi biomarcatori diagnostici e predittivi. Ad esempio, questa prima figura dimostra una strategia di gating esemplare per isolare le cellule leucemiche con 17 colorazioni di CD 1 da un campione di tumore liquido.

Mentre qui, una sezione spessa da cinque a 10 micrometri montata su vetrini a membrana ricoperti da film, come appena dimostrato. Come mostrato, una regione di interesse è stata quindi selezionata manualmente e asportata mediante micro dissezione a cattura laser, l'analisi dei cluster non supervisionata dei profili di espressione proteica di campioni tumorali liquidi e solidi può quindi essere eseguita mediante spettrometria di massa, consentendo la netta separazione delle diverse entità tumorali in base ai loro distinti profili di espressione proteica. Questi dati possono quindi contribuire alla creazione di biomarcatori clinicamente rilevanti.

L'implementazione di strategie di arricchimento per modifiche post-traduzionali come la fosforilazione o la ventilazione UIC può anche essere eseguita per rispondere a ulteriori domande come: come possono essere identificati i pattern chinasici disregolati dopo il suo sviluppo? Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della patologia e dell'oncologia per esplorare i biomarcatori specifici e le vie di segnalazione in una varietà di entità tumorali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le proteine dai tumori come sottopopolazioni per analizzare i loro modelli di espressione proteica e gli stati di segnalazione mediante spettrometria di massa.