Targeted DNA metilazione Analisi per sequenziamento di prossima generazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la metilazione del CPG in regioni mirate di interesse a partire dal DNA genomico, isolate da tessuti o cellule di interesse. Ciò si ottiene progettando prima con primer PCR specifici per solfito per amplificare le regioni di interesse dal DNA genomico convertito con bi solfito. Nella seconda fase, la regione di interesse convertita in bisolfito viene amplificata e il sequenziamento di nuova generazione o le librerie NGS vengono generate dai coni degli ampliconi.

Successivamente, le librerie vengono sequenziate e i file FASTQ vengono generati per l'analisi. Nella fase finale, le letture di sequenziamento sono allineate alla sequenza target di riferimento convertita in bisolfito e il cinque mc percento viene calcolato in ultima analisi mediante sequenziamento dell'amplicone di solfito o BS a s può essere eseguito per quantificare in modo preciso e accurato la metilazione CPG in qualsiasi regione di interesse da qualsiasi organismo modello. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il sequenziamento Sanger, è che BS A S fornisce una quantificazione accurata e precisa della metilazione CPG in modo rapido e ad alto rendimento, offrendo l'opportunità di saggiare più regioni in un numero elevato di campioni.

Dopo aver identificato il bersaglio e progettato il primer, assemblare la reazione per l'ottimizzazione dell'amplificazione del bersaglio di un singolo amplicona, quindi sigillare una piastra PCR con pellicola termosaldata per visualizzare gli ampliconi mediante elettroforesi a pagina. Quindi, caricare i pozzetti appropriati con 30 microlitri di reazioni PCR o scala, quindi far scorrere il gel a 200 volt per circa 45 minuti. Quando il primo colorante raggiunge la fine del gel, interrompere la reazione e poi coprire l'intero gel con cinque microgrammi per millilitro di bromuro AUM appena preparato.

Dopo cinque minuti, acquisire un'immagine del gel tramite un transluminatore UV a una lunghezza d'onda di eccitazione di 482 nanometri. Utilizzare la scala per dimensionare gli AMPLICONI PCR per determinare la specificità della reazione. Cerca più bande diverse dalla dimensione prevista dell'amplicone per determinare la dimensione media dei picchi della libreria rilevati e una stima della molarità.

Successivamente, esegui le librerie su un chip di dimensionamento del DNA per elettroforesi capillare con un test del DNA ad alta sensibilità secondo le istruzioni del produttore. Quantificare le librerie mediante QPCR. Utilizzare primer progettati in base alle sequenze di adattatori nelle librerie e negli standard generati con una concentrazione nota su uno strumento in tempo reale, utilizzando le impostazioni di quantificazione assoluta secondo le istruzioni del produttore.

Quindi utilizzare la dimensione delle librerie e la quantificazione molare della QPCR per calcolare le concentrazioni molari delle librerie. Dopo il sequenziamento, importare i file Q veloci compressi nella pipeline di analisi del sequenziamento appropriata, selezionare Importa, quindi selezionare il metodo di sequenziamento utilizzato per generare le letture per mantenere i punteggi Q per le applicazioni di taglio delle letture. Importare i file di lettura Q veloci compressi appropriati, quindi in Opzioni generali, deselezionare Elimina punteggi di qualità.

Selezionare una posizione per le letture importate e fare clic su Fine. Quindi, in Strumenti di base NGS, selezionare le sequenze di taglio. Evidenzia le letture da tagliare, mantenendo solo le letture che contengono punteggi maggiori o uguali a Q 30.

Quindi seleziona il taglio utilizzando i punteggi di qualità e imposta il limite su 0,001. Per selezionare ulteriormente solo le canne contenenti meno o uguale a un nucleotide ambiguo. Seleziona trim nucleotidi ambigui e imposta il numero massimo di ambiguità su uno.

Quindi selezionare una posizione in cui salvare le letture tagliate e fare clic su Fine per mappare la res tagliata al riferimento del gene convertito in silico mediante solfito. In Strumenti di base NGS, seleziona Letture mappe. Per fare riferimento, selezionare le letture tagliate da mappare e fare clic su Avanti.

Quindi, in Mascheramento di riferimento, selezionare la sequenza di riferimento convertita e selezionare Nessuna maschera. Fare clic su Avanti, quindi assegnare un punteggio di tre per le mancate corrispondenze, gli inserimenti e le eliminazioni. Assegnare un punteggio di uno per la frazione minima della lunghezza di lettura della mappa al riferimento e assegnare un punteggio di 0,9 per la frazione minima di identità tra la mappa, la lettura e il riferimento in Gestione delle corrispondenze non specifica, selezionare, ignorare e fare clic su Avanti in Opzioni di output.

Selezionare quindi Crea mapping di lettura autonomi. Quindi, in Gestione risultati, fare clic su Salva. Selezionare una posizione in cui salvare la mappatura di lettura e fare clic su Fine per eseguire la chiamata della variante sulle letture mappate.

In Analisi di risequenziamento, selezionare il rilevamento della variante a bassa frequenza e scegliere la mappatura di lettura da analizzare. Fare clic su Avanti, quindi in Parametro variante a bassa frequenza, immettere 0,01% e fare clic su Avanti. In Filtri generali, impostare la copertura minima su 1000 per assicurarsi che la sequenza si trovi a una profondità maggiore o uguale a 1000 x.

Infine, fare clic su Avanti, quindi in opzioni di output selezionare Crea tabella annotata e selezionare una posizione in cui salvare il file della tabella delle varianti, fare clic su Fine e utilizzare le frequenze delle varianti nei siti CPG annotati nella regione di interesse dal file della tabella delle varianti per calcolare la frequenza della metilazione della citosina in un contesto CG di riferimento mediante il sequenziamento dell'amplicone di solfito le letture correttamente allineate alla sequenza di riferimento convertita saranno simili a quelle illustrate nella figura. I dinucleotidi CPG possono essere chiaramente identificati e gli stati di metilazione possono essere stimati osservando i richiami di base nei siti CPG. Nelle letture mappate, la metilazione dello 0% si tradurrà in letture mappate contenenti timina mappate nei siti CPG.

controlli di metilazione al 100% si tradurranno in letture mappate contenenti citosine mappate nei siti CPG. In questo esperimento, l'RNA e il DNA sono stati co-isolati da un topo, dal cervelletto e dalla retina. L'espressione dell'opsina espressa selettivamente nel tessuto retinico è stata quindi misurata utilizzando la QPCR come previsto.

L'RNA dell'opsina è stato rilevato solo nella retina dopo la quantificazione dei livelli di metilazione CPG nella regione del promotore dell'opsina mediante sequenziamento di amplificazione del bisolfito. Tuttavia, i livelli cumulativi di metilazione nella regione del promotore erano superiori all'80% nel cervelletto rispetto a meno del 15% nella retina. B La quantificazione di metilazione SAS beneficia della quantificazione di metilazione sito-specifica, consentendo il confronto dei livelli di metilazione su base specifica CPG in una data regione genomica.

Infatti, in questo esperimento, i livelli di metilazione CPG attraverso il promotore dell'opsina sono risultati significativamente più alti nei campioni cerebellari rispetto ai campioni di retina. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare la metilazione CPG in regioni mirate di interesse a partire dal DNA genomico, isolato da tessuti o cellule.