Name: Bile Duct Ligation in topi: Induzione infiammatoria epatica Lesioni e fibrosi da colestasi ostruttiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Impara la legatura del dotto biliare nei topi per indurre fibrosi epatica sperimentale. Questo metodo riproducibile consente di studiare la progressione della fibrogenesi epatica attraverso l'analisi istologica del collagene.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno finanziario della Fondazione Tedesca per la Ricerca (SFB / TRR57, Q3 e Q2). Gli autori ringraziano Mareike Schulz, Pascal Paschenda, e Klaudia Warzecha per il loro aiuto nella preparazione fotografie.

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla cura degli animali dello Stato e uso comitato ufficiale (LANUV, Recklinghausen, Germania). I topi sono alloggiati in condizioni specifiche del-libera patogeni secondo le linee guida della Federazione per il laboratorio scientifico Associazioni animali (FELASA). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la legge federale tedesca in materia di protezione degli animali e &#39;Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio&#39; (National Institutes of Health pubblicazione 8 ° edizione, 2011). 1. prechirurgica Preparazione NOTA: Eseguire tutte le operazioni in condizioni di pulizia, ma non sterili. Tutti gli strumenti e altre attrezzature riutilizzabili, come pinze chirurgiche, forbici, e Colibri divaricatore che vengono utilizzati per eseguire un intervento chirurgico devono essere sterilizzati prima dell&#39;uso secondo protocolli che sono in stretta conformità con le linee guida istituzionali per l&#39;esecuzione di interventi chirurgici negli animali., Per un elenco dettagliato dei necessari reagenti, materiali e attrezzature, si prega di consultare l&#39;elenco dei materiali specifici / attrezzature. <ol><li> Durante la sperimentazione completa, mantenere l&#39;animale su una piastra di riscaldamento ad una temperatura di 37 ° C, permanentemente collegata ad un sistema di anestesia, e la copertura della zona operativa complessiva con, tende autoadesive impermeabile al fluido. Correttamente organizzare tutti strumentazioni e le soluzioni che vengono utilizzati durante la sperimentazione prima della chirurgia (Figura 1). </li><li> Anestetizzare il mouse con inalazione di 4 vol% isoflurano in ossigeno al 100% con una portata di 4 l / min per l&#39;induzione di anestesia. La profondità di anestesia è sufficiente al raggiungimento dei seguenti criteri fondamentali: la respirazione regolare spontanea, senza il riflesso dopo aver impostato di stimoli del dolore tra le dita dei piedi, e nessuna risposta al dolore. </li><li> Accorciare il pelo addominale del mouse con un rasoio elettrico pelliccia e proteggere gli occhi dalla disidratazione da uso dell&#39;occhio e nose pomata. </li><li> Posizionare il mouse su una piastra calda riscaldata 37 ° C, inserire il muso mouse nella maschera Fluovac del sistema di anestesia Fluovac, e fissare le gambe dell&#39;animale con strisce di nastro seta. </li><li> Mantenere anestesia del mouse per inalazione di 1,5-3% vol isoflurano in ossigeno al 100% ad una velocità di flusso di 1 l / min e induct analgesia perioperatoria tramite iniezione intraperitoneale di soluzione di buprenorfina (0,1 mg / kg di peso corporeo sciolto in 0,9% soluzione di NaCl) . </li><li> Sterilizzare la pelle addominale rasata con un tampone di garza che viene inumidito con uno standard antisettico, pronta all&#39;uso soluzione alcolica per il trattamento pre-operatorio della pelle. Nota: Nei nostri protocolli usiamo una pelle antisepticum poli-alcool. Questo è in pieno accordo con la legge federale tedesca in materia di protezione degli animali e delle linee guida della Federazione per laboratorio scientifico Associazioni animali. Questo antisettica contiene il 70% (v / v) 2-propanolo, butan-1,3.diol e tracce di chinolina giallo, e perfume. </li></ol> 2. Procedure chirurgiche <ol><li> Aprire l&#39;addome con una laparotomia mediana di una lunghezza di circa 2 cm tagliando la cute più fascia allo stesso tempo con una forbice chirurgica 11,5 centimetri. </li><li> Sezionare il tessuto connettivo sopra del peritoneo utilizzando il forbice come spreader. </li><li> Tagliare il peritoneo lungo la linea alba per aprire la cavità peritoneale. </li><li> Ingrandire la cavità inserendo una sutura partecipazione in sterno, sollevando il filamento della sutura, e fissandolo in cima alla maschera Fluovac. </li><li> Distribuire la zona di operazione inserendo un riavvolgitore Colibri nella cavità peritoneale (Figura 2). </li><li> Sollevare il fegato con una idratata (0,9% NaCl soluzione) il tampone in modo che il lato ventrale si attacca alla membrana e l&#39;ilo è chiaramente visibile. </li><li> Esporre il dotto biliare dal movimento caudale dell&#39;intestino (Figura 3). </li><li> Separare con attenzione il dotto biliare dalaccompagnamento vena porta e dell&#39;arteria epatica utilizzando un micro-dentellature pinza (Figura 4A). </li><li> Posizionare il 5-0 sutura intorno al dotto biliare e fissarlo con due nodi chirurgici. Nel legare i nodi aumentano la forza di trazione continuamente per garantire ostruzione efficace senza recidere il dotto biliare (Figura 4B). </li><li> Aggiungere una seconda legatura cranica nello stesso modo, ma non sezionare il dotto biliare tra (Figura 4C). In caso contrario, vi è un notevole rischio che le perdite biliari se un nodo non è sicuro, e agli animali nessun colestasi ma sviluppano peritonite gravi. </li><li> Tagliare le estremità delle suture (Figura 4D), abbassare lo sterno, e rimuovere il riavvolgitore. </li><li> Risciacquare la cavità peritoneale con 0,9% di soluzione di NaCl e sostituire gli organi addominali alle posizioni fisiologiche. </li><li> Chiudere entrambi addominali strati (peritoneo e cute più plancia) con punti di sutura in esecuzione separati con 6-0 Mersilk. </li><li> Tagliare la postands delle suture e sterilizzare l&#39;area operazione con un tampone di garza inumidito con soluzione antisettica. NOTA: Quando si esegue l&#39;intervento chirurgico per la prima volta, eseguire tutte le procedure sotto un microscopio operatorio con un ingrandimento di 16X-20X. Questo permette un migliore riconoscimento del dotto biliare e chiaramente distingue dalla vena porta e l&#39;arteria epatica (figure 5 e 6). Alcuni laboratori raccomandano la dissezione del dotto biliare tra le due legature. Lasciare il dotto biliare intatto perché potenziali perdite in uno dei nodi si tradurrà in una grave peritonite acuta, ascite, e endotossemia sistemica quando il dotto biliare è sezionato. </li></ol> 3. postoperatoria trattamento e il follow-up <ol><li> Lasciare che il mouse per recuperare in una gabbia riscaldato da una lampada a infrarossi fino a quando il mouse è completamente sveglio e attivo. </li><li> Successivamente, spostare il mouse in una gabbia normale e fornire ad libitum accesso ad acqua e cibo. </li><li> Laopo l&#39;intervento chirurgico, controllare gli animali ad intervalli regolari ed effettuare il follow-up il trattamento post-operatorio con analgesia adeguata (ad esempio, la soluzione buprenorfina) in seguito alla raccomandazione locale della cura degli animali e l&#39;uso interno comitati. NOTA: Eseguire la terapia analgesica per 3 giorni. Qualsiasi comportamento anomalo può indicare complicanze rare come peritonite, sepsi o emorragie interne e deve essere trattato come endpoint umana di interrompere l&#39;esperimento. </li><li> Gli animali vengono tenuti con libero accesso a cibo e acqua ad libitum fino alla fine dell&#39;esperimento. Non vi è alcuna necessità di prelievo di sangue dal fibrogenesi corso è indicato da ittero. </li><li> Quando gli animali vengono sacrificati, il sangue viene raccolto per la misura dei parametri clinici chimica (AST, ALT, bilirubina, ecc) e il fegato viene recuperato per l&#39;analisi istochimica e biochimica. </li></ol>

<ol><li>Liedtke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+liver+fibrosis+research%3A+update+on+animal+models%2C+legal+issues+and+translational+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+Tissue+Repair%22%5BJournal%5D)">Experimental liver fibrosis research: update on animal models, legal issues and translational aspects.</a> Fibrogenesis Tissue Repair. 6 (1), 19(2013).</li>
<li>Aller, M. A., Arias, J. L., García-Domínguez, J., Arias, J. I., Durán, M., Arias, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+obstructive+cholestasis%3A+the+wound-like+inflammatory+liver+response%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+Tissue+Repair%22%5BJournal%5D)">Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response.</a> Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 6(2008).</li>
<li>Tacke, F., Weiskirchen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+hepatic+stellate+cells%3A+pathogenic+role+in+liver+fibrosis+and+novel+isolation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques.</a> Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).</li>
<li>Weiler-Normann, C., Herkel, J., Lohse, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Mouse models of liver fibrosis.</a> Z. Gastroenterol. 45 (1), 43-50 (2007).</li>
<li>Cameron, G. R., Oakley, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+of+the+common+bile+duct%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ligation of the common bile duct.</a> J. Pathol. 35 (5), 769-798 (1932).</li>
<li>Cameron, G. R., Hasan, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbances+of+structure+and+function+in+the+liver+as+the+result+of+biliary+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Disturbances of structure and function in the liver as the result of biliary obstruction.</a> J. Pathol. 75 (2), 333-349 (1958).</li>
<li>Accatino, L., Contreras, A., Fernańdez, S., Quintana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+complete+biliary+obstruction+on+bile+flow+and+bile+acid+excretion%3A+postcholestatic+choleresis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">The effect of complete biliary obstruction on bile flow and bile acid excretion: postcholestatic choleresis in the rat.</a> J Lab Clin Med. 93 (5), 706-717 (1979).</li>
<li>Accatino, L., Contreras, A., Berdichevsky, E., Quintana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+complete+biliary+obstruction+on+bile+secretion.+Studies+on+the+mechanisms+of+postcholestatic+choleresis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">The effect of complete biliary obstruction on bile secretion. Studies on the mechanisms of postcholestatic choleresis in the rat.</a> J Lab Clin Med. 97 (4), 525-534 (1981).</li>
<li>Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+bile+duct+obstruction%3A+a+new+experimental+model+for+cirrhosis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat.</a> Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).</li>
<li>Tuchweber, B., Desmoulière, A., Bochaton-Piallat, M. L., Rubbia-Brandt, L., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+phenotypic+modulation+of+portal+fibroblasts+in+the+early+stages+of+cholestatic+fibrosis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat.</a> Lab Invest. 74 (1), 265-278 (1996).</li>
<li>Desmoulière, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+deposition%2C+lysyl+oxidase+expression%2C+and+myofibroblastic+differentiation+during+the+initial+stages+of+cholestatic+fibrosis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix deposition, lysyl oxidase expression, and myofibroblastic differentiation during the initial stages of cholestatic fibrosis in the rat.</a> Lab Invest. 76 (6), 765-778 (1997).</li>
<li>Arias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+expression+of+a+transforming+growth+factor-%CE%B21+antisense+mRNA+is+effective+in+preventing+liver+fibrosis+in+bile-duct+ligated+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Adenoviral expression of a transforming growth factor-β1 antisense mRNA is effective in preventing liver fibrosis in bile-duct ligated rats.</a> BMC Gastroenterol. 3 (29), (2003).</li>
<li>Borkham-Kamphorst, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant-negative+soluble+PDGF-%CE%B2+receptor+inhibits+hepatic+stellate+cell+activation+and+attenuates+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Dominant-negative soluble PDGF-β receptor inhibits hepatic stellate cell activation and attenuates liver fibrosis.</a> Lab. Invest. 84 (6), 766-777 (2004).</li>
<li>Borkham-Kamphorst, E., Huss, S., Van de Leur, E., Haas, U., Weiskirchen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+CCN3%2FNOV+gene+transfer+fails+to+mitigate+liver+fibrosis+in+an+experimental+bile+duct+ligation+model+because+of+hepatocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Adenoviral CCN3/NOV gene transfer fails to mitigate liver fibrosis in an experimental bile duct ligation model because of hepatocyte apoptosis.</a> Liver Int. 32 (9), 1342-1353 (2012).</li>
<li>Borkham-Kamphorst, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-fibrotic+effects+of+CCN1%2FCYR61+in+primary+portal+myofibroblasts+are+mediated+through+induction+of+reactive+oxygen+species+resulting+in+cellular+senescence%2C+apoptosis+and+attenuated+TGF-%CE%B2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The anti-fibrotic effects of CCN1/CYR61 in primary portal myofibroblasts are mediated through induction of reactive oxygen species resulting in cellular senescence, apoptosis and attenuated TGF-β signaling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1843 (5), 902-914 (2014).</li>
<li>Huss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+open+source+Delphi-based+software+for+morphometric+quantification+of+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+Tissue+Repair%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an open source Delphi-based software for morphometric quantification of liver fibrosis.</a> Fibrogenesis Tissue Repair. 3 (1), 10(2010).</li>
<li>Borkham-Kamphorst, E., Drews, F., Weiskirchen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+lipocalin-2+expression+in+acute+and+chronic+experimental+liver+injury+moderated+by+pro-inflammatory+cytokines+interleukin-1%CE%B2+through+nuclear+factor-%CE%BAB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Induction of lipocalin-2 expression in acute and chronic experimental liver injury moderated by pro-inflammatory cytokines interleukin-1β through nuclear factor-κB activation.</a> Liver Int. 31 (5), 656-665 (2011).</li>
<li>Karlmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractalkine+receptor+CX3CR1+protects+against+liver+fibrosis+by+controlling+differentiation+and+survival+of+infiltrating+hepatic+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The fractalkine receptor CX3CR1 protects against liver fibrosis by controlling differentiation and survival of infiltrating hepatic monocytes.</a> Hepatology. 52 (5), 1769-1782 (2010).</li>
<li>Tarcin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+collagen+peak+in+bile+duct-ligated+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Time course of collagen peak in bile duct-ligated rats.</a> BMC Gastroenterol. 11, 45(2011).</li>
<li>Takase, S., Leo, M. A., Nouchi, T., Lieber, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmin+distinguishes+cultured+fat-storing+cells+from+myofibroblasts%2C+smooth+muscle+cells+and+fibroblasts+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Desmin distinguishes cultured fat-storing cells from myofibroblasts, smooth muscle cells and fibroblasts in the rat.</a> J. Hepatol. 6 (3), 267-276 (1988).</li>
<li>Borkham-Kamphorst, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+lipocalin-2+%28LCN2%29+in+acute+liver+injury+suggest+a+novel+function+in+liver+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Protective effects of lipocalin-2 (LCN2) in acute liver injury suggest a novel function in liver homeostasis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1832 (5), 660-673 (2013).</li>
<li>Labbus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+in+Lipocalin+2+deficient+mice+under+normal+and+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling in Lipocalin 2 deficient mice under normal and inflammatory conditions.</a> J Proteomics. 78, 188-196 (2013).</li>
<li>Kirkland, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+surgical+model+of+biliary+inflammation+and+obstructive+jaundice+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice.</a> J. Surg. Res. 164 (2), 221-227 (2010).</li>
<li>Heinrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+bile+duct+ligation+in+mice%3A+a+novel+model+of+acute+cholestasis%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis.</a> Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).</li>
<li>Scholten, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+labeling+does+not+detect+epithelial-to-mesenchymal+transition+of+cholangiocytes+in+liver+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Genetic labeling does not detect epithelial-to-mesenchymal transition of cholangiocytes in liver fibrosis in mice.</a> Gastroenterology. 139 (3), 987-998 (2010).</li>
<li>Aller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+%281961-2011%29+of+applying+microsurgery+to+experimental+liver+research%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A half century (1961-2011) of applying microsurgery to experimental liver research.</a> World J Hepatol. 4 (7), 199-208 (2012).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , London, Methuen. (1959).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Danno epatico colestatica è uno dei principali fattori causali per lo sviluppo di fibrosi epatica e cirrosi nei pazienti con malattia epatica cronica. Sulla base del fatto che queste malattie producono costi sanitari imponderabili, è comprensibile che molti ricercatori stanno cercando di capire i meccanismi patogenetici della fibrosi epatica in corso. Pertanto, modelli sperimentali sono stati generati che imitano i vari aspetti dei complessi meccanismi che portano alla infiammazione epatica, fibrosi e cirrosi 1. Chirurgico BDL è uno dei più diffusi modelli sperimentali che viene utilizzato per indurre lesioni colestatico ostruttiva in topi e ratti 4,23,24. Nella maggior parte dei protocolli, gli animali sono anestetizzati e viene eseguita una laparotomia tronco. Successivamente, il dotto biliare è scoperto dalla cavità addominale e ligato due volte con spago chirurgica. Di conseguenza, i topi e ratti che hanno ricevuto questa chirurgia dEvelop una forte reazione fibrotica che in un primo momento provengono dai campi periportali 25. Nel corso degli anni sono state descritte diverse tecniche chirurgiche e modifiche diverse. Procedure speciali anche permettere riconnessione o reanastomosis dopo BDL 23. Altre tecniche sono basate sulla parziale BDL conseguente significativamente minore formazione di necrosi e conseguentemente epatociti proliferazione 24. Parziale BDL in combinazione con successiva rimozione della colecisti (colecistectomia), che impedisce la formazione di colecistite rappresenta anche un ottimo modello sperimentale per colestasi acuta. È stato proposto di essere un modello che è più vicino alla situazione umana 24. E infatti, durante la creazione di questo modello, si è già dimostrato che provoca riproducibile colestasi con solo il minimo danno tissutale istologico e di non luogo a colestasi cronica 25. Pertanto, è stato suggerito che questo modello è ideale per studiare late gli effetti di colestasi invertito 24. Anche metodi più sofisticati sono basati su microchirurgia e permettono un modo veloce e riproducibile per infliggere danno epatico colestatico solo in parti selezionate del fegato 26. Anche se queste modifiche sofisticati dal protocollo originale BDL sono stati dimostrati molto utili nelle indagini domande di ricerca specifiche, molti laboratori in tutto il mondo fondamentalmente lo scopo di impiegare il modello BDL come modello altamente riproducibile e affidabile per la fibrosi epatica colestatica. Tuttavia, molte complicazioni possono verificarsi che possa alterare sostanzialmente la riproducibilità e affidabilità dei risultati ottenuti da questo modello, se imprecisioni tecniche non sono evitati. Ad esempio, complicanze emorragiche legate a lesioni dei vasi sanguigni che accompagnano il dotto biliare (vedi figure 3 - 4) possono verificarsi durante o dopo l&#39;intervento chirurgico rapidamente. Sovradosaggio di anestesia con conseguente cardiodepression o rfallimento espiratory sono anche complicazioni evitabili della procedura. Infezioni gravi, che vanno da peritonite a sepsi, possono verificarsi durante l&#39;intero periodo dell&#39;esperimento, se le suture non vengono eseguite accuratamente e perdite biliari nella cavità peritoneale. Lesioni accidentali a livello intestinale durante l&#39;intervento chirurgico potrebbe anche portare alla peritonite. Pertanto, è evidente che sono fortemente necessari protocolli standardizzati che sono in conformità con le linee guida movimentazione rigorose. Questa clausola è stata anche recentemente chiesto nei paesi dell&#39;Unione europea, che ha recepito le nuove norme sul benessere degli animali nel 2013 1. I rispettivi requisiti che sono associati con questo regolamento non sono nuove e sono state già proposte nel 1959, quando Russell e Burch suggerito etico quadro per condurre esperimenti scientifici con animali che si basa principalmente su una sostituzione, miglioramento e riduzione (3R) Principio 27. Quando dopo la outlinprotocollo ed ci sono solo alcune complicazioni che potrebbero derivare da imprecisioni tecniche. Tre questioni specifiche potrebbero verificarsi in piuttosto bassa frequenza. Come per tutte le procedure chirurgiche, l&#39;overdose di anestetico è una potenziale fonte di pericolo per gli animali specialmente in combinazione con ipotermia. Se durante l&#39;intervento verificano complicanze cardiovascolari, la fornitura di anestetici deve essere immediatamente interrotto e l&#39;operatore deve cercare di fornire il più possibile di ossigeno al mouse. Questo può essere fatto per mezzo di una piccola siringa plastica che è riempito di aria e pompato nella bocca dell&#39;animale alterata. In alternativa, l&#39;uso di una piccola Peleusball per la ventilazione dell&#39;animale colpito è spesso utile per il processo di rivitalizzazione. Problemi di guarigione delle ferite Dopo l&#39;intervento chirurgico BDL, i topi possono mordere le loro giunture doloranti o quelli di altri animali. In questo caso, rispettivi topi dovrebbero essere distintamentegabbia. Gli animali con ferite aperte devono essere anestetizzati, la regione intorno alla ferita delicatamente sterilizzato con un antisettico standard e la ferita deve essere ricucita di nuovo. Durante i prossimi 3 giorni, la ferita di questi animali dovrebbero essere regolarmente ispezionati (due o tre volte al giorno). Distensioni dell&#39;addome o formazione di ascite sono indicativi per le infezioni batteriche. Questi potrebbero verificarsi a causa di lavoro non sterile durante l&#39;intervento chirurgico. Tutti i tipi di infezioni deve essere maneggiato senza eccezioni come endpoint umano e gli animali colpiti deve essere sacrificato. Abbiamo fornito un facile seguire protocollo che permette l&#39;esecuzione di BDL nei topi che è semplice da implementare e evoca la mortalità degli animali solo bassa combinata con una elevata riproducibilità. Tutti i protocolli chirurgici possono essere rapidamente fermati da scienziati qualificati. Durante la sperimentazione completa, gli animali sono mantenuti su una piastra riscaldante a 37 ° C e collegati permanentementea un sistema di anestesia minimizzare il dolore e angoscia. Per la chirurgia, l&#39;addome è aperto con una laparotomia mediana e il dotto biliare doppia legatura senza analizzarlo. I risultati rappresentativi che sono state discusse qui dimostrano che le alterazioni fenotipiche in materia di morfologia del fegato (infiammazione, la fibrosi, cirrosi) sono altamente riproducibili e permettono di studiare diversi aspetti della fibrogenesi (ad es., L&#39;iniziazione, l&#39;infiammazione, la progressione, stadio terminale della malattia) in punti temporali definiti. Ci auguriamo che la sintesi del nostro protocollo contribuirà a ridurre la curva di apprendimento che è necessario stabilire con successo questo modello di fibrosi in altri laboratori e garantire risultati affidabili e riproducibili in luoghi diversi. In tal modo riteniamo che il protocollo presentato sostiene il principio 3R che avrebbe dovuto da Russell e Burch nel 1959 e rappresenta la base di nuove norme sul benessere degli animali che sono attualmente implementate in molti paesi wisottile il quadro europeo.

Fibrosi epatica è definita come la eccessiva produzione e l&#39;accumulo di matrice extracellulare (ECM) che proviene da una rete complessa di interazioni di cellule stellate epatiche matrice produttrici e una grande varietà di cellule del sangue fegato residente e cellule infiltranti 1,2. Anche se la fibrosi epatica può essere causata da una moltitudine di stimoli diversi meccanismi molecolari alla base della fibrosi sono generalmente molto simili. A seguito di danno epatico, viene avviato un programma altamente orchestrata di cambiamenti molecolari e cellulari. In questo programma di una stretta interazione tra segnali infiammatori, monociti / macrofagi e cellule stellate epatiche si verifica che i risultati finali di attivazione delle cellule stellate e transdifferenziamento di miofibroblasti, ECM deposizione e consecutivi alterazioni anatomiche e funzionali di integrità tessuto epatico 3. L&#39;attivazione delle cellule stellate epatiche è particolarmente guidato da segnali infiammatori e interazioni con il fegatomacrofagi residenziali (cioè le cellule di Kupffer). Modelli molecolari associati patogeni sono riconosciuti dai recettori di pattern recognition specializzati come i recettori Toll-like che quando il segnale attivato attraverso una complessa rete di percorsi diversi che attivano l&#39;espressione e la secrezione di una moltitudine di citochine infiammatorie e chemochine che guidano il processo infiammatorio 3. La risposta infiammatoria e l&#39;insulto epatica formato è solo temporaneo quando il fattore-malattia che producono viene rimosso. Al contrario, se la lesione persiste, infiammazione cronica evolve nel fegato e l&#39;espressione e l&#39;accumulo di folle ECM in primo piano con conseguente progressiva sostituzione del parenchima epatico normale dalla formazione di tessuto cicatriziale. Dal fibrogenesi epatica nell&#39;uomo è un problema clinico in tutto il mondo, diversi modelli di roditori sperimentali di insufficienza epatica acuta e cronica sono stati stabiliti nel corso degli ultimi decenni. Nelle muSistema rine per esempio, modelli comuni sono la somministrazione di una varietà di diversi epatotossine, la legatura del dotto biliare comune, induzione di danno epatico immuno-mediata, e l&#39;introduzione mirata di difetti genetici o viceversa la sovraespressione di transgeni che colpiscono critico vie di segnalazione coinvolte nella patogenesi della fibrosi epatica 4. Legatura del dotto biliare comune nei roditori è stata effettuata come procedura sperimentale ricerca per molti anni 5-8. Un primo protocollo altamente riproducibile per la legatura del dotto biliare prolungata (BDL) nei roditori è stato già presentato ormai più di tre decenni fa 9. In questo protocollo sia incannulamento / ostruzione e legatura indotto un alto rendimento di cirrosi nei ratti con cambiamenti morfologici che erano paragonabili a quelli osservati nella cirrosi biliare umano 9. Il rispettivo protocollo è semplice, la procedura chirurgica è relativamente rapidamente applicabile, E il tasso di sopravvivenza degli animali sono elevati con oltre il 95%. Nel protocollo di ratto incannulamento / ostruzione classica, una breve incisione di 2 cm è fatto sotto il processo xifoideo. Successivamente, una cannula viene inserito nella porzione prossimale del dotto biliare e fissato in posizione con suture di seta. In una fase successiva, la porzione distale della cannula è ostruita con 3 nodi, messo attraverso l&#39;estremità inferiore della incisione mediana e sepolto sottocutanea nel quadrante destro inferiore 9. Alla fine, l&#39;addome è chiusa e gli animali sono autorizzati a recuperare. Nel protocollo legatura, i ratti sono sottoposti a doppia legatura del dotto biliare comune con o senza dissezione del dotto biliare tra le legature 9. Questo modello sperimentale è ben accettata e utilizzata in tutto il mondo in centinaia di laboratori per indurre colestasi epatica e fibrosi. Induce intraepatica biliare proliferazione delle cellule epiteliali, differentiatio miofibroblasticon di fibroblasti portale attorno proliferanti cellule epiteliali biliari, con conseguente altamente riproducibile, espressione massiccia e deposizione di ECM 10,11. Pertanto, l&#39;applicazione di questo modello in ratti e topi è essere popolare tra gli scienziati che mirano a comprendere la patogenesi dell&#39;infiammazione epatica e fibrosi. Nel nostro laboratorio, abbiamo ampiamente utilizzato questo protocollo in passato nei ratti in diversi studi sperimentali volti ad indagare gli aspetti particolari molecolari e cellulari della fibrogenesi epatica e per testare nuovi concetti antifibrotici e farmaci 12-15. Recentemente, abbiamo adattato questa metodologia al sistema murino e ha scoperto che la chirurgia legatura del dotto biliare è anche un mezzo interessante per stabilire la fibrosi dipendenti dal tempo con una bassa variazione e mortalità nei topi 16-18. A causa delle dimensioni più piccole degli animali, tuttavia, alcune importanti modifiche per quanto riguarda l&#39;anestesia, interv chirurgicaenzione e di osservazione post-trattamento sono necessari per ottenere risultati affidabili e riproducibili in questo modello. L&#39;adattamento completo è riassunto nella seguente protocollo e nella documentazione video allegato.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>Forene Abbott</td><td>B 506</td><td></td></tr><tr><td>Rasoio Favorita II</td><td>Aeskulap</td><td>GT104</td><td></td></tr><tr><td>Testa di taglio</td><td>Aeskulap</td><td>GT730</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen unguento per occhi e naso</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante e controller</td><td>Labotect</td><td>HP 062</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di anestesia</td> <td>FluovacHarvard Apparatus</td><td>34-1030</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizzatore ISOFLO (Isoflurane Vapor)</td><td>Eickemeyer</td><td>4802885</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Tape</td><td>disponibile</td><td></td><td></td>in commercio</tr><tr><td>Carta velina</td><td>disponibile</td><td></td><td></td>in commercio</tr><tr><td>Nastro di seta Durapore</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi di garza di cotone</td><td>Fuhrmann GmbH</td><td>32014</td><td></td></tr><tr><td>Poli-alcol Haut&hellip; farblos Antiseptticum</td><td>Antisepttica GmbH</td><td>72PAH200</td><td></td></tr><tr><td>Raucodrape O teli adesivi</td><td>Lohmann & Rauscher GmbH</td><td>33013</td><td></td></tr><tr><td>Forbice</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14074-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Graefe dritta</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Sutura Mersilk</td><td>Ethicon</td><td>K889H</td><td>Seta, non assorbibile/Chiusura addominale</td></tr><tr><td>Porta aghi Mathieu</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Divaricatore Colibrì</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi di cotone</td><td>Noba Verbandmittel</td><td>974202</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi di cotone</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1032238</td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere da 25 ml</td><td>Schott Duran</td><td>50-1150</td><td></td></tr><tr><td>Isotonico (0,9%) Soluzione di NaCl</td><td>DeltaSelect GmbH</td><td>PZN 00765145</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per micro-dentellature Moria MC31</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11370-31</td><td>Separazione del dotto biliare</td></tr><tr><td>5-0 Sutura Mersilene</td><td>Ethicon</td><td>EH6731H</td><td>Poliestere, non assorbibile/Legatura del dotto biliare</td></tr><tr><td>Siringa da 5 ml</td><td>BD Discardit II</td><td>300296</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Ago Sterican 26 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Essex Pharma</td><td>997.00.00</td><td>Analgetico, 0,1 mg/kg</td></tr><tr><td>Lampada a infrarossi</td><td>Petra Electric</td><td>IR 11</td><td></td></tr></tbody></table>

bile duct ligation in topi: induzione infiammatoria epatica lesioni e fibrosi da colestasi ostruttiva

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Nella maggior parte dei vertebrati, il fegato produce bile che è necessario per emulsionare i grassi assorbiti e consentire la digestione dei lipidi nell&#39;intestino tenue e di espellere bilirubina e altri prodotti metabolici. Nel fegato, l&#39;ostruzione sperimentale del sistema biliare extraepatica innesca una complessa cascata di eventi patologici che porta a colestasi e infiammazione conseguente forte reazione fibrotica proveniente dai campi periportali. Pertanto, legatura chirurgica del dotto biliare comune è diventato il modello più comunemente usato per indurre lesioni colestatica ostruttiva nei roditori e di studiare gli eventi molecolari e cellulari che sono alla base di questi meccanismi fisiopatologici indotti da inadeguato flusso biliare. Negli ultimi anni, sono state descritte diverse tecniche chirurgiche che o permettono riconnessione o reanastomosis dopo legatura del dotto biliare (BDL), ad esempio, parziali BDL, o altri metodi di microchirurgia per domande di ricerca specifiche. Tuttavia, il modello utilizzato più frequentemente è la completa ostruzione del dotto biliare comune che induce una forte risposta fibrotica dopo 21 a 28 giorni. Il tasso di mortalità può essere elevato a causa di complicanze infettive o imprecisioni tecniche. Qui forniamo una procedura chirurgica dettagliato per il modello BDL nei topi che inducono una risposta fibrotica altamente riproducibile in base alla regola 3R per il benessere degli animali postulata da Russel e Burch nel 1959.

In una sperimentazione tipica BDL è stata eseguita in 40 maschi C57BL / 6 topi wild-type pesando circa 18-20 grammi. Questo esperimento è stato fatto per indagare fibrogenesi epatica nella fase di apertura (3 e 7 giorni), durante la progressione (10, 14, e 20 giorni), e durante lungo termine (30 e 60 giorni) 16. In questo modello, la fibrosi persinusoidal ha già sviluppato il giorno 10 dopo l&#39;intervento chirurgico, mentre fibrosi periportale che l&#39;aumento permanente fino alla fine dell&#39;esperimento era pienamente sviluppata dopo 20 giorni. Nell&#39;esperimento menzionato, tutti gli animali che hanno ricevuto una semplice farsa-operazione sono sopravvissuti, e solo due dei 40 topi (5%) che hanno ricevuto BDL sviluppato scadenti condizioni generali e sono stati quindi prematuramente sacrificati prima del punto finale programmata dell&#39;esperimento. L&#39;attività di animali sham era senza eccezioni già normale un giorno dopo laparotomia, mentre la maggior parte degli animali sottoposti a BDL hanno mostrato una ridotta attività durante i primi tre giorni. Jpelle aundiced era già evidente in tutti gli animali BDL uno o due giorni dopo l&#39;impostazione del BDL 16. I valori di entrambi alanina aminotransferasi (ALT) e di aspartato transaminasi (AST) che rappresentano markers sierici consolidate di danno epatico aumentano rapidamente e ha raggiunto il picco durante il giorno 7 e il giorno 20 dopo BDL (Tabella 1). Successivamente, ALT e AST sono costantemente diminuiti fino al giorno 30 e sono rimasti stabili fino a 60 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. In linea con l&#39;infortunio colestatica, le concentrazioni sieriche di bilirubina totale sono stati costantemente elevato e ha raggiunto un plateau dopo 7 giorni 16. Decorso simile di attività di ALT e AST sierici sono stati anche segnalati per i ratti sottoposti BDL. In un recente studio è stato dimostrare che AST e ALT livelli aumentati fino a 5 o 10 volte di normale nella prima settimana dopo l&#39;intervento chirurgico BDL e diminuito dopo due settimane 19. In genere, i fegati di animali sham sembrano ancora smooth alla fine dell&#39;esperimento, mentre i fegati di animali che hanno ricevuto BDL mostrano alterazioni architettoniche caratterizzate principalmente dalla formazione di edema e fibrotiche noduli sulla superficie corrispondente fegato e idrope della cistifellea che viene riempito con grandi quantità di bile (Figura 7). Le caratteristiche alterazioni morfologiche del fegato che sono indotte dalla chirurgia BDL sono dimostrabili nella norma analisi istologica (figura 8). Nella stessa serie di esperimenti, lo sviluppo di fibrosi epatica era semi-quantitativamente valutati sulla base istologia epatica valutati da un patologo cieco utilizzando un sistema di punteggio in cui fibrosi periportale stato organizzato 0-4 e fibrosi perisinusoidale 0-2, con un massimo valore che era equivalente a cirrosi di 6. Come previsto, il punteggio di fibrosi media nel gruppo di animali sham era 0.00 ± 0.00. Al contrario, nel gruppo di animali tcappello ricevuto BDL, il punteggio è aumentato costantemente fino al giorno 60 per un valore di 4,83 ± 0,17. È stato raggiunto il massimo di 3 fibrosi periportale al giorno 20. In tutti gli animali analizzati, fibrosi perisinusoidale era assente durante i primi 10 giorni dell&#39;esperimento ed era evidente in primo luogo dopo due settimane. Successivamente, è aumentato costantemente fino alla fine dell&#39;esperimento a valori di 1,8 ± 0,17 (Tabella 1). Anche in diversi altri esperimenti su animali indipendenti che sono state eseguite, si è osservato che la formazione di fibrosi era altamente riproducibile aumento dipendente dal tempo proiezione di espressione collagene intraepatica e la deposizione in conseguenza di fibrogenesi in corso (Figura 9). Analogamente, il processo di fibrogenesi in corso è evidente in elevata espressione di α-actina del muscolo liscio (α-SMA) che rappresenta un marcatore di cellule fibroblastiche, cioè attivato epatica cellule stellate e miofibroblasti portali,e idrossiprolina epatica, un aminoacido abbondantemente trovato in collagene matrici 18 (Figura 9). Inoltre, l&#39;espressione di vimentina che indica quantità crescenti di miofibroblasti o fibroblasti aumenta dopo l&#39;impostazione della chirurgia BDL 20. La concomitanza di infiammazione in fegati feriti sono ulteriormente riflessa da una maggiore espressione di lipocalina 2 (Lipocalina-2), che è fortemente indotta durante lesioni epatiche acute e croniche e si evolve effetti epato-protettiva durante lesioni epatiche acute 21,22. Cellule infiammatorie che infiltrano i fegati di animali che hanno ricevuto BDL possono essere rilevati mediante colorazione con un anticorpo specifico che è specifico per CD45 (Figura 10). Questo marcatore superficie cellulare che è anche conosciuto come PTPRC (proteina tirosina fosfatasi, tipo recettore) è specificamente espresso in tutte le cellule ematopoietiche differenziate tranne eritrociti e plasmacellule. <table fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot; border = &quot;0&quot; cellpadding = cellspacing &quot;0&quot; = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> Tempo dopo legatura del dotto biliare (giorni) </td><td> Bilirubina totale </td><td rowspan="2"> AST (U / L) </td><td rowspan="2"> ALT (U / L) </td><td rowspan="2"> Fibrosi portale </td><td rowspan="2"> Fibrosi perisinusoidale </td><td rowspan="2"> Punteggio totale </td></tr><tr><td> (Mg / dL) </td></tr><tr><td> 0 (n = 3) </td><td> 0.17 ± 0.06 </td><td> 192,67 ± 30,50 </td><td> 50.33 ± 6.03 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td></tr><tr><td> 3 (n = 5) </td><td> 6.85 ± 2.21 </td><td> 1159,25 ± 319,27 </td><td> 566,50 ± 335,25 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td></tr><tr><td> 7 (n = 5) </td> &lt;td&gt; 14.38 ± 2.14 ± </td><td> 976,60 ± 477,16 </td><td> 448,20 ± 259,47 </td><td> 0.60 ± 0.25 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0.60 ± 0.25 </td></tr><tr><td> 10 (n = 5) </td><td> 15.92 ± 2.60 </td><td> 1916,60 ± 868,25 </td><td> 560,40 ± 80.88 </td><td> 1.40 ± 0.25 </td><td> 0.25 ± 0.25 </td><td> 1.67 ± 0.25 </td></tr><tr><td> 14 (n = 5) </td><td> 17.90 ± 3.84 </td><td> 1088,60 ± 276,32 </td><td> 505,00 ± 96.15 ± </td><td> 2.4 ± 0.25 </td><td> 1.0 ± 0.0 </td><td> 3.40 ± 0.24 </td></tr><tr><td> 20 (n = 4) </td><td> 18.00 ± 2.12 </td><td> 1072,67 ± 364,27 </td><td> 404,00 ± 195,48 </td><td> 3.0 ± 0.0 </td><td> 1.0 ± 0.0 </td><td> 4.0 ± 0.0 </td></tr><tr><td> 30 (n = 5) </td><td> 16.04 ± 4.79 </td><td> 446,40 ± 169,75 </td><td> 260,20 ± 126,97 </td><td> 2.8 ±; 0.2 </td><td> 1.4 ± 0.25 </td><td> 4.20 ± 0.20 </td></tr><tr><td> 60 (n = 6) </td><td> 16.02 ± 1.19 </td><td> 484,67 ± 117,79 </td><td> 257,17 ± 50.97 </td><td> 3.0 ± 0.0 </td><td> 1.8 ± 0.17 </td><td> 4.83 ± 0.17 </td></tr></tbody></table> Abbreviazioni utilizzate sono: ALT, alanina aminotransferasi; AST, aspartato aminotransferasi. Tabella 1: Fibrosi aver realizzato in un esperimento rappresentativo I dati di questa tabella è stata riprodotta da uno studio in cui la fibrosi epatica è stata indotta dal condotto biliare legatura in topi C57BL / 6 16.. In questo studio, il tasso di mortalità dopo l&#39;intervento chirurgico BDL era del 5% (2 su 40 animali sono stati prematuramente sacrificati perché alle norme di polizia cattive sviluppati). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig1highres.jpg" /> Figura 1: installazione sperimentale per l&#39;esecuzione di una bilecondotto di legatura. L&#39;animale è mantenuto su una piastra di riscaldamento alla temperatura di 37 ° C e la zona operativa è coperta complessiva con, tende autoadesive impermeabile al fluido. Durante l&#39;intervento completo, l&#39;animale è permanentemente collegata ad un sistema di anestesia. Tutte le strumentazioni e soluzioni (analgesici, anestetici, soluzione antisettica, 0,9% NaCl) sono disposti in modo chiaro. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Preparazione dell&#39;area chirurgia apertura Prima della cavità peritoneale, la cute addominale deve essere rasato con un rasoio elettrico pelliccia e disinfettato con un tampone di garza antisettica. L&#39;area di intervento viene poi ricoperto con, tende autoadesive impermeabile al fluido. L&#39;addome è aperto con una laparotomia mediana (~ 2 cm di lunghezza). La cavità è allargata inserendo una sutura tenendo in sterno e l&#39;area funzionamento diffusa dal&#39;inserimento di un divaricatore Colibri permette la sperimentazione senza ostacoli durante l&#39;intervento chirurgico. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig3highres.jpg" /> Figura 3: Esposizione del dotto biliare. (A) Per condurre la legatura del dotto biliare, la parte ventrale del fegato viene sollevato in modo che possa aderire alla membrana e l&#39;ilo epatica diventa chiaramente visibile. (B) Per esporre meglio il dotto biliare, l&#39;intestino viene mosso con caudalmente un batuffolo di cotone inumidito. Il dotto biliare è contrassegnato da una freccia. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig4highres.jpg" /> Figura 4: legatura del dotto biliare. (A) In una prima fase, il dotto biliare è separato accuratamente dal fiancheggiamento vena porta e l&#39;arteria epatica usando un micro-dentatura pinze. (B) Successivamente, una sutura è disposto intornodotto biliare e fissata con un nodo chirurgico. (C) Successivamente, una seconda sutura è posizionata in prossimità della prima sutura e annodato intorno al dotto biliare. (D) La sutura viene accorciato, la cavità risciacquati con 0,9% di soluzione di NaCl , e tutti gli organi sostituiti alla loro posizione fisiologica. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig5highres.jpg" /> Figura 5:.. Rappresentazione precisa di annodatura Per documentare la collocazione delle suture e l&#39;impostazione dei due nodi che impediscono il flusso biliare, la stessa procedura descritta in figura 4 è stata documentata sotto binoculare (A) confinamento del dotto biliare con il (C) confinamento del dotto biliare con la seconda sutura prima sutura. (B) annodamento del primo suture.. (D) Knotting della seconda sutura. (E) a doppia legatura bile dUCT dopo accorciamento delle suture in eccesso. (E &#39;) Questo pannello raffigura uno schizzo di (E). Le posizioni della destra (rl), a sinistra (ll) e mediana (ml) lobi del fegato e del dotto biliare, stomaco e del duodeno sono da lettere. Nello schizzo del dotto biliare è doppia legatura da due punti di sutura. <img alt="Figura 6" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig6highres.jpg" width="400" /> Figura 6:. Anatomia del dotto biliare, vena e arteria epatica nei topi Per una migliore localizzazione anatomica del dotto biliare comune, vena porta e l&#39;arteria epatica sono raffigurati come schema. Contrassegnati sono anche le posizioni di destra (rl), a sinistra (ll) mediana (ml) e le caudato (cl) lobi del fegato. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig7highres.jpg" /> Figura 7: appeara Rappresentantence di fegatini di due settimane dopo l&#39;operazione sham e BDL. C57BL / 6 topi sono stati sottoposti a sham operazione o intervento chirurgico BDL. Dopo due settimane cavità viscerale è stato aperto. Mentre i fegati di animali sham hanno mostrato alcun segno di fibrosi, fegato di animali che ricevono legatura del dotto biliare avevano una struttura superficiale irregolare con formazione di edema e noduli fibrotici sulla superficie di fegati corrispondenti. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig8highres.jpg" /> Figura 8:. Ematossilina eosina macchia sezioni di fegato sono stati preparati da C57BL / 6 di tipo animali selvatici che erano sham-operated (A) o ricevuti BDL per tre settimane (B). Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina seguenti procedure standard. Si prega di notare le alterazioni tipiche nel fegato BDL che includono segni di infiammazione (infiltranti celle), parenchimale (epatocyte) necrosi, e la proliferazione dei dotti biliari. La barra di scala in ogni pannello figura rappresenta 50 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52438/52438fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig9highres.jpg" /> Figura 9: letture istologici e biochimici per fibrogenesi epatica. (A) sezioni di fegato sono stati preparati da animali che hanno ricevuto operazione sham o BDL per 2 settimane e colorate con Sirius Red (pannello superiore, le fibre di collagene in rosso) o analizzati per l&#39;espressione di α-actina del muscolo liscio (α-SMA) (pannello inferiore , α-SMA cellule positive in marrone) di immunoistochimica. La barra di scala in ogni pannello cifra rappresenta 100 micron. (B) Gli estratti proteici da fegati sono stati sottoposti a Western Blot e analizzato per espresfissione di collagene di tipo I, α-SMA, e Vimentin che sono ben marcatori di fibrogenesi epatica stabilito. L&#39;espressione di lipocalin-2 (Lipocalina-2) indica la risposta infiammatoria associata con fibrogenesi in corso. In questa analisi, la parità di proteine ​​di carico è stata dimostrata sondando le macchie con un anticorpo specifico per β-actina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52438/52438fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig10highres.jpg" /> Figura 10:. Colorazione immunologica di infiltrarsi cellule infiammatorie sezioni di fegato seriali sono state preparate da un fegato di un animale che ha ricevuto condotto biliare legatura per 3 settimane. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina (A) o con un anticorpo che è specifico per CD45 (B). Notare che,l&#39;elevato numero di cellule positive CD45 circondano i dotti biliari. Questi infiltrati massicce che indicano l&#39;infiammazione non sono visibili in sezioni di fegato derivati ​​da animali sham (non mostrato). La barra di scala in ogni pannello cifra rappresenta 500 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52438/52438fig10large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

L'interruzione del flusso biliare provoca un grave danno epatico colestatico infiammatorio con una caratteristica sequenza di alterazioni morfologiche tempo-dipendenti. Qui presentiamo un protocollo per la legatura chirurgica del dotto biliare comune nei topi che permette di indurre una forte risposta fibrotica dopo 21-28 giorni.

Bile Duct Ligation in topi: Induzione infiammatoria epatica Lesioni e fibrosi da colestasi ostruttiva

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre la fibrosi epatica sperimentale nei topi. Ciò si ottiene eseguendo prima una laparotomia della linea mediana per aprire l'addome dell'animale. Successivamente, il fegato viene sollevato per esporre il dotto biliare.Quindi il dotto biliare viene ostruito con due nodi chirurgici. In definitiva, il danno epatico, la fibrosi epatica e la cirrosi vengono misurati monitorando la deposizione di collagene attraverso l'analisi istologica. Il vantaggio principale di questo modello sperimentale rispetto ad altri modelli, come l'applicazione cronica di tetracloruro di carbonio, è che questo modello è altamente riproducibile e ha un basso tasso di mortalità complessivo.Questo metodo aiuta a rispondere a domande chiave nel campo della progressione della fibrosi epatica. Ad esempio, il contributo di diverse infiltrazioni di cellule immunitarie o la regolazione delle vie di segnalazione nel fegato. Il modello di legatura del dotto biliare condivide molte caratteristiche con la patogenesi umana.Quindi crediamo che questo modello sia molto prezioso per tradurre la conoscenza dal topo alla malattia umana. Sebbene questo metodo fornisca una visione dell'aspetto generale della fibrogenesi epatica, può essere applicato anche ad altri modelli animali come criceti o ratti. La parte critica della procedura chirurgica per il principiante è separare il dotto B dalla porta di affrancatura. Vento.La dimostrazione di questi missili sarà fatta da K e civili, i nostri due tecnici di linea dei nostri corpi di laboratorio. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal comitato statale ufficiale per la cura e l'uso degli animali. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la legge federale tedesca sulla protezione degli animali e guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio per la preparazione all'intervento chirurgico.Assemblare i seguenti strumenti e soluzioni sterili come indicato nell'elenco dei materiali e delle attrezzature specifiche nel protocollo di testo. Dopo aver anestetizzato un topo, secondo il protocollo di testo, assicurarsi che l'animale non mostri alcuna risposta al dolore Con un rasoio elettrico, radere il pelo addominale e applicare un unguento per occhi e naso per proteggere gli occhi dalla disidratazione. Posiziona il mouse su una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius.Inserire il muso del topo nella maschera fluvac di un sistema di anestesia fluvac e utilizzare un nastro di seta per fissare le zampe dell'animale. Mantenere l'anestesia mediante inalazione di fluoro ISO dall'1,5 al 3% in ossigeno al 100% a una velocità di flusso di un litro al minuto. Infine, disinfettare l'area chirurgica.Coprire l'intera area operativa con teli autoadesivi impermeabili ai fluidi. Per iniziare l'intervento chirurgico, utilizzare le forbici chirurgiche per eseguire una laparotomia della linea mediana di circa due centimetri di lunghezza tagliando contemporaneamente i tagli più la fascia. Usa le forbici come divaricatore per sezionare il tessuto connettivo sopra il peritoneo.Tagliare il peritoneo lungo l'alba lineare per aprire la cavità peritoneale. Quindi allargare la cavità inserendo una sutura di tenuta nello sterno, sollevando il filamento della sutura e fissandolo sopra la maschera fluvac. Aggiungere l'analgesia perioperatoria contenente 0,1 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina nella cavità peritoneale.Quindi, inserire un divaricatore Cree nella cavità peritoneale per allargare l'area operativa. Quindi utilizzare un batuffolo di cotone con umidità salina per sollevare il fegato in modo che il lato ventrale aderisca al diaframma e l'ilo sia chiaramente visibile. Ora per esporre il dotto biliare, muovi l'intestino nella direzione della coccola, quindi usa una pinza a micro dentazione per separare accuratamente il dotto biliare dalla vena porta laterale e dall'arteria epatica.Posizionare una sutura da cinque a zero attorno al dotto biliare e fissarla con due nodi chirurgici. Aumento continuo della forza attrattiva per garantire un'ostruzione efficace senza recidere il dotto biliare. Per evitare che il nodo possa fuoriuscire e che l'animale sviluppi una grave peritonite, aggiungere un secondo legamento cranico allo stesso modo senza sezionare il dotto biliare in mezzo, tagliare le estremità delle suture, abbassare lo sterno e rimuovere il divaricatore.Utilizzare soluzione fisiologica allo 0,9% per risciacquare la cavità peritoneale e riportare gli organi addominali nelle loro posizioni fisiologiche. Usa sei suture da corsa in seta merc zero per chiudere sia il peritoneo che la fascia più carina. Utilizzare una soluzione antisettica per disinfettare l'area operativa.Dopo l'intervento chirurgico, lasciare che il topo si riprenda in una gabbia riscaldata da una lampada a infrarossi. Quando il topo è completamente sveglio e attivo, spostarlo in una gabbia normale e fornire l'accesso ad liptum al cibo e all'acqua. La legatura del dotto biliare è stata effettuata per studiare la fibrogenesi epatica nella fase iniziale durante la progressione e a lungo termine. Come dimostrato in questa tabella, la fibrosi sinusoidale pers, si è già sviluppata il giorno 10 dopo l'intervento, mentre la fibrosi periportale che è aumentata in modo permanente fino alla fine dell'esperimento è stata completamente sviluppata dopo 20 giorni, sia un marcatore sierico LT che uno ST per danno epatico sono aumentati rapidamente e hanno raggiunto il picco durante il settimo giorno e il giorno 20.Dopo la BDL successiva, un LT e un ST sono diminuiti costantemente fino al giorno 30 e sono rimasti stabili fino a 60 giorni dopo l'intervento. In linea con il danno scolastico, le concentrazioni sieriche di bilirubina totale erano costantemente elevate e raggiungevano un plateau dopo sette giorni. Tipicamente, i fegati degli animali operati con finzione appaiono ancora lisci alla fine dell'esperimento, mentre gli animali che hanno ricevuto BDL sviluppano edema e noduli fibrotici sulla superficie dei fegati e idrope della cistifellea piena di bile.I cambiamenti morfologici sono visibili anche attraverso l'analisi istologica. Lo sviluppo della fibrosi è altamente riproducibile e dimostra un aumento dipendente dal tempo dell'espressione e della deposizione intraepatica del collagene come conseguenza della fibrogenesi in corso, ulteriori indicatori di fibrogenesi sono l'aumento dell'espressione dell'alfa actina della muscolatura liscia vimentina e il marcatore associato all'infiammazione lipina due. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in 10-50 minuti se eseguita correttamente durante il tentativo della procedura.È importante ricordare di eseguire le procedure dell'olio in condizioni pulite, ma non sterili Dopo questa procedura. Altri metodi, come la somministrazione di tetracloruro di carbonio, possono essere eseguiti per identificare se i meccanismi sono specifici per il modello di legatura del dotto biliare o generalmente rilevanti per la fibrogenesi epatica dopo il suo sviluppo. Questa metodologia ha aperto la strada a molti ricercatori che lavorano nel campo dell'epatologia per analizzare ed esplorare le diverse vie di segnalazione evolute nella fibrogenesi epatica.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la legatura del prodotto nei topi con un'elevata riproducibilità. Non dimenticare che lavorare con gli animali richiede una gestione responsabile e che il VA dei narcotici per inalazione può essere estremamente pericoloso durante l'esecuzione della procedura.

bile-duct-ligation-mice-induction-inflammatory-liver-injury-fibrosis

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Colestasi è una condizione clinica comunemente incontrate dai chirurghi e gastroenterologi. Creazione di un modello reversibile ratto colestatico può essere difficile in vista della taglia più piccola e unica anatomia hepatopancreatobiliary nei ratti. In questo articolo il video dimostra la creazione di un modello colestatico reversibile.

Creazione del Modello reversibile Rat colestatico

Un'alta incidenza di recidiva tumorale dopo la resezione delle metastasi epatiche rimane un problema irrisolto. Il modello murino illustrato può essere utile per indagare le ragioni di tali recidive. Combina per la prima volta un modello di resezione epatica con l'iniezione intraepatica di cellule tumorali.

L&#39;influenza della resezione epatica sulla intraepatica crescita tumorale

Riassorbimento degli acidi biliari nell'intestino tenue-dipendente e feedback inibizione della sintesi dell'acido di bile epatica è importante per la salute e l'omeostasi sistemica. In questo studio, descriviamo un modello murino per resezione ileale valutare il malassorbimento indotta da ileectomy bile, overaccumulation e tossicità nell'intestino del mouse.

Overaccumulation ileectomy-indotta della Bile nell'intestino del Mouse

Qui descriviamo un metodo comune per indurre la lesione cronica del fegato nei topi di alimentazione di una dieta di colina-carenti ed etionina-completati (CDE). Dimostriamo che la sorveglianza sanitaria, aspersione epatica, isolamento e conservazione. Un corso di sei settimane di tempo può informare circa il disturbo al fegato, pathohistology, fibrosi, infiammatoria e risposte delle cellule progenitrici del fegato.

La murino colina-carenti, etionina-completati (CDE) dieta modello della lesione epatica cronica

Qui, presentiamo la legatura dei dotti biliari parziale come un modello chirurgico della lesione del fegato e la rigenerazione in roditori.

Legatura del dotto biliare parziale nel topo: un modello radiocomandato di colestasi ostruttiva localizzata

Vi presentiamo un metodo piuttosto semplice e sensibile per la quantificazione accurata della densità del condotto biliare nel fegato del topo. Questo metodo può aiutare a determinare gli effetti dei modificatori genetici e ambientali e l'efficacia delle potenziali terapie nei modelli murini delle malattie biliari.

Determinazione della densità del dotto biliare nel fegato del topo

Presentato qui è un protocollo per l'isolamento degli epatociti del topo dai fegati di topo adulti utilizzando una tecnica di perfusione di collagenasi modificata. È stata inoltre descritta la cultura a lungo termine degli epatociti in un sandwich di collagene 3D, nonché l'immunolabeling dei componenti citoscheletrici per studiare la formazione biliare e la sua risposta al trattamento.

Isolamento e 3D Collagen Sandwich Cultura del topo primario Epatociti per studiare il ruolo del citoscheletro nella formazione canalicolare bile in vitro

Questo protocollo fornisce un metodo semplice e affidabile per la produzione di fette di fegato tagliate di precisione dai topi. I campioni di tessuto ex vivo possono essere mantenuti in condizioni di coltura dei tessuti di laboratorio per più giorni, fornendo un modello flessibile per esaminare la patobiologia epatica.

Murine Precision-Cut Liver Slices come un modello Ex Vivo di biologia del fegato

La pancreatite cronica (CP) è una malattia caratterizzata da infiammazione e fibrosi del pancreas, spesso associata a dolori addominali intrattabili. Questo articolo si concentra sul perfezionamento della tecnica per generare un modello murino di CP tramite infusione del dotto biliare con acido 2,4,6 -trinitrobenzene solfonico (TNBS).

Un modello murino per la pancreatite cronica tramite infusione di TNBS del dotto biliare

Abbiamo stabilito un modello murino di fibrosi epatica cronica, che fornisce un modello animale adatto per lo studio meccanicistico della fibrosi epatica indotta da virus dell'atresia biliare (BA) e una piattaforma per futuri trattamenti BA.

Un modello murino di fibrosi epatica cronica per lo studio dell'atresia biliare

È stato dimostrato che l'associazione della partizione epatica e della legatura della vena porta per l'epatectomia a stadi (ALPPS) determina una notevole rigenerazione del fegato dopo diverse settimane dall'intervento chirurgico di primo stadio. Sono stati sviluppati modelli animali sottoposti ad ALPPS per esplorare la potenziale capacità di rigenerazione del fegato e ottenere risultati clinici favorevoli.

Un modello murino dell'associazione della partizione epatica e della legatura della vena porta per la procedura di epatectomia in stadi con l'ausilio della microscopia

Impara la legatura del dotto biliare nei topi per indurre fibrosi epatica sperimentale. Questo metodo riproducibile consente di studiare la progressione della fibrogenesi epatica attraverso l'analisi istologica del collagene.

Bile Duct Ligation in topi: Induzione infiammatoria epatica Lesioni e fibrosi da colestasi ostruttiva

Esplora altri video