Transfection, selezione, e Colonia-picking di cellule staminali umane pluripotenti indotte TALEN-mirati con Gene GFP nel AAVS1 Safe Harbor

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare un AA isolato rispetto a una cellula staminale pluripotente inducibile mirata o cloni IPSC che esprimono GFP. Ciò si ottiene consegnando prima un AAV un artiglio e un A VS un plasmidi donatori C-A-G-E-G-F-P in modo efficiente nelle IPC tramite l'affezione del nucleo. Nella seconda fase, le cellule bersaglio A a vs uno vengono selezionate dalla micina pur su cellule di alimentazione embrionali di topo.

Successivamente, i singoli cloni mirati che esprimono GFP A A vs one vengono raccolti in una piastra a 96 pozzetti rivestita con matrigel. Nella fase finale, i cloni A A VS ONE G-F-P-I-P-S-C vengono ampliati con tecniche di coltura IPSC standard e E eight. Infine, la microscopia a immunofluorescenza e la citometria a flusso sono state utilizzate per mostrare l'espressione uniforme e robusta della GFP in cloni IPSC umani mirati ad AA VS one.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di prelievo delle colonie comportano la microdissezione di cloni mirati utilizzando speciali strumenti di prelievo delle colonie al microscopio, che è difficile da apprendere durante l'istruzione fianco a fianco. Inizia lavando le colture IPSC una volta ciascuna con PBS. Quindi aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione cellulare delicato a 37 gradi Celsius a ciascun pozzetto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti quando più del 50% delle cellule si è dissociato dal recipiente di coltura.

Utilizzare una pipetta P 1000 per disgregare meccanicamente eventuali grumi di cellule rimanenti o cellule attaccate. Quindi aggiungere due millilitri di terreno E otto a ciascun pozzetto e utilizzare una pipetta da 10 millilitri per disaggregare ulteriormente le colture in sospensioni a singola cellula. Ora raccogli le cellule raccolte in un tubo conico da 15 millilitri e girale verso il basso.

Risospendere il pellet in una quantità minima di E otto medio per il conteggio. Quindi, dopo aver confermato la vitalità delle colture mediante l'esclusione trian blue, nonché la loro sufficiente dissociazione, ha trasferito 3 milioni di cellule in ciascuna delle due provette coniche da 15 millilitri, mentre le cellule di centrifugazione impostano il sistema di elettroporazione sul programma specifico del tipo di cellula per la linea di cellule staminali embrionali umane H nine. Quindi aggiungere 10 microgrammi del solo donatore di ricombinazione omologa a un pellet per il campione di controllo e 10 microgrammi del plasmide donatore di ricombinazione omologa, insieme a cinque microgrammi di ciascun plasmide talon per il campione sperimentale.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione completa di trasfezione di tre cellule primarie P a temperatura ambiente a ciascuno dei pellet di controllo e sperimentali e risospendere le cellule. Trasferire i campioni in cuvette individuali e poi mangiare i campioni subito dopo la trasfezione. Aggiungere 500 microlitri di terreno a temperatura ambiente E otto a ciascun veterinario Q e quindi trasferire i campioni IPSC trasfettati goccia per goccia in singole piastre da 10 centimetri contenenti DR quattro fibroblasti embrionali di topo Prima di prelevare le colonie, co-insegnare bene una piastra da 96 pozzetti con 50 microlitri di soluzione di matrice di membrana basale e quindi conservare la piastra per una notte a quattro gradi Celsius la mattina successiva.

Quando la piastra ha raggiunto la temperatura ambiente, aspirare la soluzione in eccesso e caricare ogni pozzetto con 100 microlitri di terreno E otto integrati con 10 micromolari Y 2 7 6 3 2. Quindi, posizionare un microscopio invertito in una cabina di sicurezza biologica e sterilizzarlo con uno spray leggero di etanolo al 70%. Quindi posizionare una pipetta da pascolo in vetro su un bruciatore bunsen per creare uno strumento per la raccolta delle colonie con un minuscolo gancio sulla punta dopo la sterilizzazione con etanolo al 70%.

Posizionare il gancio nella cappa ad asciugare e quindi posizionare la coltura IPSE sul tavolino del microscopio per prelevare i cloni. Individua una colonia adatta a basso ingrandimento e usa lo strumento di raccolta delle colonie per rintracciarla e squartarla. Quindi raschiare delicatamente la colonia squartata dal recipiente di coltura e utilizzare una pipetta P 200 impostata a circa 30 microlitri per raccogliere gli IPC che galleggiano liberamente placcando le cellule direttamente sulla matrice della membrana basale.

Durante la raccolta, gli IPC dovrebbero attaccarsi entro due o quattro ore dalla placcatura. Infine, incubare le colonie raccolte durante la notte a 37 gradi Celsius e rinfrescare le cellule con un terreno E otto completo la mattina seguente. È importante trasfettare solo PSC I di alta qualità durante l'esperimento.

Le colture IPSC dovrebbero contenere principalmente colonie distinte con una morfologia simile a un ciottolo come le cellule viste qui e le cellule differenziate non dovrebbero superare il 10% della coltura, la capacità di trasfettare delle IPC può essere valutata e ottimizzata utilizzando il piccolo vettore PAX GFP poiché la trasfezione con PAX GFP rappresenta tipicamente la massima efficienza raggiungibile grazie alle sue piccole dimensioni. L'espressione transitoria di un'informazione A VS one C-A-G-E-G-F-P e di IPC trasfettate raggiunge picchi da 48 a 72 ore dopo la trasfezione, che può essere confermata con una piccola porzione di cellule trasfettate mediante citometria a flusso. L'efficienza della trasfezione può variare notevolmente.

Anche negli esperimenti con una frazione positiva per GFP è solo del 10%I singoli cloni che mostrano una fluorescenza uniforme dovrebbero essere abbastanza grandi per il prelievo di colonie dopo la selezione di micina pura. Inoltre, una volta nel 96, i cloni IPSC mirati espansi dovrebbero mostrare un'espressione stabile e uniforme di GFP. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasfettare i PSC in modo efficiente per affezione nucleare e come isolare AV un porto sicuro.

Cloni IPSE mirati utilizzando strumenti di selezione delle colonie.