Super-Resolution Imaging di cellule Natural Killer immunologica Sinapsi su un vetro supportato Planar doppio strato lipidico

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come catturare con successo immagini a super risoluzione delle sinapsi immunologiche di cellule natural killer o NK sul doppio strato lipidico supportato. Ciò si ottiene costruendo un doppio strato lipidico planare supportato da vetro contenente anticorpi contro il recettore di attivazione delle cellule NK CD 16 In vetrini da camera. Le cellule NK precedentemente isolate vengono quindi aggiunte al doppio strato lipidico incorporato nell'anticorpo planare, seguito dalla colorazione delle cellule con f actina e perforina.

La fase finale è l'imaging delle sinapsi delle cellule NK risultanti utilizzando il microscopio stead, infine l'imaging della sinapsi NK sul doppio strato lipidico supportato. L'uso di stead mostra la sinapsi delle cellule NK in un dettaglio migliorato, il che consente la visualizzazione dell'ultra struttura del citoscheletro di actina e dei granuli litici perran positivi posizionati su regioni a bassa densità di actina F. Quindi il punto principale di questa tecnica è che la barriera lipidica semplice di supporto in vetro può imitare la membrana positiva della cellula tuck, la proteina su questa barriera lipidica semplice.

Possono muoversi lateralmente, il che può ricapitolare meglio la formazione di molto logicamente rilevante dell'immunosinapsi. Questo messaggio può aiutare a rispondere ai cristiani chiave nel campo dell'immunologia, consentendo ai ricercatori di visualizzare la formazione delle sinapsi in modo controllato con dettagli, il che è irrealizzabile utilizzando approcci commerciali e microscopici. Un borsista postdoc di pittura e una borsa di studio per studenti laureati dimostreranno la procedura per assemblare il doppio strato lipidico planare supportato da vetro.

Per prima cosa, prepara 100 millilitri di soluzione piranha mescolando perossido di idrogeno al 30% con acido solforico in un rapporto da uno a tre in un becher in questa soluzione. Posizionare due vetrini coprioggetti rettangolari numero 1,5 per 20-30 minuti durante la pulizia dei vetrini. Recuperare una provetta di lipidi DOPC da 400 micromolari precedentemente preparati e una provetta di lipidi PE di biotina da 80 micromolari precedentemente preparati.

Trasportali con ghiaccio nel serbatoio dell'argon dopo aver ossigenato una nuova provetta da microcentrifuga con argon. Sommare la DOPC e la biotina PE in un rapporto di uno a uno. Il volume specifico varierà in base alle esigenze sperimentali, ma dovrebbe essere di almeno due microlitri.

Ogni desossi ossigena la provetta di miscela e le singole provette dei reagenti prima di rimettere la scala in frigorifero. Al termine della pulizia, sciacquare accuratamente i vetrini coprioggetto con acqua distillata. Stendere i vetrini di copertura ad asciugare all'aria per alcuni minuti, quindi prelevare 1,5 microlitri della miscela di liposomi e aliquotare in una singola goccia in una delle camere di corsia di un vetrino da camera.

L'uso di due drop per corsia è tipico ma non necessario. Ora, in modo rapido ed efficiente, posiziona il vetrino coprioggetti asciutto sulle goccioline, assicurati che le gocce siano sufficientemente distanziate in modo che non si uniscano una volta posizionato il vetrino. Inoltre, assicurarsi che le gocce rimangano circolari e ben definite senza toccare i bordi delle pareti della camera.

Premere con decisione tra e intorno a ciascuna corsia per garantire una tenuta stagna tra il coperchio. Scivolare e far scorrere segnare le posizioni delle gocce usando un pennarello. Quindi passare 100 microlitri di involucro acquoso al 5% attraverso la camera per bloccare il doppio strato.

Cercare di assicurarsi che non ci siano bolle nella camera di flusso. Quindi iniettare 100 microlitri di strept adin a una concentrazione di 333 nanogrammi per millilitro in ciascuna corsia. Dopo l'incubazione per 10-15 minuti a temperatura ambiente, lavare facendo scorrere tre millilitri di soluzione fisiologica tamponata con l'1% di albumina sierica umana attraverso ciascuna corsia.

Per rimuovere l'eccesso di tritina, aggiungere 100 microlitri di anti CD 16 biotinilato marcato con fluorescenza alla concentrazione proteica precedentemente determinata come descritto nel protocollo di testo dopo l'incubazione al buio per 20-30 minuti. Lavare di nuovo facendo scorrere tre millilitri di soluzione salina tamponata con l'1% di albumina sierica umana attraverso ogni corsia. Quindi far scorrere 100 microlitri di biotina D a una concentrazione di 25 nanomolari attraverso la camera per legare l'eccesso di tabina STR e quindi eliminare la possibilità di legame non specifico della tabina STR alle cellule.

Successivamente contare le cellule NK umane e risospenderle a una concentrazione di 500.000 per millilitro in cumuli di soluzione salina tamponata con albumina sierica umana all'1%. Lavare la biotina D fuori dalla camera con altri tre millilitri di soluzione salina tamponata con l'1% di albumina sierica umana per corsia. Una volta che le cellule sono state risospese alla concentrazione desiderata, aggiungere 100 microlitri a ciascuna corsia.

Posizionare la camera in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per 30-60 minuti. Dopo questo periodo di incubazione, fissare le cellule con aldeide paraforme al 4% a temperatura ambiente per 10-20 minuti. Lavare facendo scorrere tre millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato attraverso ciascuna corsia per rimuovere l'aldeide paraformale.

Quindi aggiungere 400 microlitri di tampone bloccante prima di incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, colorare l'actina e la perforina aggiungendo due microlitri di Phin diluito marcato con fluorescenza e anticorpo monoclonale anti perran marcato con fluorescenza, incubare a temperatura ambiente per un'ora prima del lavaggio facendo scorrere tre millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato attraverso la camera. La camera è pronta per l'inizio dell'imaging.

Accendere tutti i moduli hardware necessari del microscopio fisso. Avviare il software di analisi delle immagini e abilitare sia la scansione risonante che i moduli stead. Dopo aver effettuato queste selezioni, attendere circa tre-cinque minuti per l'avvio del software.

Fare clic sulla scheda di configurazione nella parte superiore dello schermo, selezionare la configurazione laser. Quindi accendi la luce bianca e i laser stead a 592 nanometri. Scegli l'obiettivo 100 x e allinea il raggio laser di eccitazione con un laser a deplezione a 592 nanometri.

Selezionare il modulo di configurazione del laser, spegnere il laser di esaurimento 592 e accendere il laser di esaurimento a 660 nanometri. Posizionare il vetrino sul tavolino sopra l'obiettivo. Mettere a fuoco le cellule legate sulla regione delimitata del doppio strato utilizzando la lampada a luce bianca e gli oculari.

Quindi torna alla scheda di acquisizione direttamente a destra della scheda di configurazione. Fare clic sulla scheda Passa alla luce bianca, quindi accendere il modulo e trascinare la linea laser di eccitazione sulla lunghezza d'onda appropriata. Dopo aver selezionato il rilevatore desiderato e impostato l'intervallo di rilevamento, fare clic sul pulsante sequenziale nella barra degli strumenti di acquisizione a sinistra per visualizzare la finestra di dialogo di scansione sequenziale nella parte inferiore della barra degli strumenti a sinistra.

Ciò consente all'utente di aggiungere più sequenze, ciascuna con un fascio di eccitazione diverso per un colore diverso. Fare clic tra i fotogrammi, quindi impostare il rilevatore della frequenza di eccitazione e l'intervallo di rilevamento per ogni colore aggiuntivo. Una volta ottimizzate tutte le impostazioni, premi start per iniziare il processo di acquisizione.

L'immagine a triplo colore della sinapsi delle cellule NK sul doppio strato lipidico planare supportato da vetro mostra che l'anticorpo anti CD 16 mostrato in rosso si accumula sul doppio strato lipidico innescando la formazione di F actina e la polarizzazione e la penetrazione della perforina mostrate in blu attraverso la rete di f actina sul pannello focale. Utilizzando questo approccio combinato, è possibile osservare in modo pulito i micro cluster di anti CD 16 marcati in fluorescenza all'interno del doppio strato lipidico supportato da vetro, che rispecchia direttamente il clustering di CD 16 sulla cellula NK. Rispetto all'immagine confocale convenzionale, la struttura ad anello dell'ammasso centrale di CD 16 è più facilmente distinguibile nell'immagine invece a causa della fluorescenza ambientale impoverita.

Inoltre, l'ultrastruttura del citoscheletro di actina si osserva con una risoluzione significativamente migliorata. Coerentemente con le osservazioni precedenti, i granuli litici positivi alla perina sono stati osservati posizionati su regioni a bassa densità di actina F. Nell'immagine al posto, un dettaglio cruciale che si perde per lo più nell'immagine confocale Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita per circa quattro ore se eseguita correttamente durante il passaggio.

È importante ricordare di mantenere il campione deossigenato spostando ripetutamente l'ossigeno con l'argonne e, durante l'assemblaggio della camera, posizionando rapidamente il vetrino coprioggetto sul campione e immergendolo nella soluzione dell'involucro.