Name: Transfection, selezione, e Colonia-picking di cellule staminali umane pluripotenti indotte TALEN-mirati con Gene GFP nel AAVS1 Safe Harbor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Impara l'editing genico TALEN nel locus AAVS1 di cellule staminali pluripotenti umane indotte. Questo protocollo permette l'integrazione mirata del gene GFP e la selezione di cloni stabili per la ricerca.

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Questa ricerca è stata supportata dal Fondo Comune NIH e dal Programma di Ricerca Intramurale dell'Istituto Nazionale di Artrite, Muscoloscheletrico e Malattie della Pelle.

1. Preparazione della matrice di membrana basale e rivestimento dei Plasticware <ol><li> Posizionare il congelato membrana basale matrice magazzino da -20 ° C su ghiaccio e scongelare una notte a 4 ° C. </li><li> Dopo lo scongelamento, pipetta 2 mg aliquote di matrice membrana basale in tubi Eppendorf pre-refrigerati. Conservare questi a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Per preparare piatti matrice rivestite membrana basale, scongelare un&#39;aliquota sul ghiaccio fino a quando l&#39;ultimo pezzo di ghiaccio nei scompare provetta Eppendorf (di solito entro ~ 2 ore). </li><li> Dopo lo scongelamento, aggiungere matrice membrana basale a 12 ml di freddo (4 ° C) DMEM / F12 per rendere membrana basale soluzione di rivestimento matrice. </li><li> Aggiungere la soluzione di matrice membrana basale alla nave cultura appropriata. Per un 6-pozzetti, dispensare 1 ml per pozzetto. Agitare la piastra per assicurarsi che la soluzione di matrice membrana basale copre completamente ogni pozzetto. </li><li> Parafilm sigillare la membrana basale matrice rivestite piatto / piatto, e incubare a room temperatura per 1 ora prima dell&#39;uso. In alternativa, le piastre matrice rivestite negozio membrana basale / piatti a 4 ° C e utilizzare entro 2 settimane di rivestimento. NOTA: Aggiungere ulteriore DMEM / F12 alla membrana basale matrice rivestite piatto / piatto per evitare l&#39;essiccazione. Prima di utilizzare 4 ° C membrana basale memorizzato matrice rivestite piatto / piatto, mettetelo in una cappa di sicurezza biologica e lasciare che raggiunga la temperatura ambiente per almeno 30 minuti. </li><li> Aspirare matrice membrana basale completamente prima della aggiunta del mezzo e cellule. </li></ol> 2. Preparazione di E8 media <ol><li> Preparare E8 terreno di coltura da scongelamento E8 supplemento notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere 10 ml di E8 media basale del magazzino da 500 ml e scartare. </li><li> Pipettare l&#39;intero flaconcino da 10 ml di E8 supplemento direttamente in 490 ml di E8 medio basale. Non caldo terreno completo E8 in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C, come sbalzi di temperatura ripetuti possono degradare il bFGF nel complete E8 media. </li><li> Utilizzare mezzo completo E8 entro 2 settimane di aggiunta del supplemento. </li></ol> 3. scongelamento dei iPSCs <ol><li> Rimuovere una fiala di iPSCs congelati da azoto liquido e posto in ghiaccio secco. </li><li> Scongelare rapidamente la provetta in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C; agitare il flacone a bagnomaria fino a quando solo un piccolo frammento di resti di ghiaccio. </li><li> Spruzzare il flaconcino con il 70% di etanolo e trasferimento in una cappa di sicurezza biologica. </li><li> Aggiungere 1 ml di temperatura ambiente E8 medio a gocce direttamente al flacone. </li><li> Con una pipetta 2 ml, trasferire la sospensione cellulare a gocce in 9 ml di E8 media in un tubo da 15 ml. Agitare il tubo frequentemente per assicurare che le cellule e medie mescolare bene rapidamente. </li><li> Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un volume adeguato di E8 supplementato con 10 micron Y-27632. </li><li> Aggiungere le cellule ad un numero adeguato di seminterrato membrane pozzi matrix-rivestito, e posto a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore durante la notte. Si raccomanda al piatto almeno 0,2 x 10 6 iPSC per pozzetto di un 6-pozzetti per consentire rapido recupero dopo lo scongelamento. </li></ol> 4. Manutenzione e Passaging routine di iPSCs <ol><li> Aggiorna E8 media giornaliera. </li><li> Monitorare la morfologia e la confluenza di cellule con un microscopio invertito. iPSCs di alta qualità crescono in colonie piatte con bordi distinti; singole colonie in possesso di un aspetto &quot;acciottolato-like&quot;. </li><li> Passage le cellule iPSCs quando raggiungono ~ 70% di confluenza. </li><li> Preparare una soluzione EDTA passaging aggiungendo 0,9 g NaCl e 500 microlitri 0,5 M EDTA a 500 ml DPBS. Mescolare bene per sciogliere NaCl, e filtro di vuoto per sterilizzare. Scaldare una aliquota della soluzione passaging in un bagno d&#39;acqua a 37 ° prima passaging. </li><li> Per il passaggio, aspirare speso terreno di coltura e lavare le cellule una volta con un uguale volume di pas caldiSaging soluzione. Aspirare, e pipetta abbastanza EDTA soluzione passaging per rivestire le celle (1 ml per pozzetto di un 6-pozzetti). </li><li> Mettere le cellule al microscopio invertito e osservare le colonie IPSC. La comparsa di fori all&#39;interno colonie e bordi rialzati dovrebbe diventare evidente entro 2 a 5 min. </li><li> Aspirare accuratamente la soluzione di EDTA passaging. </li><li> Con una pipetta 10 ml, a meno di 4 ml di E8 medio (se si utilizza un 6-pozzetti) ad alta pressione direttamente in ogni pozzetto da diversi passaggi. </li><li> Raccogliere le macchie IPSC, e suddiviso in un numero adeguato di pozzi in funzione del rapporto di divisione da 1: 8 a 1:12. Non over-pipetta, come disaggregazione dei grumi di cellule si provocherebbe un calo della redditività. </li><li> Porre la piastra in un incubatore, e oscillare la piastra posteriore e indietro e da lato a lato diverse volte per disperdere le cellule. </li></ol> 5. Preparazione di MEF e iPSCs per Tansfection <ol><li> 48 ore prima transfection, iPSCs passaggio a ~ 1: 6 in quattro o più pozzi di un 6-pozzetti membrana basale matrice rivestite, in modo che siano il 70% confluenti due giorni da qui. </li><li> Il giorno successivo, scongelare DR4 MEF in media MEF costituito da DMEM (glucosio) supplementato con 10% FBS e 1x MEM-NEAA. </li><li> Piatto DR4 MEF in due piatti da 10 cm a ~ 2 x 10 4 cellule / cm 2 e incubare una notte a 37 ° C. </li><li> Il giorno della trasfezione, modificare medio MEF a E8 supplementato con 10 mM Y-27632 30 min prima di eseguire trasfezione su iPSCs. </li><li> Opzionale: Se si desidera citometria a flusso di iPSCs post-trasfezione, rimuovere una piastra a matrice rivestita membrana basale tra 4 ° C e posto a temperatura ambiente. </li><li> Optional: 4 ore prima della trasfezione, completare pre-trasfezione cultura iPSC con Y-27632 alla concentrazione finale di 10 micron. </li></ol> 6. Gentle cellule dissociazione reagente Treatment unnd Transfection di iPSCs tramite un sistema di elettroporazione <ol><li> Rimuovere P3 soluzione trasfezione cellula primaria di 4 ° C e lasciare che raggiunga la temperatura ambiente per ~ 30 min. Aggiungere l&#39;intero complemento 100 microlitri della soluzione di trasfezione prima dell&#39;uso. </li><li> Warm dolce-cell reagente dissociazione in un bagno di 37 ° C dell&#39;acqua. </li><li> Ottenere AAVS1 Talens (PZT-AAVS1-L1 e PZT-AAVS1-R1) e AAVS1-CAG-EGFP donatore da -20 ° C. </li><li> Rimuovere iPSCs dal termostato e lavare una volta con DPBS. </li><li> Aggiungere 1 ml di delicata cellule dissociazione reagente per pozzetto e incubare iPSCs a 37 ° C per 5 minuti, o fino superiore al 50% delle cellule sono dissociato dal recipiente di coltura. </li><li> Pipettare le cellule su e giù per un paio di volte con una pipetta P1000 a dissociarsi tutte le rimanenti cellule dalla nave in cultura, e per rompere grumi IPSC. </li><li> Aggiungere 2 ml di E8 media ad ogni bene, e pipetta su e giù più volte con una pipetta 10 ml a Fürther disaggregare grumi di cellule in cellule singole NOTA: l&#39;efficienza Transfection declina in modo significativo se grumi di cellule non sono sufficientemente disaggregati. </li><li> Raccogliere iPSCs in un tubo da 15 ml e centrifugare a 100 xg per 3 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in una quantità minima di E8 medie. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro dopo l&#39;applicazione di una macchia vitali come 0,4% Trypan blu. Assicurarsi che le cellule siano sufficientemente dissociati, mentre il conteggio (1-3 cellule per &quot;macchia&quot;). </li><li> Dispensare 3 x 10 6 cellule in ciascuno dei due 15 ml conici, e far girare di nuovo a 100 xg per 3 min. NOTA: bassa centrifugazione velocità riduce lo stress cellulare e permette un facile risospensione di iPSCs prima elettroporazione. </li><li> Impostare il sistema di elettroporazione per il programma specifico di cellule-tipo per la linea di cellule staminali embrionali umane H9 (programma CB-150). </li><li> Dopo centrifugazione, aspirare il supernatante dal celpellets l. Per un pellet, aggiungere 10 mg del donatore HR come campione di controllo. Per l&#39;altra pellet aggiungere 10 mg del donatore HR, insieme a 5 mg di ogni TALEN (PZT-AAVS1-L1 e PZT-AAVS1-R1) come campione sperimentale. </li><li> Risospendere ogni pellet cellulare in 100 ml di soluzione di trasfezione cellulare primaria P3, e trasferire in una provetta. </li><li> Eseguire la trasfezione e aggiungere immediatamente 500 ml di temperatura ambiente medio E8 ad ogni provetta. </li><li> Trasferire il iPSCs gocce transfettate per un piatto di 10 cm contenente MEF DR4 preparati in fase 5.4. </li><li> Optional: Aggiungere qualche goccia di ciascun esperimento in un pozzetto di un 6-pozzetti membrana basale matrice rivestite se citometria a flusso anaylsis di efficienza di trasfezione è desiderato. </li><li> Ripetere i passaggi da 6,15-6,17 a finire entrambi i campioni. Il giorno seguente, lavare le cellule con DPBS due volte e passare terreno di coltura per NutriStem, che sembra sostenere la cultura iPSC su alimentatori meglio di E8. </li><li> TrAnsient picchi di espressione EGFP da 48 a 72 ore dopo la trasfezione; valutare l&#39;efficienza di trasfezione, se lo desideri. </li></ol> 7. puromicina Selezione iPSCs mirati <ol><li> Inizio selezione puromicina 72 ore dopo la trasfezione quando i iPSCs raggiungono il 70% di confluenza. </li><li> Per NCRM5 iPSCs, iniziare selezione puromicina a 0,5 mg / ml puromicina (1/2 la dose completa) diluito in NutriStem terreno di coltura. La concentrazione ottimale può variare puromicina 0,25-1 mg / MLL per alcune linee IPSC. </li><li> IPSCs cultura in NutriStem + 0,5 mg / ml puromicina per 3 giorni, rinfrescanti medio quotidiano. </li><li> Dopo 3 giorni, aumentare la concentrazione di puromicina a 1 ug / ml. </li><li> IPSCs Cultura inferiore a 1 mg / ml puromicina selezione per altri 7 a 8 giorni, o fino a quando le colonie distinte appaiono abbastanza grande per colonia picking. </li></ol> 8. Colony Picking ed espansione di iPSCs mirate <ol><li> Usa membrana basaleMatrice per rivestire una piastra a 96 pozzetti dispensando 50 ml di soluzione di rivestimento matrice membrana basale (2 mg matrice membrana basale diluito in 12 ml DMEM / F12) in ogni pozzetto. Conservare la piastra a 4 ° C per una notte prima dell&#39;uso. </li><li> Dopo aver lasciato la piastra a matrice rivestita membrana basale a venire a temperatura ambiente, aspirare la matrice membrana basale e versare 100 ml E8 supplementato con 10 micron Y-27632 in ogni pozzetto. </li><li> Inserire un microscopio invertito in una cappa di sicurezza biologica, e inumidire con il 70% EtOH per sterilizzare. </li><li> Estrarre una pipetta Pasteur di vetro su un becco Bunsen per ottenere uno strumento colonia picking ideale che ha un piccolo &quot;gancio&quot; sulla punta. Sterilizzare con il 70% EtOH, e mettere nella cappa ad asciugare. </li><li> Rimuovere il piatto contenente colonie IPSC mirati dal termostato, e collocarle nel cofano sotto il microscopio. </li><li> Scegli iPSCs tracciando un cerchio attorno al confine colonia con lo strumento della colonia di raccolta.</li><li> Utilizzare il &quot;gancio&quot; dell&#39;utensile colonia-picking per raschiare delicatamente e rimuovere la colonia COPSI dalla superficie della piastra. Per le colonie più grandi, disegnando una X con lo strumento della colonia di raccolta al quarto la colonia faciliterà la crescita delle cellule dopo la ri-placcatura. </li><li> Una volta grumi di cellule si staccano e liberamente fluttuante, usare una pipetta P200 impostato a ~ 30 microlitri per raccogliere i iPSCs. Cellule piastra direttamente nella piastra a 96 pozzetti. </li><li> Optional: usare una pipetta P20 impostato ~ 5 ml di raccogliere i iPSCs in un tubo eppendorf, quindi aggiungere 50 ml delicato cellule dissociazione reagente da digerire per 5 minuti a 37 ° C. Dopo la digestione, aggiungere 500 microlitri E8 medie nel tubo eppendorf per diluire la delicata cellule dissociazione reagente e centrifugare le cellule a 200 xg in una microcentrifuga da tavolo standard per 5 min. Poi Aspirare la maggior parte dei media e lasciare ~ 30 microlitri di riattivare e trasferire le cellule nella piastra a 96 pozzetti. NOTA: questoapproccio faciliterà la dissociazione del gruppo di cellule e rapida espansione della colonia raccolti. </li><li> Continuare colonia prelievo prima di aver raccolto un numero sufficiente di colonie IPSC (circa 20-30 colonie per esperimento è raccomandato). </li><li> Dopo colonia picking, posizionare la piastra a 96 pozzetti in un incubatore di notte. Refresh con terreno completo E8 il giorno seguente, e la cultura fino ~ 70% confluenti. </li><li> Cellule passaggio dal 96 pozzetti in un 24-ben, poi in un 6-bene, come descritto nei passaggi 4,5-4,10. NOTA: i volumi di soluzione EDTA e E8 medie dovrebbero essere proporzionalmente ridotti usando dei pozzi più piccoli di un 6-pozzetti. </li><li> Valutare il targeting successo giunzione PCR e Southern blot per confermare l&#39;integrazione cassette mirata e l&#39;assenza di vettori inseriti in modo casuale 16. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Le fasi più critiche per il successo generazione di AAVS1 esente mirati iPSCs umani sono: (1) efficiente di Talen e donatori plasmidi in iPSCs by trasfezione; (2) ottimizzare dissociazione di iPSCs nelle singole cellule prima trasfezione e placcatura densità dopo trasfezione; (3) ottimizzare dose ed il tempo di farmaco-selezione basata sulla crescita della linea COPSI; (4) dissezionare con cura e raccolta colonie mirate e trasferimento alla nuova piastra / bene. Rispetto ai metodi simili impiegati per la carta di Hockem...

La possibilità di riprogrammare le cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte cellule simil-staminali embrionali (iPSCs) fu scoperto da Takahashi et al., Nel 2007 1. Fibroblasti dermici umani trasdotte con retrovirus che esprime quattro fattori di trascrizione (Il Yamanaka così soprannominato Fattori Oct3 / 4, Sox2, c-Myc e Klf4) hanno mostrato di essere molto simili alle cellule staminali embrionali umane (hESC) basati sulla morfologia, la proliferazione, l&#39;espressione genica, e lo stato epigenetico; cruciale, iPSCs sono anche in grado di differenziarsi in cellule di tutti e tre i foglietti embrionali 1. Il potenziale proliferativo e la differenziazione della capacità di iPSCs li rende strumenti molto interessanti; riprogrammando cellule di pazienti affetti da malattie specifiche, iPSCs possono essere utilizzati sia come sistemi modello in vitro di malattia e come potenziali terapie. Per quest&#39;ultimo scopo, diverse questioni devono essere affrontate prima che il pieno potenziale di iPSCsin un ambiente clinico può essere realizzato; il potenziale oncogeno di hESC coltivate in vitro e iPSCs, l&#39;uso di derivati ​​xenogeniche durante la riprogrammazione e la manutenzione delle cellule, e la necessità di tenere traccia di cellule trapiantate in vivo sono tutti ostacoli cruciali per l&#39;applicazione clinica delle cellule staminali pluripotenti (Inviato da Hentze et al. 2). Una soluzione ideale per la necessità di monitoraggio cellule differenziate post-trapianto comporterebbe un marcatore visivamente rilevabile che resiste tacere e variegatura indipendentemente dall&#39;applicazione. Espressione robusta e sostenuta di transgeni integrati è più facilmente realizzabile quando il DNA esogeno viene introdotto in porto sicuro loci; cioè, i siti genomici che consentono sufficienti trascrizione di un vettore integrato mentre allo stesso tempo mitigare perturbazioni di espressione in geni vicini 3. Uno di questi siti che è stato molto ben caratterizzati dalla sua scoperta è il virus integr adeno-associatosito zione 1 (AAVS1), nel primo introne della proteina fosfatasi 1 subunità 12C regolamentazione (PPP1R12C) gene. Questo locus è stato dimostrato non solo di permettere sostenuta e robusta espressione dei transgeni integrati attraverso il tempo prolungato nella cultura e nella differenziazione vitro 3, ma anche per proteggere i geni di perturbazione trascrizionale 4 circostante; entrambe le funzioni si pensa sia dovuto alla presenza di elementi endogeni isolante cromatina che fiancheggiano il sito AAVS1 5. Advances in strumenti di ingegneria del genoma sul proprio nell&#39;ultimo decennio hanno notevolmente facilitato la facilità e l&#39;efficienza con cui le manipolazioni genetiche in qualsiasi tipo di cellula possono essere raggiunti. Mentre i primi esperimenti riusciti invocati estremamente bassi livelli di endogena ricombinazione omologa (HR) con un donatore introdotte per ottenere gene targeting in CES 6,7, l&#39;uso di nucleasi sito-specifiche, quali nucleasi dita di zinco (ZFNs), che signi, significativamente indurre ricombinazione omologa attraverso la generazione di un doppio filamento rottura del DNA ha notevolmente aumentato l&#39;efficienza di tali esperimenti 8,9. La riproposizione di entrambi trascrizione attivatore come effettori (racconti) di pianta patogeno xanthomonas generi e le procariote cluster brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallati (CRISPR) Sistema / Cas9 in efficienti nucleasi progettista site specific ha fatto gene targeting nelle cellule staminali pluripotenti un accessibile e metodologia possibile 10-13. Un recente ha descritto un metodo efficace per l&#39;integrazione stabile di una cassetta reporter fluorescente verde nel AAVS1 porto sicuro locus in iPSCs umani con nucleasi Tale (Talens) 14. Questi iPSCs mirati hanno mantenuto la loro fluorescenza, anche dopo la differenziazione diretta a cardiomiociti e il trapianto in un modello murino di infarto del miocardio (MI), che fornisce una forte evidenza per l&#39;utilità di talestabilmente pluripotenti fluorescente cellule staminali 14. Per ottenere colonie mirati, un metodo gene-trap è stato usato cui un splicing-accettore (SA), 2A sequenza peptidica auto-scissione colloca la puromicina N-acetil-transferasi (PAC) gene sotto il controllo del promotore PPP1R12C endogena; quindi, solo iPSCs che hanno incorporato il donatore DNA a livello del locus AAVS1 esprimono PAC, rendendoli selezionabili in base puromicina-resistenza; (Figura 1, 15). Dettagli Questo protocollo le procedure di generare AAVS1-GFP iPSCs segnalato nel recente documento 14, tra cui il processo di trasfettando iPSCs con Talens e 9,8 kb donatori di integrare un frammento di 4.2kb DNA nel locus AAVS1 porto sicuro, selezionando iPSCs basati su puromicina-resistenza, e le colonie di prelievo per l&#39;espansione clonale. Le tecniche qui descritte possono essere applicate a vari esperimenti di ingegneria genoma.

<table><tbody><tr><td>Matrice della membrana basale Matrigel con fattore di crescita ridotto (GFR), *Senza LDEV, 10 ml</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Negozio a 4 °C.</td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear Piastre a pozzetti multipli trattate con TC</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Tecnologie</td> per <td>la media durata</td><td>A1517001</td><td>Conservare il terreno basale a 4 °C. Conservare l'integratore a -20 °C.</td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Conservare a temperatura ambiente. Una volta disciolto in H2O, conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Piatto di coltura trattato</td><td>TC Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>DR4 MEF 2M IRR - Academic</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6204G</td><td>Conservare in azoto liquido.</td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, piruvato</td><td>Life Technologies</td><td>11995-040</td><td>Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino definito, origine statunitense</td><td>HyClone</td><td>SH30070.03</td><td>Conservare a -20 &deg;C. Scongelare a 4 &deg; C durante la notte e aliquota. Conservare le aliquote a -20 &deg; C fino al momento del bisogno.</td></tr>Soluzione <tr><td>di aminoacidi non essenziali MEM (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>Unità centrale 4D-Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001B</td><td>parte del sistema di elettroporazione</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X unit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001X</td><td>parte del sistema di elettroporazione</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>All'arrivo, rimuovere la soluzione di cella primaria e integrare e conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Reagente per dissociazione cellulare</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>conservare a -20 °C. Scongelare durante la notte a 4 °C; C e scaldare un'aliquota in un 37 &deg; C bagnomaria prima dell'uso.</td></tr><tr><td>NutriStem XF/FF Coltura Medium</td><td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td>Conservare a -20 &deg;C. Scongelare durante la notte a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>AAVS1 TALENI (pZT-AAVS1-L1 e pZT-AAVS1-R1)</td><td>Addgene</td><td>52637 e 52638</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-EGFP Donatore di ricombinazione omologa</td><td>Addgene</td><td>22212</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina dicloridrato</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>Conservare a -20 &deg;C. Preparare aliquote di lavoro di 1 mg/ml in ddH2O.</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur monouso in vetro borosilicato</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR (refrigerate), 120 V 60 Hz</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-004-521</td><td></td></tr><tr><td>TX-750 4 volte 750 ml Rotore a secchio oscillante</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di tripano blu, 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

transfection, selezione, e colonia-picking di cellule staminali umane pluripotenti indotte talen-mirati con gene gfp nel aavs1 safe harbor

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

L'aggiunta mirata di transgeni può fornire un'espressione genica persistente eludendo il silenziamento genico e la mutagenesi inserzionale causata dall'integrazione casuale mediata da vettori virali. Questo protocollo descrive una piattaforma universale ed efficiente per l'aggiunta mirata di transgeni nelle iPSC umane basata sull'utilizzo di TALEN open-source convalidati e di un donatore simile a una trappola genica per fornire transgeni in un locus di approdo sicuro. È importante sottolineare che l'editing genetico efficace è limitato dall'efficienza di consegna dei vettori di editing genetico. Pertanto, questo protocollo si concentra innanzitutto sulla preparazione di iPSC per la trasfezione per ottenere un'elevata efficienza di consegna nucleare. Quando le iPSC vengono dissociate in singole cellule utilizzando un reagente di dissociazione cellulare delicato e trasfettate utilizzando un programma ottimizzato, il >50% delle cellule può essere indotto ad assorbire i grandi vettori di editing genetico. Poiché il locus AAVS1 si trova nell'introne di un gene attivo (PPP1R12C), è stato utilizzato un gene resistente alla puromicina (PAC) legato all'accettore di splicing (SA) per selezionare iPSC mirate, escludendo le cellule di sola integrazione casuale e non trasfettate. Questa strategia aumenta notevolmente la possibilità di ottenere cloni mirati e può essere utilizzata anche in altri esperimenti di targeting genico attivo. Due settimane dopo la selezione della puromicina alla dose aggiustata per la linea iPSC specifica, i cloni sono pronti per essere prelevati mediante dissezione manuale di grandi colonie isolate in pezzi più piccoli che vengono trasferiti in terreno fresco in un pozzetto più piccolo per un'ulteriore espansione e screening genetico e funzionale. È possibile seguire questo protocollo per ottenere facilmente più linee di iPSC reporter GFP utili per l'imaging in vivo e in vitro e l'isolamento cellulare.

Una visualizzazione del protocollo è fornita in figura 2, con i periodi durante i quali iPSCs sono coltivate in mezzo diverso evidenziata da una verde per E8 o blu per NutriStem. E &#39;importante per trasfettare solo iPSCs di alta qualità; esaminare piatti della cultura in tutta la manutenzione ordinaria e verificare che le culture IPSC contengono colonie principalmente distinti recanti una morfologia ciottoli-simile (Figura 3A); cellule differenziate non dovrebbe occupare più del 10% ...

L'editing genetico mediato da TALEN presso il locus AAVS1 consente l'aggiunta di transgeni ad alta efficienza nelle iPSC umane. Questo protocollo descrive le procedure per la preparazione delle iPSC per la somministrazione di TALEN e del vettore donatore, la trasfezione delle iPSC e la selezione e l'isolamento di cloni di iPSC per ottenere un'integrazione mirata di un gene GFP per generare linee reporter.

Transfection, selezione, e Colonia-picking di cellule staminali umane pluripotenti indotte TALEN-mirati con Gene GFP nel AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un isolato AA vs un sito sicuro, cloni di cellule staminali pluripotenti indotte o IPSC mirati ed esprimenti GFP. Questo risultato si ottiene innanzitutto trasferendo in modo efficiente nei IPC i plasmidi donatori AAVs one talons e A VS one C-A-G-E-G-F-P mediante nucleofezione. Nel secondo passaggio, le cellule mirate A a vs one vengono selezionate mediante puromicina su cellule di supporto embrionali murine.Successivamente, le singole linee cellulari clonali di A A VS uno che esprimono GFP vengono isolate e trasferite in una piastra da 96 pozzetti rivestita con matrigel. Nell'ultima fase, le linee cellulari clonali di A A VS uno G-F-P-I-P-S-C vengono espanse utilizzando il mezzo E otto e tecniche di coltura standard per cellule staminali pluripotenti indotte. Infine, mediante microscopia a fluorescenza immunologica e citometria a flusso si dimostra un'espressione uniforme e robusta di GFP nelle linee cellulari clonali umane di A A VS uno modificate geneticamente.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi di selezione delle colonie implicano la microdissezione di cloni mirati mediante l'uso di strumenti speciali per il prelievo delle colonie al microscopio, un'operazione difficile da apprendere durante un'instruzione affiancata. Iniziare lavando le colture di IPSC una volta con PBS. Quindi aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione cellulare delicato a 37 gradi Celsius in ogni pozzetto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti, quando più del 50% delle cellule si è dissociato dal contenitore di coltura.Utilizzare una pipetta P1000 per interrompere meccanicamente eventuali grumi cellulari residui o cellule aderenti. Quindi aggiungere due millilitri di mezzo E8 in ogni pozzetto e utilizzare una pipetta da 10 millilitri per ulteriormente disgregare le colture in sospensioni cellulari singole. Raccogliere ora le cellule in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugarle.Sospendere nuovamente il pellet in una quantità minima di mezzo E otto per il conteggio. Successivamente, dopo aver confermato la vitalità delle colture mediante esclusione del trian blu, nonché la loro adeguata dissociazione, trasferire 3 milioni di cellule in ciascuno di due tubi conici da 15 millilitri, mentre le cellule vengono centrifugate, impostare il sistema di elettroporazione sul programma specifico per tipo cellulare destinato alla linea di cellule staminali embrionali umane H nove. Quindi aggiungere 10 microgrammi del donatore di ricombinazione omologa, da solo, a un pellet per il campione di controllo e 10 microgrammi del plasmide donatore di ricombinazione omologa, insieme a cinque microgrammi di ciascun plasmide talon, per il campione sperimentale.Successivamente, aggiungere 100 microlitri di soluzione di trasfezione primaria completa P3 a temperatura ambiente a ciascun pellet di controllo e sperimentale e risospendere le cellule. Trasferire i campioni in singole cuvette e procedere immediatamente alla trasfezione. Aggiungere 500 microlitri di mezzo E8 a temperatura ambiente a ciascuna cuvetta, quindi trasferire le cellule staminali pluripotenti indotte trasfettate, goccia a goccia, in singole piastre da 10 centimetri contenenti fibroblasti embrionali di topo DR4. Prima di isolare le colonie, rivestire ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con 50 microlitri di soluzione di matrice della membrana basale e quindi conservare la piastra tutta la notte a quattro gradi Celsius; il mattino seguente procedere con le operazioni successive.Quando la piastra ha raggiunto la temperatura ambiente, aspirare la soluzione in eccesso e aggiungere in ogni pozzetto 100 microlitri di mezzo E eight integrato con 10 micromolar di Y 2 7 6 3 2. Successivamente, posizionare un microscopio invertito all'interno di una cappa biologica e sterilizzarlo con un leggero nebulizzazione di etanolo al 70%. Quindi, posizionare una pipetta di vetro di Pasteur sopra un becco di Bunsen per creare uno strumento per il prelievo di colonie, dotato di un minuscolo gancio alla punta, dopo averla sterilizzata con etanolo al 70%.Posizionare il gancio nella cappa per farlo asciugare, quindi posizionare la coltura IPSE sul palchetto del microscopio per selezionare le colonie. Individuare una colonia adatta a basso ingrandimento e utilizzare lo strumento per il prelievo delle colonie per delimitarla e dividerla in quarti. Successivamente, raschiare delicatamente la colonia divisa in quarti dal contenitore di coltura ed utilizzare una pipetta P200 regolata a circa 30 microlitri per raccogliere gli IPC in libera sospensione, seminando direttamente le cellule sulla matrice della membrana basale.Mentre vengono raccolti, gli IPC dovrebbero attaccarsi entro due-quattro ore dalla semina. Infine, incubare le colonie selezionate durante la notte a 37 gradi Celsius e rinnovare il mezzo con mezzo E otto completo la mattina seguente. È importante trasfettare solo I PSC di alta qualità durante tutto l'esperimento.Le colture di IPSC dovrebbero contenere principalmente colonie distinte con una morfologia simile a ciottoli, come le cellule mostrate qui, e le cellule differenziate non dovrebbero superare il 10% della coltura. L'efficienza di trasfezione degli IPC può essere valutata e ottimizzata utilizzando il piccolo vettore PAX GFP, poiché la trasfezione con PAX GFP rappresenta tipicamente l'efficienza massima ottenibile grazie alle sue ridotte dimensioni. L'espressione transitoria di A VS one C-A-G-E-G-F-P intel negli IPC trasfettati raggiunge il picco tra le 48 e le 72 ore dopo la trasfezione, il che può essere confermato mediante citometria a flusso su una piccola porzione di cellule trasfettate. L'efficienza di trasfezione può variare notevolmente.Anche negli esperimenti con A, la frazione positiva per GFP è solo del 10%. Le singole colonie che mostrano una fluorescenza uniforme dovrebbero essere abbastanza grandi da permettere il prelievo delle colonie dopo la selezione con pureomicina. Inoltre, una volta passate al formato a 96 pozzetti, le colonie di iPSC bersaglio espanse dovrebbero mostrare un'espressione stabile e uniforme di GFP. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come trasfettare in modo efficiente le iPSC mediante affezione nucleare e di come isolare il sito sicuro AV1.Cloni IPSE mirati utilizzando strumenti per la selezione di colonie.

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Nonostante i recenti progressi nella modificazione genetica, trasfezione di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimane un processo capriccioso. A nostra conoscenza, metodi sistematici ed efficiente per trasfettare umani cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) non sono stati segnalati. Qui, descriviamo i protocolli affidabili per trasfettare in modo efficiente e nucleofect iPSCs umani.

Trasfettando e Nucleofecting umani cellule staminali pluripotenti indotte

Vi presentiamo un protocollo efficace per la riprogrammazione di cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) che utilizzano vettori retrovirali codificanti Oct3 / 4, Sox2, Klf4 e c-myc (OSKM) e l'individuazione di hiPSC correttamente riprogrammata mediante colorazione dal vivo con Tra- 1-81 anticorpo.

Selezione e isolamento di colonie di cellule pluripotenti indotte umane staminali riprogrammato da fibroblasti adulti

Qui mostriamo un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs umani da 3-4 ml di sangue periferico utilizzando un singolo vettore lentivirale riprogrammazione. La riprogrammazione delle cellule del sangue prontamente disponibili promette di accelerare l'utilizzo della tecnologia iPSC rendendola accessibile ad una comunità di ricerca più ampio.

Generazione di cellule pluripotenti indotte umane staminali da sangue periferico mediante il STEMCCA lentivirale Vector

Questo video descrive una precisa tecnica di editing del genoma in cellule staminali pluripotenti indotte umane, o hiPSC, utilizzando TALEN per creare rotture a doppio filamento in un locus mirato, inducendo la riparazione diretta dall'omologia per l'integrazione genica della proteina di fluorescenza.

Integrazione genica mirata mediata da TALEN: utilizzo di nucleasi specifiche per sequenza ingegnerizzate per l'inserimento preciso del gene della proteina fluorescente nelle hiPSC

Descriviamo un protocollo per la derivazione di cellule staminali pluripotenti umane indotte prive di fattori riprogrammate e caratterizzate su base lentivirale e la conversione in condizioni cliniche putative.

Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade

L'editing del genoma delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) può essere fatto in modo rapido ed efficiente. Qui viene presentata una robusta procedura sperimentale per l'ingegneria genetica delle hPSC, come esemplificato dalla modifica del locus safe harbor AAVS1 per esprimere EGFP e introdurre resistenza agli antibiotici.

Istituzione di Genome-cura pluripotenti umane Linee di cellule staminali: Da Targeting per isolamento

Qui riportiamo un metodo di modifica genetica rapida ed efficiente in base RMCE nel locus AAVS1 di umani cellule staminali pluripotenti (hPSCs) che migliora i sistemi precedentemente descritti. Usando questa tecnica, linee isogeniche possono essere rapidamente e affidabile generati per adeguati studi comparativi, facilitando la ricerca transgenesi mediata con hPSCs.

Generazione rapida ed efficace delle ricombinante cellule staminali umane pluripotenti da ricombinasi mediata scambio Cassette in<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Descritto qui è un protocollo per l'etichettatura in modo endogeno espresse proteine con tag fluorescente in cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando CRISPR/Cas9. Celle putativamente modificate sono arricchite da ordinamento di attivate la fluorescenza delle cellule e linee clonali della cellula vengono generate.

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'editing genetico senza soluzione di continuità nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un plasmide donatore basato su piggyBac e il mutante nickase Cas9. Due mutazioni puntiformi sono state introdotte nell'esone 8 del locus del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti nelle cellule staminali embrionali umane (hESC).

Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

Nuove strategie per modellare fedelmente le mutazioni somatiche nelle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) sono necessarie per studiare meglio la biologia delle cellule staminali ematopoietiche e le neoplasie ematologiche. Qui, viene descritto un protocollo per modellare mutazioni eterozigoti con guadagno di funzione nelle HSPC combinando l'uso di CRISPR / Cas9 e la doppia trasduzione del donatore rAAV.

Ingegnerizzazione di mutazioni oncogeniche eterozigoti con guadagno di funzione in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane

Impara l'editing genico TALEN nel locus AAVS1 di cellule staminali pluripotenti umane indotte. Questo protocollo permette l'integrazione mirata del gene GFP e la selezione di cloni stabili per la ricerca.

Transfection, selezione, e Colonia-picking di cellule staminali umane pluripotenti indotte TALEN-mirati con Gene GFP nel AAVS1 Safe Harbor (Video) | JoVE Journal

Transfection, selezione, e Colonia-picking di cellule staminali umane pluripotenti indotte TALEN-mirati con Gene GFP nel AAVS1 Safe Harbor

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