Targeted DNA metilazione Analisi per sequenziamento di prossima generazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la metilazione di CPG in regioni mirate di interesse a partire da DNA genomico isolato da tessuti o cellule di interesse. Questo viene ottenuto innanzitutto progettando primer specifici per PCR a solfito per amplificare le regioni di interesse da DNA genomico convertito con bisolfito. Nel secondo passaggio, la regione di interesse convertita con bisolfito viene amplificata e vengono generate librerie di sequenziamento di nuova generazione o NGS a partire dai prodotti di amplificazione.

Successivamente, le librerie vengono sottoposte a sequenziamento e vengono generati file FASTQ per l'analisi. Nell'ultimo passaggio, le letture di sequenziamento vengono allineate alla sequenza bersaglio di riferimento convertita con bisolfito e la percentuale di 5mC viene calcolata definitivamente mediante sequenziamento di ampliconi con bisolfito o BS A S, che può essere eseguito per quantificare in modo preciso e accurato la metilazione del CPG in qualsiasi regione di interesse proveniente da qualsiasi organismo modello. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il sequenziamento di Sanger è che il BS A S fornisce una quantificazione accurata e precisa della metilazione del CPG in modo rapido e ad alto rendimento, offrendo la possibilità di analizzare molteplici regioni in un elevato numero di campioni.

Dopo aver identificato la sequenza bersaglio e progettato il primer, assemblare la reazione per l'ottimizzazione dell'amplificazione del bersaglio di un singolo amplicone, quindi sigillare una piastra PCR con un film sigillato a caldo per visualizzare gli ampliconi mediante elettroforesi su gel. Successivamente, caricare i pozzetti appropriati con 30 microlitri di reazioni PCR o di ladder, quindi far correre il gel a 200 volt per circa 45 minuti. Quando il primo colorante raggiunge l'estremità del gel, arrestare la corsa elettrica e quindi ricoprire l'intero gel con cinque microgrammi per millilitro di bromuro di AUM appena preparato.

Dopo cinque minuti, acquisire l'immagine del gel mediante un transilluminatore UV a una lunghezza d'onda di eccitazione di 482 nanometri. Utilizzare il marker di peso molecolare per determinare le dimensioni degli AMPLICONI PCR e verificare la specificità della reazione. Cercare bande multiple diverse dalla dimensione dell'amplicone attesa per determinare la dimensione media dei picchi della libreria rilevati e una stima della molarità.

Successivamente, eseguire le librerie su un chip per elettroforesi capillare per la determinazione delle dimensioni del DNA utilizzando un saggio DNA ad alta sensibilità, seguendo le istruzioni del produttore. Per quantificare le librerie mediante QPCR, utilizzare primer progettati contro le sequenze degli adattatori presenti nelle librerie generate e standard con concentrazione nota su un apparato in tempo reale, impostando la quantificazione assoluta secondo le istruzioni del produttore.

Quindi utilizzare le dimensioni delle librerie e la quantificazione molare ottenuta dalla QPCR per calcolare le concentrazioni molari delle librerie. Dopo il sequenziamento, importare i file fastQ compressi nella pipeline di analisi del sequenziamento appropriata, selezionare l'importazione e quindi scegliere il metodo di sequenziamento utilizzato per generare le letture, in modo da mantenere i punteggi Q per le applicazioni di taglio delle letture. Importare i file di lettura fastQ compressi appropriati, quindi, nelle opzioni generali, deselezionare l'opzione di scarto dei punteggi di qualità.

Selezionare una posizione per le letture importate e fare clic su fine. Quindi, sotto gli strumenti principali di NGS, selezionare il taglio delle sequenze. Evidenziare le letture da tagliare, mantenendo solo quelle con punteggi maggiori o uguali a Q 30.

Quindi selezionare il taglio utilizzando i punteggi di qualità e impostare il limite a 0,001. Per selezionare ulteriormente solo le sequenze contenenti meno di un nucleotide ambiguo o esattamente uno, selezionare il taglio dei nucleotidi ambigui e impostare il numero massimo di ambiguità a uno.

Quindi selezionare una posizione in cui salvare le letture tagliate e fare clic su "fine" per mappare le letture tagliate sul riferimento genico convertito in silico dal solfito. Nelle strumenti principali NGS, selezionare "mappa letture". Come riferimento, selezionare le letture tagliate da mappare e fare clic su "avanti".

Quindi, sotto mascheramento del riferimento, selezionare la sequenza di riferimento convertita e scegliere nessun mascheramento. Fare clic su Avanti, quindi assegnare un punteggio di tre per le corrispondenze errate, inserzioni e delezioni. Assegnare un punteggio di uno per la frazione minima della lunghezza della lettura che si allinea al riferimento e assegnare un punteggio di 0,9 per la frazione minima di identità tra l'allineamento, la lettura e il riferimento; nella gestione delle corrispondenze non specifiche, selezionare Ignora e fare clic su Avanti nelle opzioni di output.

Successivamente, selezionare Crea mappature di letture autonome. Quindi, nella sezione gestione risultati, fare clic su salva. Selezionare una posizione in cui salvare la mappatura delle letture e fare clic su fine per eseguire la chiamata delle varianti sulle letture mappate.

Nell'analisi di re-sequenziamento, selezionare il rilevamento delle varianti a bassa frequenza e scegliere il mapping dei letture da analizzare. Fare clic su avanti, quindi nella sezione dei parametri per le varianti a bassa frequenza inserire 0,01% e fare clic su avanti. Nella sezione dei filtri generali, impostare la copertura minima a 1000 per assicurarsi che la sequenza abbia una profondità maggiore o uguale a 1000 x.

Infine, fare clic su Avanti, quindi nelle opzioni di output selezionare "Crea tabella annotata" e scegliere un percorso in cui salvare il file della tabella delle varianti, fare clic su Fine ed utilizzare le frequenze delle varianti nei siti CPG annotati nella regione di interesse provenienti dal file della tabella delle varianti per calcolare la frequenza della metilazione della citosina in una citosina di riferimento nel contesto CG. Le letture di sequenziamento da amplificone solfito correttamente allineate alla sequenza di riferimento convertita assomiglieranno a quelle illustrate nella figura. I dinucleotidi CPG possono essere chiaramente identificati e gli stati di metilazione possono essere stimati osservando le chiamate di base nei siti CPG. Nelle letture mappate, una metilazione dello 0% produrrà letture contenenti timina mappate ai siti CPG.

I controlli di metilazione al 100% produrranno letture mappate contenenti citosine mappate su siti CPG. In questo esperimento, RNA e DNA sono stati co-isolati da un topo, cervelletto e retina. L'espressione dell'opsina espressa selettivamente nel tessuto retinico è stata quindi misurata mediante QPCR, come previsto.

L'RNA dell'opsina è stato rilevato solo nella retina dopo la quantificazione dei livelli di metilazione CPG nella regione del promotore dell'Opsin mediante sequenziamento dopo amplificazione con bisolfito. Tuttavia, i livelli cumulativi di metilazione lungo la regione del promotore erano superiori all'80% nel cervelletto, rispetto a meno del 15% nella retina. La quantificazione della metilazione con B SAS trae vantaggio dalla quantificazione specifica per sito, consentendo il confronto dei livelli di metilazione su base CPG-specifica in qualsiasi regione genomica data.

In effetti, in questo esperimento, i livelli di metilazione CPG attraverso il promotore dell'opsina si sono rivelati significativamente più elevati nei campioni cerebellari rispetto ai campioni retinici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare la metilazione CPG in regioni bersaglio di interesse a partire da DNA genomico isolato da tessuti o cellule.