Name: Targeted DNA metilazione Analisi per sequenziamento di prossima generazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Impara a quantificare la metilazione del DNA in regioni genomiche specifiche mediante bisulfite amplicon sequencing. Questo metodo combina conversione con bisulfite, PCR e sequenziamento NGS per analisi epigenetiche precise.

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Gli autori ringraziano Colleen Van Kirk per i campioni di retina e cervelletto del topo e Peter Gregory per la generazione delle figure. Gli autori ringraziano anche la dottoressa Allison Gillaspy e il Laboratorio di Biologia Molecolare e il nucleo di ricerca sulla citometria per l'accesso al MiSeq. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH DA029405, EY021716 e AG026607 e dalla Donald W. Reynolds Foundation.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

BSAS consente concentrata, precisa quantificazione metilazione del DNA con elevate capacità di throughput sia il numero di campioni e il numero di obiettivi. Inoltre, questa generazione biblioteca utilizzando tagmentation transposome-mediata richiede meno DNA di ingresso, è più veloce e contiene meno passaggi rispetto tosatura tradizionale e successive tecniche adattatore legatura. Questi miglioramenti rispetto ai metodi attuali consentono precise a livello di base di analisi di metilazione del DNA di qualsiasi target di interesse. Inoltre, BSAS fornisce un nuovo metodo per la conferma delle regioni di interesse (regioni metilazione differenziale (tipo DMRS), isole CpG, regioni di regolamentazione) che sono stati identificati mediante intero genoma bisolfito 22 o catturare 23 approcci. Utilizzando approcci conferma ortogonali e più quantitativamente metodi precisi migliora il rigore analitico degli studi epigenomiche. La profondità elevata di lettura realizzato con BSAS consente per la quantificazione precisa in un intervallo di confidenza stretto, risultazione in quantificazione precisa 16. Inoltre, la possibilità di eseguire molti campioni in un singolo esperimento può aumentare la dimensione del campione per le conferme di metodi intero genoma, che consentirà di aumentare la potenza statistica; una debolezza di molti attuali studi epigenetici. È importante sottolineare che, BSAS fornisce un CpG metilazione quantificazione specifica-base, che consente la generazione di ipotesi verificabili per la ricerca epigenetica. Ipotesi come l&#39;aumento metilazione in un elemento di risposta specifica si tradurrà in una diminuzione legame di un fattore di trascrizione specifico. BSAS, combinati con dati di espressione di mRNA appaiati, fornisce un metodo per ottenere sia la regolazione epigenetica e l&#39;espressione di mRNA in un unico pezzo di tessuto o di una popolazione di cellule. Misure appaiati di regolamentazione e di espressione anche aumentare il rigore scientifico e l&#39;impatto dei risultati. Passaggi critici all&#39;interno del protocollo BSAS comprendono la progettazione di primer, ottimizzazione amplicon, e la generazione di biblioteca /QC. Polarizzazione PCR è introdotto se primer non sono progettati correttamente e amplificano a diverse efficienze 8. L&#39;utilizzo di standard di metilazione, come enzimaticamente generati 100% e 0% citosina standard metilati, può essere utilizzato per determinare il grado, se presente, di polarizzazione metilazione quantificazione, ed è un controllo metodologico appropriato quando quantificare metilazione 16. Allo stesso modo, si deve prestare attenzione quando si ottimizza reazioni PCR per la generazione di un singolo amplicone di alta qualità. Se non amplicone è presente con le linee guida suggerite descritti nel protocollo, passaggi di ottimizzazione includono un numero crescente di ciclo PCR o importo ingresso bsDNA. Se ci sono più prodotti PCR, compreso di primer-dimeri, passaggi di ottimizzazione includono diminuendo quantità di input bsDNA, diminuendo le concentrazioni di ingresso molari PCR Primer, aumento delle temperature di ricottura, o diminuendo il numero di ciclo PCR. Uno o una combinazione di questi procedimenti di ottimizzazione produce risultati sufficienti per generare una singola higamplicon h-qualità. In alternativa, ridisegnando primer è un buon approccio per i set di primer che non producono un singolo amplicone. Per le regioni in cui la riprogettazione non è adatto o possibile, degenerare set di primer, tra cui sia possibile lavorare di citosina e timina all&#39;indirizzo siti CpG in primer avanti e adenina e guanina di di in siti CpG in primer inverso. Tuttavia, questi set di primer devono ottimizzare ulteriormente per garantire l&#39;assenza di pregiudizi PCR è in corso, un processo al di fuori del campo di applicazione di questo protocollo. Librerie di qualità sono estremamente importanti per il successo. Garantire che le misure di controllo di qualità vengono effettuati per determinare le dimensioni, la qualità e la quantità delle librerie prima di sequenziamento. Le reazioni di sequenziamento sono inclini al fallimento con il contributo di librerie di bassa qualità. Bias in metilazione quantificazione può essere mitigato assicurando che le frequenze di metilazione sono presenti in entrambi avanti e retromarcia sequenziamento legge. Inoltre, i punteggi di qualità delle basi allineando a siti CpG dovrebbero essere ≥Q30 per alta confidence in quantificazione. Mentre altri hanno mostrato in precedenza poco o nessun pregiudizio in reazioni tagmentation di bisolfito DNA convertito 19, garantendo i parametri sopra descritti consente la conferma della bassa quantificazione pregiudizi metilazione. BSAS misura attualmente metilazione in siti CpG, però, le future espansioni di questo metodo consentirà misurazioni appaiate del CpG 5-HMC con l&#39;aggiunta di fasi sperimentali distinguendo tra 5-MC e 5-HMC quali l&#39;introduzione di perruthenate potassio prima della conversione bisolfito 24. Ciò aumenterà l&#39;impatto dell&#39;utilità BSAS consentendo metilazione associato, sia dati di espressione 5-mC e 5-HMC, e per determinare espressione genica ruoli normativi di metilazione del DNA. Preparazione biblioteca Transposome-mediata di ampliconi della PCR non comporta approfondito sequenziamento diminuito alle estremità delle regioni amplificate. Pertanto, le regioni di grande interesse dovrebbero essere progettati per risiedere nel mezzo di ampliconi. Comemai, perché BSAS genera sequenziamento leggere profondità di&gt; 1.000 X, la precisione quantitativa di 5-MC misurazioni vicino ai confini delle regioni amplificate rimane elevato.

E &#39;passato più di mezzo secolo da quando il primo rapporto di naturalmente modifiche del DNA in forma di citosina metilazione 1. Citosina metilazione è una base citosina nucleotide modificato in cui il 5 ° di carbonio sull&#39;anello di base ha un gruppo metilico (5-MC), più frequentemente si verificano nel dinucleotide CpG motivo nei genomi dei mammiferi. La presenza funzionale della 5-mC in promotori genici è generalmente associata con la repressione trascrizionale, mentre l&#39;assenza è associato con l&#39;attività trascrizionale 2. Enormi progressi sono stati fatti nella comprensione del ruolo della metilazione del DNA in fase di sviluppo 3, transgeneration propagazione di profili epigenetici 4, cancro patogenesi 5,6, e un certo numero di altri settori di ricerca. Molti di questi progressi sono venuti negli ultimi anni come nuove metodologie sono state sviluppate al profilo di metilazione del DNA 7. Con l&#39;avvento edivulgazione di tecniche di sequenziamento di prossima generazione (NGS) ora ci sono una serie di metodi per profilare la metilazione del DNA di un intero genoma o grandi regioni del genoma 8. Questi approcci aprono la possibilità di studi scoperta che quantificano metilazione del DNA e le differenze di metilazione del DNA. In aggiunta a questi approcci ipotesi che generano, vi è una forte necessità di target / Test di ipotesi DNA metodi metilazione di quantificazione. Pyrosequencing, metilazione specifico PCR, e Sanger sequenziamento diretto del DNA bisolfito convertito sono stati i metodi più utilizzati per l&#39;analisi delle regioni mirati (ad esempio, una regione del promotore di un singolo gene o un&#39;isola CpG) 9-12. Tutti questi metodi si basano sulla conversione bisolfito, una reazione chimica deaminazione dove citosina non metilate del sono convertiti in uracile di, mentre citosina metilati di 13,14 rimangono intatte. Amplificazione PCR di bisulfite-convertiti risultati del DNA in sostituzione di uracile di con timina 15 che consentono la metilazione differenziale leggere come una differenza di base. Mentre molto utile, le limitazioni a questi metodi includono bassa precisione quantitativa, lunghezza lettura breve, e la velocità bassa del campione. Per far fronte a queste limitazioni abbiamo sviluppato un metodo che abbiamo definito bisolfito Amplicon Sequencing (BSAS) 16. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di poter analizzare bersaglio regioni genomiche di interesse in un gran numero di campioni con elevata precisione quantitativa. BSAS utilizza elementi di metodi esistenti (conversione bisolfito e specifiche regione amplificazione PCR) e li combina con semplice costruzione di nuova generazione library (transposome-mediata) 17 e da banco NGS 18 (Figura 1). Questo approccio prevede un metodo di throughput più quantitativa e superiore per esaminare la metilazione citosina in qualsiasi regione di interesse. Ecco a voi laMetodo in dettaglio e descrivere approcci per la risoluzione dei problemi e la qualità controllo del processo BSAS.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanalizzatore</td><td>Agilent</td><td>G29393AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Kit DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9200</td><td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP - Purificazione PCR</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Alimentatore di base PowerPac</td><td>Bio Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>twin.tech piastra PCR 96&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>film termosaldante semi-gonna</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>0030127838</td><td></td></tr><tr><td>foglio termosaldante</td><td>Eppendorf</td><td>0030127854</td><td></td></tr><tr><td>termosigillante</td><td>Eppendorf</td><td>5390000.024</td><td></td></tr><tr><td>0.1-10 &#956; l Suggerimenti</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.002</td><td></td></tr><tr><td>2-200 &#956; l Suggerimenti</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.045</td><td></td></tr><tr><td>50-1.000 &#956; l Punte</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.100</td><td></td></tr><tr><td>MixMate&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5353000.014</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030121.023</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5424</td><td>Eppendorf</td><td>5424000.010</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Nextera XT Kit di preparazione del campione di DNA</a></td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>24 rxn</td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Nextera XT Index Kit</a></td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>24 indici</td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/systems/miseq.html">MiSeq Desktop Sequencer</a></td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/miseq_reagent_kit_v2.html">Kit di reagenti MiSeq v2</a></td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td>300 cicli</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Kit qPCR universale</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Kit di analisi del DNA PicoGreen Life</td><td>Technologies</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi dell'RNA Quant-iT RiboGreen</td><td>Life Technologies</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>Sistema PCR ProFlex a 96 pozzetti</td><td>Life Technologies</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>gel di DNA Novex 6% TBE</td><td>Life Technologies</td><td>EC6261BOX</td> tampone di corsa Novex TBE a <td>10 pozzetti</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>LC6675</td><td>5x (1 L)</td></tr><tr><td>Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6678</td><td>5x (10 ml)</td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10 mg/ml Etidio bromuro</td><td>Life Technologies</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Sistema PCR rapido in tempo reale</td><td>Life Technologies</td><td>Life Technologies 4329001</td><td>blocco a 384 pozzetti</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Skirted</td><td>Life Technologies</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>SpectroMax M2 Multi-Mode Lettore di micropiastre</td><td>Molecular Devices/VWR</td><td>89429-532</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Perline in acciaio inossidabile</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>5 mm</td></tr><tr><td>CLC Genomics Workbench</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Software per la pipeline di metilazione</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Retsch/Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Acqua senza nucleasi</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>TRIS cloridrato</td><td>Sigma</td><td>PHG0002-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra a gonna intera a 384 pozzetti, Standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1384</td><td></td></tr><tr><td>Absolute qPCR Seal</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>EZ Kit di metilazione-fulmine del DNA</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>ZymoTaq DNA polimerasi</td><td>Zymo Research</td><td>E2001</td><td>50 rxn</td></tr></tbody></table>

targeted dna metilazione analisi per sequenziamento di prossima generazione

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Il ruolo dei processi epigenetici nel controllo dell'espressione genica è noto da diversi anni. La metilazione del DNA nei residui di citosina è di particolare interesse per gli studi epigenetici in quanto è stato dimostrato che è un regolatore dinamico e duraturo dell'espressione genica. Gli sforzi per esaminare i cambiamenti epigenetici nella salute e nella malattia sono stati ostacolati dalla mancanza di metodi ad alto rendimento e quantitativamente accurati. Con l'avvento e la diffusione delle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS), questi strumenti vengono ora applicati all'epigenomica in aggiunta alle metodologie genomiche e trascrittomiche esistenti. Per le indagini epigenetiche sulla metilazione della citosina in cui sono state identificate regioni di interesse, come specifici promotori genici o isole CpG, e c'è la necessità di esaminare un numero significativo di campioni con un'elevata accuratezza quantitativa, abbiamo sviluppato un metodo chiamato Sequenziamento dell'Amplicone di Bisolfito (BSAS). Questo metodo combina la conversione del bisolfito con l'amplificazione mirata delle regioni di interesse, la costruzione di librerie mediate da trasposomi e l'NGS da banco. BSAS offre un metodo rapido ed efficiente per l'analisi di un massimo di 10 kb di regioni mirate in un massimo di 96 campioni alla volta, che può essere eseguito dalla maggior parte dei gruppi di ricerca con competenze di base in biologia molecolare. I risultati forniscono una quantificazione assoluta della metilazione della citosina con specificità di base. La BSAS può essere applicata a qualsiasi regione genomica da qualsiasi fonte di DNA. Questo metodo è utile per gli studi di verifica delle ipotesi delle regioni target di interesse, nonché per la conferma delle regioni identificate nelle analisi di metilazione dell'intero genoma, come il sequenziamento del bisolfito dell'intero genoma, il sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta e il sequenziamento dell'immunoprecipitazione del DNA metilato.

BSAS si legge correttamente allineato a sequenza di riferimento convertito sarà simile alla Figura 5. Dinucleotides CPG possono chiaramente essere identificati e gli stati di metilazione possono essere stimati osservando le chiamate di base a siti CpG nel mappato legge. Ad esempio, con comandi metilazione, 0% metilazione comporta tutte le letture mappati a siti CpG contenenti T (Figura 5A). 100% dei controlli metilazione comporterà tutta la letture mappato legge a siti contenenti CpG di C (Figura 5B). La quantificazione della frequenza di citosina (C / C + T) in siti CpG produce la frequenza metilazione nel campione originale. Una curva standard generata dal rappresentante interi controlli genoma metilazione (n = 3 / rapporto metilazione) mostra linearità metilazione quantificazione nonché precisione quantificazione a ciascun rapporto metilazione (Figura 6). Come esempio di questo metodo in totale, RNA e DNA sono stati co-iso<html> lata di topo cervelletto e retina (n = 4 / group). Espressione Rhodopsin, selettivamente espresso in tessuto retinico, è stata misurata utilizzando qPCR. Expression è stata rilevata in retina (Figura 7A). Utilizzando BSAS, i livelli di metilazione CpG sono stati quantificati nella regione del promotore rodopsina. Livelli di metilazione cumulativi tutta la regione promotore erano&gt; 80% nel cervelletto rispetto al &lt;15% nella retina (p &lt;0,001, t-test parametrico) (Figura 7B). BsAs benefici metilazione di quantificazione di site-specific metilazione quantificazione, e livelli di metilazione possono essere confrontati su base CpG-specifica attraverso una determinata regione genomica. Livelli di metilazione CpG in tutto il promotore rodopsina erano significativamente più alti nei campioni cerebellari rispetto ai campioni di retina (p &lt;0.001, t-test parametrico in ciascun sito CpG) (Figura 7c). 1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Schema del metodo BSAS In questo metodo, il DNA genomico è bisolfito convertito modificare cytosines unmethylation a uracils. Successivamente, durante la PCR questi uracils vengono modificati a timina. Amplificazione PCR è diretto contro le regioni di interesse e altamente arricchisce solo per queste sequenze. I risultanti ampliconi della PCR sono fatti in librerie dual-indicizzati attraverso un semplice processo tagmentation. Successivamente le librerie sono in sequenza su un banco di nuova generazione sequencer e il sequenziamento letture sono mappati in silico convertito sequenza di riferimento e cento metilazione della citosina di è determinata in modo specifico-base. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> Figura 2:. In silico conversione bisolfito di regione di interesse Tutte le regioni di interesse da ogni riferimento genomico può essere Selected per la conversione in silico bisolfito. Cytosines non-CpG sono sostituiti con timina nella sequenza di riferimento. Cytosines CpG restano cytosines del bisolfito convertiti riferimento. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Primer placement Primer bisolfito PCR sono progettati contro una in silico bisolfito convertito sequenza di riferimento. Primer devono essere progettati in modo che non si sovrappongano dinucleotidi CG o progettati adiacente dinucleotidi CG. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> Figura 4: Esempi di ampliconi alti e poveri PCR qualità e le librerie di sequenziamento elettroferogramma tracce rappresentative e gel spettacolo (A) amplicone ideale per la generazione biblioteca transposome mediata con una sola alta.Prodotto concentrazione. (B) Biblioteca generata da questo amplicon mostra elevata concentrazione e la distribuzione, anche le dimensioni. (C) scarso ampliconi della PCR qualità possono essere bassi in termini di dimensioni, la concentrazione, e contengono più prodotti e / o dimeri di primer. Questi ampliconi di scarsa qualità porterà a (D) fallito generazione biblioteca a bassa concentrazione e la distribuzione bassa dimensione. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> Figura 5: Esempi di uscite di sequenziamento di controlli metilazione. (A) In silico convertito sequenziamento di riferimento con i siti CpG evidenziata in rosso. 0% di controllo metilazione mappato legge alla regione mostrando timina selezionati (avidità evidenziare) mappatura a siti CpG. Di controllo (B) 100% metilazione mappato legge mostra (blu highlight) mappatura di citosina in siti CpG. Figura 6:. Quantificazione metilazione in una serie di controlli di metilazione dell&#39;intero genoma controlli metilazione mescolato a rapporti di metilazione (n = 3 / ratio) da 0% a 100% sono stati quantificati con BSAS. Tracciamento quantificazione del previsto contro quantificata dimostra linearità del controllo metilazione quantificazione. Attraverso tutti i controlli, si è ad alta precisione in metilazione quantificazione. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> Figura 7: Esempio di abbinato metilazione del DNA ed espressione genica analisi da campioni di tessuto. (A) Rhodopsin espressione di mRNA relativa dal topo cerebellare e tessuto retinico. (B) Rhodopsin metilazione media promotore quantificato da BSAS tra cerebellare e il DNA della retina (*** p &lt;0.001, parametrico t-test). &lt;strong&gt; livelli di metilazione C) sito-specifica CpG tutto promotore rodopsina (-244 a +6, rispetto al sito di inizio della trascrizione [TSS]) nel topo cervelletto e DNA retina.

Il sequenziamento dell'amplicone del bisolfito (BSAS) è un metodo per quantificare la metilazione della citosina in regioni genomiche mirate di interesse. Questo metodo utilizza la conversione del bisolfito abbinata all'amplificazione PCR delle regioni target prima del sequenziamento di nuova generazione per produrre una quantificazione assoluta della metilazione del DNA a livello base-specifico.

Targeted DNA metilazione Analisi per sequenziamento di prossima generazione

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la metilazione di CPG in regioni mirate di interesse a partire da DNA genomico isolato da tessuti o cellule di interesse. Questo viene ottenuto innanzitutto progettando primer specifici per PCR a solfito per amplificare le regioni di interesse da DNA genomico convertito con bisolfito. Nel secondo passaggio, la regione di interesse convertita con bisolfito viene amplificata e vengono generate librerie di sequenziamento di nuova generazione o NGS a partire dai prodotti di amplificazione.Successivamente, le librerie vengono sottoposte a sequenziamento e vengono generati file FASTQ per l'analisi. Nell'ultimo passaggio, le letture di sequenziamento vengono allineate alla sequenza bersaglio di riferimento convertita con bisolfito e la percentuale di 5mC viene calcolata definitivamente mediante sequenziamento di ampliconi con bisolfito o BS A S, che può essere eseguito per quantificare in modo preciso e accurato la metilazione del CPG in qualsiasi regione di interesse proveniente da qualsiasi organismo modello. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il sequenziamento di Sanger è che il BS A S fornisce una quantificazione accurata e precisa della metilazione del CPG in modo rapido e ad alto rendimento, offrendo la possibilità di analizzare molteplici regioni in un elevato numero di campioni.Dopo aver identificato la sequenza bersaglio e progettato il primer, assemblare la reazione per l'ottimizzazione dell'amplificazione del bersaglio di un singolo amplicone, quindi sigillare una piastra PCR con un film sigillato a caldo per visualizzare gli ampliconi mediante elettroforesi su gel. Successivamente, caricare i pozzetti appropriati con 30 microlitri di reazioni PCR o di ladder, quindi far correre il gel a 200 volt per circa 45 minuti. Quando il primo colorante raggiunge l'estremità del gel, arrestare la corsa elettrica e quindi ricoprire l'intero gel con cinque microgrammi per millilitro di bromuro di AUM appena preparato.Dopo cinque minuti, acquisire l'immagine del gel mediante un transilluminatore UV a una lunghezza d'onda di eccitazione di 482 nanometri. Utilizzare il marker di peso molecolare per determinare le dimensioni degli AMPLICONI PCR e verificare la specificità della reazione. Cercare bande multiple diverse dalla dimensione dell'amplicone attesa per determinare la dimensione media dei picchi della libreria rilevati e una stima della molarità.Successivamente, eseguire le librerie su un chip per elettroforesi capillare per la determinazione delle dimensioni del DNA utilizzando un saggio DNA ad alta sensibilità, seguendo le istruzioni del produttore. Per quantificare le librerie mediante QPCR, utilizzare primer progettati contro le sequenze degli adattatori presenti nelle librerie generate e standard con concentrazione nota su un apparato in tempo reale, impostando la quantificazione assoluta secondo le istruzioni del produttore.Quindi utilizzare le dimensioni delle librerie e la quantificazione molare ottenuta dalla QPCR per calcolare le concentrazioni molari delle librerie. Dopo il sequenziamento, importare i file fastQ compressi nella pipeline di analisi del sequenziamento appropriata, selezionare l'importazione e quindi scegliere il metodo di sequenziamento utilizzato per generare le letture, in modo da mantenere i punteggi Q per le applicazioni di taglio delle letture. Importare i file di lettura fastQ compressi appropriati, quindi, nelle opzioni generali, deselezionare l'opzione di scarto dei punteggi di qualità.Selezionare una posizione per le letture importate e fare clic su fine. Quindi, sotto gli strumenti principali di NGS, selezionare il taglio delle sequenze. Evidenziare le letture da tagliare, mantenendo solo quelle con punteggi maggiori o uguali a Q 30.Quindi selezionare il taglio utilizzando i punteggi di qualità e impostare il limite a 0,001. Per selezionare ulteriormente solo le sequenze contenenti meno di un nucleotide ambiguo o esattamente uno, selezionare il taglio dei nucleotidi ambigui e impostare il numero massimo di ambiguità a uno.Quindi selezionare una posizione in cui salvare le letture tagliate e fare clic su "fine" per mappare le letture tagliate sul riferimento genico convertito in silico dal solfito. Nelle strumenti principali NGS, selezionare "mappa letture". Come riferimento, selezionare le letture tagliate da mappare e fare clic su "avanti".Quindi, sotto mascheramento del riferimento, selezionare la sequenza di riferimento convertita e scegliere nessun mascheramento. Fare clic su Avanti, quindi assegnare un punteggio di tre per le corrispondenze errate, inserzioni e delezioni. Assegnare un punteggio di uno per la frazione minima della lunghezza della lettura che si allinea al riferimento e assegnare un punteggio di 0,9 per la frazione minima di identità tra l'allineamento, la lettura e il riferimento; nella gestione delle corrispondenze non specifiche, selezionare Ignora e fare clic su Avanti nelle opzioni di output.Successivamente, selezionare Crea mappature di letture autonome. Quindi, nella sezione gestione risultati, fare clic su salva. Selezionare una posizione in cui salvare la mappatura delle letture e fare clic su fine per eseguire la chiamata delle varianti sulle letture mappate.Nell'analisi di re-sequenziamento, selezionare il rilevamento delle varianti a bassa frequenza e scegliere il mapping dei letture da analizzare. Fare clic su avanti, quindi nella sezione dei parametri per le varianti a bassa frequenza inserire 0,01% e fare clic su avanti. Nella sezione dei filtri generali, impostare la copertura minima a 1000 per assicurarsi che la sequenza abbia una profondità maggiore o uguale a 1000 x.Infine, fare clic su Avanti, quindi nelle opzioni di output selezionare "Crea tabella annotata" e scegliere un percorso in cui salvare il file della tabella delle varianti, fare clic su Fine ed utilizzare le frequenze delle varianti nei siti CPG annotati nella regione di interesse provenienti dal file della tabella delle varianti per calcolare la frequenza della metilazione della citosina in una citosina di riferimento nel contesto CG. Le letture di sequenziamento da amplificone solfito correttamente allineate alla sequenza di riferimento convertita assomiglieranno a quelle illustrate nella figura. I dinucleotidi CPG possono essere chiaramente identificati e gli stati di metilazione possono essere stimati osservando le chiamate di base nei siti CPG. Nelle letture mappate, una metilazione dello 0% produrrà letture contenenti timina mappate ai siti CPG.I controlli di metilazione al 100% produrranno letture mappate contenenti citosine mappate su siti CPG. In questo esperimento, RNA e DNA sono stati co-isolati da un topo, cervelletto e retina. L'espressione dell'opsina espressa selettivamente nel tessuto retinico è stata quindi misurata mediante QPCR, come previsto.L'RNA dell'opsina è stato rilevato solo nella retina dopo la quantificazione dei livelli di metilazione CPG nella regione del promotore dell'Opsin mediante sequenziamento dopo amplificazione con bisolfito. Tuttavia, i livelli cumulativi di metilazione lungo la regione del promotore erano superiori all'80% nel cervelletto, rispetto a meno del 15% nella retina. La quantificazione della metilazione con B SAS trae vantaggio dalla quantificazione specifica per sito, consentendo il confronto dei livelli di metilazione su base CPG-specifica in qualsiasi regione genomica data.In effetti, in questo esperimento, i livelli di metilazione CPG attraverso il promotore dell'opsina si sono rivelati significativamente più elevati nei campioni cerebellari rispetto ai campioni retinici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare la metilazione CPG in regioni bersaglio di interesse a partire da DNA genomico isolato da tessuti o cellule.

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Il gold standard per l'analisi di metilazione del DNA è il sequenziamento del DNA genomico di bisolfito convertito. Questo metodo sfrutta l'accresciuta sensibilità della citosina rispetto ai 5-metilcitosina (5-MEC) di bisolfito deaminazione in condizioni acide. Cytosines non metilato può essere distinto dal cytosines metilato dopo amplificazione del DNA genomico di destinazione.

Metilazione del DNA: Modifica bisolfito e analisi

Un flusso di lavoro semplificato per studiare la metilazione del DNA e le variazioni di espressione genica su prime fasi di vita di stress viene mostrato. Partendo dalla separazione materna di topi neonati ed isolamento di tessuti cerebrali discreti, si rappresenta un protocollo per isolare simultaneamente DNA e RNA dai punzoni tessuto cerebrale per sequenziamento bisolfito successivo e RT-PCR.

Ottimizzato Analisi della metilazione del DNA e l&#39;espressione genica da piccole aree anatomicamente definiti del cervello

Il sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta potenziata è un metodo per la preparazione di librerie di sequenziamento per l'analisi della metilazione del DNA basata sulla digestione dell'enzima di restrizione combinata con la conversione del bisolfito di citosina. Questo protocollo richiede 50 ng di materiale di partenza e produce dati di risoluzione delle coppie di basi in regioni genomiche ricche di GC.

ENHANCED ridotto Rappresentanza bisolfito sequenziamento per la valutazione della metilazione del DNA in Risoluzione coppia di basi

Qui vi presentiamo un protocollo per indagare genoma metilazione del DNA in studi clinici di screening dei pazienti su larga scala utilizzando il metil-Binding sequenziamento del DNA di cattura (MBDCap-ss o MBD-ss), la tecnologia e la successiva analisi bioinformatica pipeline.

Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente

Questo lavoro descrive un protocollo di sequenziamento del dominio di binding di metil-CpG (MBD) ottimizzato e una pipeline computazionale per identificare le regioni ricche di CpG riccamente differenziate in pazienti con leucemia linfocitaria cronica (CLL).

Analisi completa della metilazione del DNA usando un metodo basato sulla cattura di dominio di metile-CpG in pazienti con leucemia linfocitica cronica

Qui, presentiamo un protocollo per consentire la quantificazione accurata della metilazione del DNA (mtDNA) mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo una digestione enzimatica del DNA con BamHI accoppiato con una pipeline di analisi bioinformatica che può essere utilizzata per evitare la sopravvalutazione dei livelli di metilazione del DNA mitocondriale causato dalla struttura secondaria del mtDNA.

Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale

Qui, descriviamo il protocollo e l'implementazione di metil-Seq, una piattaforma di epigenomic, utilizzando un modello del ratto per identificare i cambiamenti epigenetici associati all'esposizione a stress cronico. I risultati dimostrano che la piattaforma di metil-Seq ratto è in grado di rilevare differenze di metilazione che derivano dall'esposizione di sforzo in ratti.

Una piattaforma di metil-Seq ratto per identificare i cambiamenti epigenetici connessi con l'esposizione di sforzo

Di seguito è descritto l'uso di un metodo di amplificazione della sonda specifico per la metilazione per analizzare i livelli di metilazione degli elementi LINE-1 nelle cellule staminali mesenchymiche trattate con vescicle extracellulari derivate dall'osteosarcoma. È inoltre dimostrata l'ultracentrifuga, una procedura popolare per separare le vesciche extracellulari dal siero bovino fetale.

Analisi della metilazione LINE-1 nelle cellule staminali mesenchietratta con Vescicoli Extracellulari Derivati dall'Osteosarcoma

Qui descriviamo una procedura per l'analisi a livello genomico della metilazione del DNA nei tumori gastrointestinali. La procedura è rilevante per studi che studiano le relazioni tra i modelli di metilazione dei geni e i fattori che contribuiscono alla carcinogenesi nei tumori gastrointestinali.

Analisi a livello genomico della metilazione del DNA nel cancro gastrointestinale

Le DNA metiltransferasi sono potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Qui, viene presentato un protocollo per valutare piccole molecole per l'inibizione della DNA metiltransferasi. Questo test utilizza un'endonucleasi per accoppiare la metilazione del DNA alla generazione di fluorescenza e consente di monitorare l'attività enzimatica in tempo reale.

Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

Impara a quantificare la metilazione del DNA in regioni genomiche specifiche mediante bisulfite amplicon sequencing. Questo metodo combina conversione con bisulfite, PCR e sequenziamento NGS per analisi epigenetiche precise.

Targeted DNA metilazione Analisi per sequenziamento di prossima generazione

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