Name: Indagare Mast Cellula secretoria Granuli; dal Biosintesi a Esocitosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: Scopri i meccanismi di esocitosi e sviluppo dei granuli secretori nei mastociti utilizzando geni reporter fluorescenti e imaging confocale. Questo metodo consente analisi morfometriche quantitative in tempo reale.

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Ringraziamo il Dr. U. Ashery per il dono di NPY-MRFP cDNA. Ringraziamo Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, e Y. Zilberstein per la preziosa assistenza di microscopia e analisi dell&#39;immagine. Ringraziamo anche il Dr. Joseph Orly per la lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Israel Science Foundation, fondata dall&#39;Accademia di Israele per le Scienze (1139-1112 di RS-E.).

1. Preparazione di RBL Cellulari Media Cultura <ol><li> Mescolare 500 ml di mezzo modificato Eagle glucosio basso di Dulbecco (DMEM) con 56 ml di siero fetale bovino (questo fa 10% FBS), e poi aggiungere 5,5 ml di penicillina streptomicina (questo fa ~ 1% PEST). </li><li> Filtrare il mezzo utilizzando 500-1000 ml Bottle-Top Filtri vuoto con 0,22 micron dimensione dei pori e conservare a 4 ° C. </li></ol> 2. coltura di cellule RBL <ol><li> Grow cellule RBL in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 a 37 ° C sia in lastre o flaconi. Cellule RBL che stanno crescendo in 10 centimetri piastre devono essere integrati con 10 ml di media e formano monostrato confluente di ~ 10 7 cellule / piastra. </li><li> Quando lo strato di cellule si avvicina confluenza, replate la coltura ad una densità inferiore. <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra / beuta usando una pipetta pasteur sterile collegata al vuoto. </li><li> Sciacquare il monostrato cellulare con preriscaldata (37° C) 0,25% tripsina / EDTA che copre tutta monostrato (il volume dipende dalle dimensioni della piastra di coltura / beuta; 2 ml da 10 cm Piatto). Ciò staccare le cellule. </li><li> In alternativa, lavare il monostrato cellulare con tampone fosfato (PBS), togliere la PBS e aggiungere preriscaldata (37 ° C) tripsina / EDTA. Questo passaggio stacca le cellule più veloce. </li><li> Posizionare la piastra / beuta in un incubatore a 37 ° C (non più di 10 min). </li><li> Ispezionare le cellule sotto il microscopio ottico per controllare se hanno staccato. Se le cellule non si staccano dopo 10 min, picchiettare delicatamente sulla piastra / fiasco. </li><li> Aggiungere mezzo alla piastra di coltura / beuta di sospendere le cellule (il volume del mezzo deve essere di almeno 2 volte superiore al volume della soluzione di tripsina). </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione per 3 min a 200 ga 25 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in medium. Diluire le cellule 01:10 e seminare in un nuovo piatto cultura. Incubare le cellule per 48-72 ore, fino a quando non REACh circa il 90% di confluenza. </li><li> Ripetete la stessa procedura (sezione 2.2.1-2.2.8) per un massimo di 3 mesi (30 passaggi). </li></ol></li></ol> 3. Preparazione di Transfection media. <ol><li> Preparare una soluzione 100 mM di K-Pipes pH 7, soluzione 1 mM di Ca 2+ acetato e soluzione 100 mM di acetato di Mg 2+. </li><li> Diluire soluzione mM 100 di K-Pipes pH 7 in 20 mM con DMEM media, aggiungere la soluzione 1 mM di Ca 2+ acetato ad una concentrazione finale di 10 mM e 100 mM di soluzione di acetato di Mg 2+ ad una concentrazione finale di 2 mm. </li><li> Pesare glutammato potassio e aggiungere alla soluzione ad una concentrazione finale di 128 mM, mescolare bene e mantenere a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. Mantenere le restanti soluzioni (es., K-Tubi, Ca 2+ acetato, Mg 2+ acetato) a -20 ° C. </li></ol> 4. Trasfezione delle cellule RBL <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra / beuta utilizzando unsterile pipetta pasteur collegata al vuoto. </li><li> Sciacquare il monostrato cellulare con preriscaldata (37 ° C) tripsina / EDTA che dovrebbe coprire l&#39;intero monostrato. Posizionare la piastra / beuta in un incubatore a 37 ° C (non più di 10 min). Controllare se le cellule hanno staccato con il microscopio ottico. </li><li> Aggiungere mezzo alla piastra di coltura / beuta di sospendere le cellule (il volume dei media dovrebbe essere di almeno 2-grande più del volume della soluzione tripsina). </li><li> Contare il numero di cellulare utilizzando emocitometro. </li><li> Pellet 1,5 × 10 7 cellule mediante centrifugazione per 3 min a 200 xg a 25 ° C. Eliminare il surnatante e aggiungere 280 ml di media trasfezione. Trasferire la miscela di reazione in 4 millimetri cuvetta. </li><li> Aggiungere 20 mg di NPY-MRFP plasmide e uno di 30 microgrammi di plasmide di controllo vuota o un plasmide testato. Il volume finale della miscela di reazione deve essere di 300 microlitri. </li><li> Porre immediatamente in ghiaccio per 10 min. Pulire la cuvetta dall&#39;acqua residua e proceed di elettroporazione a 300 V per 9 msec. </li><li> Per le misure di esocitosi, replate immediatamente le cellule in 24 e piastre di coltura dei tessuti contenenti 300 ml di media. Aggiungere 8 ml di miscela di reazione (4 × 10 5 cellule) a ciascun pozzetto. Aggiungi cellule 4 × 10 5 non trasfettate per pozzi addizionali per il controllo. Preparare sufficienti pozzetti per avere almeno pozzetti duplicati per ogni trattamento per ogni trasfezione. </li><li> Per la microscopia lasso di tempo, replate immediatamente le cellule in un sistema coverglass borosilicato camera 8-pozzetti contenenti 80 microlitri di media. Aggiungere 1,5 ml di miscela di reazione (7,5 × 10 4 cellule) per ciascuna camera. (Prova per evitare di utilizzare le camere a bordo del coprioggetti, le camere al centro della coprioggetti sono più facili da immagine). NOTA: È importante sottolineare che non tutte le cellule di risposta a un trigger e, occasionalmente, la microscopia time-lapse è abrogata a causa della perdita di concentrazione e deriva della borosi camera 8-benesistema coprioggetti licate. Pertanto, preparare almeno 8 camere per ogni trattamento per ogni trasfezione. </li><li> Per sensibilizzare le cellule per FcεRI attivazione mediata, aggiungere 1 mg / ml di topo DNP monoclonale specifico IgE ai media (incubare le cellule con IgE per almeno 2 ore). </li><li> Dopo 18-24 ore di utilizzare un microscopio a fluorescenza per confermare che le cellule esprimono i plasmidi. I eccitazione e di emissione di fluorescenza MRFP sono: λEx 584, λEm 607 nm. NPY-MRFP dovrebbe apparire in strutture vescicolari che corrispondono ai SG. Se il secondo gene di interesse è fuso a un tag fluorescente utilizzare un microscopio a fluorescenza per confermare la co-espressione di due plasmidi alle stesse cellule. Ad esempio, se il gene testato è fuso con GFP, le lunghezze d&#39;onda di eccitazione ed emissione di fluorescenza GFP sono: λEx 488, λEm 507 nm. La proteina GFP tag dovrebbe apparire le stesse cellule che esprimono NPY-MRFP. </li><li> Per misure esocitosi procedere to punto 5 e per la microscopia lasso di tempo, procedere al punto 6. </li></ol> 5. Misura NPY-MRFP Esocitosi <ol><li> Preparazione del tampone di Tyrode: <ol><li> Preparare una soluzione di 54 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 2.74 M NaCl e 8 mm NaH 2 PO 4 in DDW. Mescolare bene e conservare a 4 ° C. Questo passo è per la preparazione di 20x tampone Tyrode. </li><li> Preparare una soluzione di 20 mM Hepes pH 7, 1.8 mM CaCl 2, 1 mg / ml BSA, 5.6 mM glucosio e da 1 a 20 diluizione Tyrode 20x in DDW e mescolare bene. Questo passo è per la preparazione di 1x tampone Tyrode. </li><li> Aliquota del buffer 1x Tyrode e conservare a -20 ° C. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. </li></ol></li><li> Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra 24 pozzetti e lavare 3 volte con tampone di Tyrode. Preparare le cellule stimolate con l&#39;aggiunta di 200 microlitri di buffer Tyrode per controllare i pozzi. </li><li> Preparare 10 ml / pozzetto di 20X concentrata attivazione reagente [(ad esempio 1.000 ng / ml DNP-BSA o DNP-HSA (Ag), 200 mM Ca 2+ ionoforo (A23187 esempio), e una combinazione di 20 mM Ca 2+ ionoforo e 1000 nM 12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetato (TPA)]. Se i reagenti sono conservati in DMSO, diluire i reagenti in 20x concentrazione in tampone di Tyrode contenente 1% DMSO. Incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Rimuovere il surnatante di ciascun pozzetto con attenzione ad una piastra da 96 pozzetti, disporli sul ghiaccio ed evitare dalla luce. (I surnatanti contengono il peptide chimerico NPY-MRFP che è stato rilasciato dalle cellule). </li><li> Aggiungere 200 microlitri tampone di Tyrode contenente 0,5% Triton X-100 in ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C per 10 min. (Questo passaggio è importante per la preparazione di lisati cellulari contenenti la restante NPY-MRFP che non è stato rilasciato dalle cellule). Raccogliere i lisati cellulari e versare in un piatto ben 96, disporli sul ghiaccio e di evitare la luce. </li><li> Misurare la fluorescenza dei supernatanti cellulari e lisati cellulari utilizzando un flza lettore di piastra, con un 590-, 20 nm di larghezza di banda di eccitazione filtro e 635-filtro emissione di larghezza di banda di 35 nm. </li><li> Calcolare la percentuale di NPY-MRFP rilasciato: NOTA: La misura lettore di fluorescenza unità fluorescenza arbitrarie (AFU). AFU valori dipendono dalla macchina e la sua sensibilità e l&#39;efficienza di trasfezione. <ol><li> Impostare l&#39;autofluorescenza delle cellule RBL nontransfected come vuoti. Dividere il AFU di ogni surnatante alla fluorescenza totale (AFU dei surnatanti + AFU della corrispondente lisato) e moltiplicare per 100. </li></ol></li></ol> 6. Time-lapse Microscopia di Esocitosi <ol><li> Seed 7.5 × 10 4 della transfettate cellule / camera in un sistema coprioggetti borosilicato camera 8 pozzetti. Dopo 18-24 ore, rimuovere il terreno di coltura dalle camere e lavare 3 volte con tampone di Tyrode </li><li> Aggiungere 72 ml di tampone di Tyrode per ciascuna camera. Diluire i reagenti attivanti nel buffer Tyrode a 10x concentrazione. </li> &lt;li&gt; Utilizzare un microscopio a fluorescenza confocale dotato di una camera riscaldata (37 ° C) e CO 2 di controllo (4,8%) e un obiettivo 40X o 63X. Accendere i sistemi microscopio: lampada al mercurio, computer, e laser. Assicurarsi che la camera riscaldata è alla giusta temperatura prima di avviare l&#39;esperimento. </li><li> Posizionare la camera nella camera riscaldata e assicurarsi che la camera sia installato correttamente e stabile. </li><li> Accendere la luce di fluorescenza secondo il fluoroforo pertinente e visualizzare le cellule transfettate. Spegnere fluorescenza volta una cellula di interesse nel settore al fine di minimizzare il candeggio e citotossicità. È importante che questo campo conterrà circa 2-3 cellule trasfettate. Le cellule transfettate devono essere ben distribuite ma non si toccano. </li><li> Regolare la potenza del laser (a seconda del microscopio) per ridurre il rumore e sovrasaturazione nonché la tossicità, e impostare il guadagno e offset per modificare il rapporto segnale-rumore. Scansione veloce oder per minimizzare la durata di esposizione laser (media 2). </li><li> Regolare le dimensioni pinhole ad un massimo, questo consente diminuendo la potenza del laser e mantenere immagini focalizzate per un lungo periodo di tempo. Se lo si desidera, impostare i parametri per lo stack Z per ricostruire l&#39;immagine tridimensionale, regolare la dimensione foro stenopeico di 1 unità arioso (AU), che dà il meglio rapporto segnale rumore e acquisire la scansione successiva di bidimensionali fette ottica confocale in -axes z con fette ottici ≤0.7 micron. </li><li> Impostare l&#39;intervallo di tempo tra ogni acquisizione di 15-30 sec e la durata totale di acquisizione per 15 min e cominciare ad acquisire immagini. Dopo 5 minuti di pausa acquisizione della serie storica. Aggiungere 8 ml di trigger 10x e continuare immediatamente l&#39;acquisizione. </li><li> Salvare le immagini, eseguire deconvoluzione utilizzando un software deconvoluzione e ricostruire le pile di immagini tridimensionali e di un filmato utilizzando software Imaris. </li></ol><ol><li> Importare i dati dalle immagini della serie tempo deconvoluto che sono stati ottenuti con il microscopio confocale a software Imaris. Questo software legge più di 40 file microscopia. Se il software non è in grado di leggere i file; convertire i file in file TIF e di importazione. </li><li> Per aggiungere punti di tempo alla fine di una serie di dati aperta premete Modifica -&gt; Aggiungi Punti Tempo e importare i nuovi set di dati. </li><li> Creare la superficie del canale MRFP usando l&#39;opzione wizard di superficie. Scegliere l&#39;algoritmo di default. Scegliere il canale di NPY-MRFP. Segnare l&#39;opzione smoothing per ridurre il rumore. Per evitare la perdita di piccoli dettagli riducono livello dell&#39;area dettaglio 0,05 micron. </li><li> Impostare la soglia di intensità. Viene visualizzato Nuovo superficie grigia. Vai su &quot;Impostazioni&quot; e cambiare lo stile da &quot;Punto centrale&quot; a &quot;Surface&quot;. </li><li> Vai alla scheda statistica nelle proprietà dell&#39;oggetto selezionato, selezionare la scheda dettagliata e il valore specifico such come intensità di fluorescenza, volume, ecc </li><li> Rivedere i dati e verificare che i valori siano compatibili con le immagini. Per esempio, due o più granuli adiacenti possono essere misurate come uno granello grande. Per quantificare la dimensione media dei granuli dividere la dimensione dei granuli uniti al numero effettivo di granuli. </li><li> Esportare i set di dati desiderati in file Excel e analizzare i dati. </li></ol> f

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Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari.

Descriviamo una strategia innovativa che combina la quantificazione di MCs esocitosi e quattro (x, y, z, t) quantificazioni dimensione da immagini tridimensionali e ritardi delle SG in cellule viventi con un gene reporter per esocitosi. Questa tecnica consente proiezione di famiglie di proteine ​​per il loro impatto sulla funzione MC come SGs monitoraggio inizio già a loro uscita dal Golgi attraverso la loro maturazione, acquisizione di competenze esocitosi e degranulazione. La combinazione di misure di esocitosi insiem...

Mastociti (MC) sono cellule immunitarie che sono più noti per il loro coinvolgimento nelle reazioni allergiche e infiammatorie come l&#39;artrite, l&#39;asma, esofagite eosinofila, dermatite cronica e shock anafilattico 1,2 così come altre patologie tra cui la malattia coronarica e 3,5 cancro 3,4. Inoltre, MCs svolgono un ruolo importante in innata e adattativa, sia in difesa dell&#39;ospite contro i batteri e parassiti e dalla soppressione delle risposte immunitarie, ad esempio inducendo la tolleranza dell&#39;organo trapiantato 5,6. MCs provengono dal midollo osseo, lo sviluppo di CD34 + / CD117 + cellule progenitrici pluripotenti 7. Committed midollo osseo MC progenitori vengono rilasciati nel sangue e migrano nei tessuti periferici localizzative prevalentemente all&#39;interno dei tessuti connettivi e superfici epiteliali 8. Maturazione e differenziazione terminale vengono poi raggiunti sotto l&#39;influenza of citochine all&#39;interno l&#39;ambiente circostante 8,9. MCs possono essere attivati ​​da un allergene (antigene, Ag), il cui incontro portato alla generazione di immunoglobulina E (IgE) tipo anticorpi. Il legame di tale IgE ai recettori FcεRI del MC, seguito da reticolazione di cellula legata IgE upon riesposizione allo stesso Ag, provoca l&#39;aggregazione FcεRI e apertura di una cascata di segnalazione che culmina in degranulazione [recensione in 10,11] . MCs sono attivati, indipendentemente da IgE, da neuropeptidi 5,12, le tossine 13, batterica e antigeni virali 14,15, un numero di peptidi caricati positivamente collettivamente come secretagoghi di base, le cellule immunitarie e citochine 5,13,12,16 , 17. MCs sono anche attivati ​​da molti dei propri mediatori rilasciati, che amplificano ulteriormente la risposta infiammatoria. MCs sono confezionati con granuli di secreto (SGS) che contengono immunomediatori regolamentari, anche amine vasoattive, come l&#39;istamina e la serotonina (in roditori), proteoglicani, proteasi, come chimasi e triptasi, fattore di crescita vascolare endoteliale e diverse citochine e chemochine 8,9. Questi mediatori sono &quot;pronti a partire&quot; e una volta MCs sono attivati ​​da uno stimolo adeguato, questi mediatori vengono rilasciati dalle cellule di esocitosi regolata (degranulazione) in pochi secondi a minuti 18,19. Questo evento iniziale è seguita dalla sintesi de novo e il rilascio di una vasta gamma di sostanze biologicamente potenti, tra metaboliti dell&#39;acido arachidonico, più citochine e chemochine 20,21,22. Rilascio di prodotti di nuova sintesi si verifica indipendentemente dal rilascio SG. Collettivamente, questi mediatori avviare prime e fase tardiva infiammatori e allergici risposte. Pertanto, la comprensione dei meccanismi che rappresentano per l&#39;attivazione e la degranulazione MC sono entrambi di imp teorica e clinicaortance. La difficoltà di manipolare geneticamente MCs primarie e coltivate ha ostacolato i tentativi di chiarire i meccanismi alla base MC degranulazione, che è rimasto mal risolti. Per ovviare a questo problema abbiamo sviluppato un giornalista saggio basato da co-trasfezione linea cellulare della mucosa mast, rat leucemia basofili (RBL) -2H3 (di seguito denominato RBL) o di midollo osseo derivate MCs (BMMCs) 30 con un gene di interesse e neuropeptide Y (NPY) fusa RFP monomero (MRFP), come SG giornalista. NPY è stato precedentemente dimostrato di ricapitolare il comportamento dei marcatori SG endogeni in altri sistemi. Inoltre, perché MRFP fluorescenza è pH insensibile, espressione di NPY-MRFP consente la visualizzazione delle SG acidi e valutazione quantitativa di esocitosi utilizzando piastre da 96 pozzetti e un lettore di fluorescenza. Abbiamo dimostrato che NPY-MRFP viene consegnato al SGS acide delle cellule RBL e BMMCs e viene rilasciato dalle cellulein modo regolato lungo il SG carico endogena (cioè, β-esosaminidasi e serotonina) 30, 32. Questo protocollo fornisce una metodologia di imaging-based ad alta risoluzione che permette di geni di screening di interesse per la loro fenotipica e l&#39;impatto funzionale su caratteristiche SG e degranulazione in cellule RBL 32. In particolare, questo protocollo permette il monitoraggio in tempo reale di MC SGS e quantificazione della loro area o dimensioni del volume, il loro numero, la cinetica di assemblaggio, il loro movimento lungo il citoscheletro cellulare e la loro ultima fusione con la membrana plasmatica in condizioni diverse. Ad esempio, sensibilizzando le cellule con DNP-IgE specifiche e innescando le cellule con un Ag polivalente (DNP coniugato albumina sierica) in diverse perturbazioni (ad esempio, l&#39;abbattimento dei geni di interesse, oltre l&#39;espressione di geni wt o mutanti, o manipolazioni farmacologiche) e confronto alle cellule di controllo.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046-500ML</td><td>Caldo in 37 gradi C bagno d'acqua prima dell'uso</td></tr><tr><td>Fetale Bovino Siero</td><td>GE assistenza sanitaria Scienze della vita</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Tecnologie</td><td></td><td></td>di vita</tr><tr><td>Membrana in acetato di cellulosa, dimensione dei pori 0,22 &nbsp; &mu; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura trattate con coltura tissutale Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina/EDTA (TE)</td><td>Tecnologie di vita</td><td>R001100</td><td>Warm in 37 &deg; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>TUBI sale dipotassico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di calcio idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di magnesio tetraidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-glutammico sale di potassio monoidrato (glutammato di potassio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>4 mm elettroporazione cuvette</td><td>progetti cellulari</td><td>EP-104</td><td></td></tr><tr><td>GENE PULSER CON CONTROLLER DI IMPULSI & CAPACITANCE</td><td>Bio rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass a camera</td><td>Thermo scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>24 pozzetti, fondo piatto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Corning Piastre a 96 pozzetti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3367 o CLS390</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di fluorescenza per piastre a 96 pozzetti - Infinite 200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium ionoforo A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522</td><td>Evitare dall'esposizione diretta alla luce</td></tr><tr><td>12-O-tetradecanoyl-13-acetato (TPA)</td><td>Calbiochem</td><td>P3766</td><td></td></tr><tr><td>anti-DNP monoclonale IgE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNP-BSA/ DNP-HAS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661</td><td>Evitare l'esposizione alla luce diretta</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale fluorescente:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 invertito</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Imaris</td><td>BITLANE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft exel o Prism o altri software</td><td></td><td></td><td></td>di analisi</tr><tr><td>Altri reagenti:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>MERK</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>MERK</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>MERK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>BDH Laboratories</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monosodico&nbsp;</td><td>MERK</td><td>5345</td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td><td></td> sterile</tr></tbody></table>

indagare mast cellula secretoria granuli; dal biosintesi a esocitosi

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mastociti (MC) sono cellule secretorie del sistema immunitario che svolgono le loro funzioni fisiologiche e patologiche rilasciando mediatori allergici, infiammatorie e immunomodulanti preformati e di nuova sintesi. Mediatori MCs &#39;riguardano diversi tessuti e organi che culminano nelle risposte allergiche e immunitarie. La sintesi, lo stoccaggio e il rilascio dei mediatori MC sono altamente regolamentati. I mediatori preformati sono confezionati in granuli secretori citoplasmatici (SG), che si fondono con la membrana plasmatica e rilasciano il loro contenuto per esocitosi regolata. Presentiamo un protocollo, basata sulla co-espressione di un gene di interesse con un gene reporter che si rivolge alla SGS e viene rilasciato in modo regolato fianco dei mediatori endogeni SG. Il protocollo consente di alta risoluzione quattro confocale tridimensionale analisi del MC SGS e il controllo della loro linea temporale dal biogenesi a esocitosi innescato. Così, con questo protocollo per lo screening dei geni di Interest per il loro impatto fenotipica e funzionale permette di decifrare i meccanismi molecolari che regolano la biogenesi e esocitosi del MC SGS e identificare i regolatori coinvolti. In tal modo, dovrebbero essere fornite ulteriori informazioni sui meccanismi cellulari che rappresentano la funzione MCs in salute e malattia.

A causa della bassa efficienza di trasfezione di MC, manipolazioni genetiche è improbabile che lasciare un impatto sulle letture di secrezione media misurate dai mediatori endogeni SGS. Tuttavia, stabilendo completa co-espressione del gene reporter NPY-MRFP e il plasmide co-trasfettato nelle stesse cellule, monitoraggio dei risultati NPY-MRFP nel monitoraggio esclusivamente popolazione cellulare che esprime il gene di interesse. Pertanto, il vantaggio di questo test rispetto ai metodi convenzionali è la capacità di cont...

L&#39;obiettivo del presente protocollo è stato quello di sviluppare un metodo che permetterà analisi di genomica funzionale della secrezione mastociti. Il protocollo si basa sulla valutazione quantitativa del rilascio di un gene reporter fluorescente cotrasfected con il gene di interesse e l&#39;analisi in tempo reale della morfologia del granulo secretorio.

Indagare Mast Cellula secretoria Granuli; dal Biosintesi a Esocitosi

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i meccanismi che regolano lo sviluppo dei granuli secretori e la citosi nei mastociti. Questo viene ottenuto innanzitutto mediante la cotrasfezione dei mastociti con un gene reporter per l'esocitosi, nonché con un gene di interesse. Il secondo passaggio consiste nel valutare l'effetto del gene testato sull'esocitosi stimolando le cellule e monitorando il segnale fluorescente del gene reporter durante l'esocitosi.Successivamente, l'effetto del gene testato sulla generazione e sullo sviluppo dei granuli secretori dei mastociti viene valutato mediante imaging confocale del gene reporter localizzato nei granuli secretori. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire un'analisi morfometrica dei granuli secretori. In definitiva, l'etichettatura fluorescente dei granuli secretori dei mastociti mediante un gene reporter viene utilizzata per evidenziare alterazioni nello sviluppo dei mastociti, dei granuli secretori e nella loro esocitosi.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la misurazione del rilascio di mediatori endogeni, beta-eptasi o istamina, è che si basa sulla co-espressione del gene di interesse insieme a un tipo mutante o S-H-R-N-A e a un marcatore per l'esocitosi. La co-espressione permette quindi di monitorare la secrezione esclusivamente a partire dalle cellule geneticamente modificate, superando così il problema dell'elevato rumore di fondo rispetto al segnale che si verifica quando si misura il rilascio di mediatori endogeni a causa della bassa efficienza di trasfezione dei mastociti, che ostacola l'interpretazione dei risultati. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare dei mastociti, come l'identificazione dei meccanismi molecolari che controllano il processo di formazione dei granuli secretori, inclusa la selezione del carico, l'incapsulamento nei granuli e la loro competenza all'esocitosi.Questo metodo aiuta anche a identificare i meccanismi molecolari che controllano il processo di esocitosi regolata di massa delle cellule, valutando il coinvolgimento di chinasi, fosfatasi e altre famiglie di proteine in questo processo. Per iniziare, preparare cellule di leucemia basofila del ratto e il mezzo di coltura come descritto nel protocollo testuale per eseguire la trasfezione. Per prima cosa, rimuovere il mezzo di coltura dalla piastra utilizzando una pipetta Pasteur sterile collegata a un vuoto.Risciacquare il monostrato cellulare con tripsina preriscaldata, un DTA che copre l'intero monostrato. Collocare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per non più di 10 minuti. Successivamente, verificare se le cellule si sono staccate utilizzando il microscopio ottico.Dopo il distacco, aggiungere mezzo alla piastra di coltura per sospendere le cellule a un volume pari almeno al doppio del volume della soluzione di tripsina. Dopo aver contato il numero di cellule utilizzando un emocitometro, pellettizzare 15 milioni di cellule mediante centrifugazione per tre minuti a 200 ×g e 25 °C. Eliminare il surnatante e aggiungere 280 µL di mezzo di trasfezione.Quindi trasferire la miscela di reazione in un vial da quattro millimetri. Aggiungere 20 microgrammi di plasmide contenente neuropeptide Y-M-R-F-P, noto anche con il nome abbreviato N-P-Y-M-R-F-P, e 30 microgrammi di plasmide controllo vuoto oppure un plasmide sperimentale. Il volume finale della miscela di reazione deve essere di 300 microlitri.Dopo averlo lasciato sul ghiaccio per 10 minuti, asciugare la provetta eliminando l'acqua residua. Procedere quindi all'elettroporazione a 300 volt per nove millisecondi. Per le misurazioni dell'esocitosi, rifornire immediatamente le cellule in piastre per colture cellulari da 24 pozzetti contenenti 300 microlitri di mezzo.Aggiungere otto microlitri della miscela di reazione a ciascun pozzetto. Quindi aggiungere cellule non trasfettate in ulteriori pozzetti come controllo. Preparare un numero sufficiente di pozzetti in modo da avere pozzetti duplicati per ogni trattamento, per ogni trasfezione; per la microscopia a tempo-lapse, rifluire immediatamente le cellule in un sistema a otto pozzetti con camere in vetro coprioggetto di silicato contenente 80 microlitri di mezzo.Aggiungere 1,5 microlitri della miscela di reazione in ogni camera per sensibilizzare le cellule all'attivazione mediata da FC epsilon R uno. Aggiungere un microgrammo per millilitro di IgE monoclonale specifica per DNP di topo al mezzo. Incubare le cellule con IgE per almeno due ore.Dopo 18-24 ore, utilizzare un microscopio a fluorescenza per confermare che le cellule esprimono i plasmidi. L'MRFP ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 584 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 607 nanometri. L'N-P-Y-M-R-F-P dovrebbe apparire in strutture vescicolari corrispondenti ai granuli secretori.Per misurare l'esocitosi di N-P-Y-M-R-F-P, rimuovere il mezzo di coltura. Dalla piastra a 24 pozzetti, lavare tre volte con tampone tyro. Preparare le cellule non stimolate aggiungendo 200 microlitri di tampone tyro nei pozzetti di controllo.Quindi aggiungere i reagenti attivatori e il buffer Tyro diluito prima di incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Trasferire con attenzione i supernatanti S di ogni pozzetto in una piastra a 96 pozzetti. Posizionare la piastra sul ghiaccio e proteggere dalla luce.I supernatanti S contengono il peptide chimerico N-P-Y-M-R-F-P rilasciato dalle cellule. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di buffer tyro contenente lo 0,5% di Triton X-100 in ogni pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Questo passaggio è importante per la preparazione dei lisati cellulari che contengono il peptide N-P-Y-M-R-F-P rimanente non rilasciato dalle cellule.Raccogliere i lisati cellulari e trasferirli in una piastra a 96 pozzetti prima di porla sul ghiaccio. In assenza di luce, misurare la fluorescenza dei supernatanti cellulari e dei lisati cellulari utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza con un filtro di eccitazione di 590 nanometri e larghezza di banda di 20 nanometri e un filtro di emissione di 635 nanometri e larghezza di banda di 35 nanometri. Seminare 1,5 microlitri di cellule transfezionate in un sistema di vetrini coprioggetto in silicato di boro a otto camere.Incubare le cellule per 18-24 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius. Rimuovere il mezzo di coltura dalle camere e lavare tre volte con tampone tiroidale. Quindi aggiungere 72 microlitri di tampone tiroidale in ogni camera.Utilizzare un microscopio a fluorescenza confocale dotato di una camera riscaldata con controllo della concentrazione di anidride carbonica e di un obiettivo 40x o 63x. Accendere i sistemi del microscopio, inclusi la lampada a mercurio, il computer e i laser. Assicurarsi che la temperatura della camera riscaldata sia corretta.Prima di iniziare l'esperimento, posizionare il sistema di camere con otto pozzetti in vetro coprioggetto di silicato all'interno della camera riscaldata e assicurarsi che la camera sia installata correttamente e sia stabile. Accendere la luce a fluorescenza secondo il piano riferito al quarto livello e visualizzare le cellule transfectate, spegnendo successivamente la fluorescenza una volta che una cellula di interesse è nel campo visivo. Per minimizzare lo sbiancamento e la citotossicità, questo campo dovrebbe contenere circa due o tre cellule transfectate, in modo che siano ben distanziate ma non a contatto tra loro.In questo caso, le cellule vengono cotrasfettate con il gene reporter N-P-Y-M-R-F-P e un mutante di RAB5 costitutivamente attivo marcato con GFP. Regolare la potenza del laser per ridurre al minimo il rumore, la sovrasaturazione e la tossicità, e impostare il guadagno e l'offset per modificare il rapporto segnale-rumore. Eseguire la scansione rapidamente per ridurre al minimo la durata dell'esposizione al laser.Successivamente, impostare i parametri per il Zack al fine di ricostruire l'immagine in tre dimensioni. Regolare la dimensione del pinhole a un'unità di area per ottenere il miglior rapporto segnale-rumore ed eseguire la scansione successiva di sezioni ottiche confocali bidimensionali lungo l'asse Z con sezioni ottiche di spessore minore o uguale a 0,7 micrometri. Impostare ora l'intervallo di tempo tra ogni acquisizione a 30 secondi e la durata totale dell'acquisizione a 15 minuti, quindi iniziare l'acquisizione delle immagini dopo cinque minuti dall'avvio dell'acquisizione.Mettere in pausa la serie temporale, aggiungere otto microlitri del trigger 10x e continuare immediatamente l'acquisizione. Infine, salvare le immagini. Eseguire la deconvoluzione utilizzando un software di deconvoluzione e ricostruire le serie di immagini in immagini tridimensionali e in un filmato per eseguire l'analisi delle immagini.Importare i dati provenienti dalle immagini di serie temporali deconvolute ottenute mediante microscopia a fluorescenza confocale in un software di analisi scientifica delle immagini, come MRS. Questo software legge più di 40 tipi di file di microscopia. Per aggiungere punti temporali alla fine di un set di dati aperto, selezionare Modifica, Aggiungi punti temporali e importare il nuovo set di dati.Regolare il contrasto e la tonalità del colore per ottenere la visualizzazione ottimale dell'immagine. I file scaricati creano la superficie del canale MRFP. Utilizzando l'opzione della procedura guidata superficie.Scegliere l'algoritmo predefinito e selezionare il canale N-P-Y-M-R-F-P, attivando l'opzione di smoothing per ridurre il rumore. Per evitare la perdita di dettagli fini, ridurre il livello di dettaglio dell'area tra 0,05 e 0,1 micron. Successivamente, impostare la soglia di intensità.Viene visualizzata una nuova superficie grigia. Quindi andare nelle impostazioni e modificare lo stile da punto centrale a superficie. Passare alla scheda statistica nelle proprietà dell'oggetto selezionato.Quindi selezionare la scheda dettagliata e il valore specifico, come fluorescenza, intensità o volume. Esaminare i dati e verificare che i valori siano compatibili con le immagini. Ad esempio, due o più granuli adiacenti potrebbero essere misurati come un singolo granulo più grande al fine di quantificare la dimensione media dei granuli.Dividere la dimensione dei granuli secretori per il numero effettivo di granuli. Come passaggio finale, esportare i set di dati desiderati in file di Excel e analizzare i dati. Qui sono mostrate immagini rappresentative a lunga esposizione di granuli secretori giganti dei mastociti, formati mediante espressione di RAB5 costitutivamente attivo, nonché la cinetica dell'esocitosi e la risoluzione di un singolo granulo secretore.Dopo la stimolazione. Durante l'esocitosi dei mastociti, i granuli secretori si spostano verso la membrana plasmatica e si fondono con essa. I granuli sono rivestiti da RAB5 costitutivamente attivo, mostrato in verde.Il cargo segreto, che in questo esperimento è N-P-Y-M-R-F-P e colorato in magenta, viene quindi rilasciato dalle cellule nello spazio extracellulare. I granuli fusi dal mutante costitutivamente attivo di RAB5, mostrato in verde, si liberano. Il loro cargo N-P-Y-M-R-F-P, che in questo esperimento è colorato in magenta, viene rilasciato dalle cellule nello spazio extracellulare.Il rilascio di N-P-Y-M-R-F-P durante l'esocitosi provoca un aumento drammatico dell'intensità di fluorescenza di N-P-Y-M-R-F-P e il restringimento dei granuli secretori contenenti N-P-Y-M-R-F-P, seguito dalla loro scomparsa, insieme alle intensità di fluorescenza dei granuli secretori. Dopo la stimolazione delle cellule con un ionoforo del calcio, si osserva che i granuli secretori subiscono esocitosi in diversi punti temporali. Mentre un granulo secretore non si è fuso con la membrana plasmatica e la sua intensità di fluorescenza è rimasta costante.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come monitorare i granuli secretori dei mastociti durante lo sviluppo e l'esocitosi, utilizzando un reporter genico fluorescente che viene indirizzato ai granuli secretori e rilasciato da cellule stimolate. Insieme ai mediatori endogeni, i meccanismi alla base dello sviluppo dei granuli secretori dei mastociti e della loro esocitosi possono essere identificati mediante questa procedura, eseguendo una corsa simultanea ed esaminando le cellule con un gene reporter e un gene tester. Il ruolo del gene tester nello sviluppo dei granuli secretori dei mastociti può essere valutato effettuando un'analisi morfometrica dei granuli secretori delle cellule co-trasfettate con il gene di interesse, in confronto con cellule di controllo.Inoltre, il ruolo del gene testato nella esocitosi regolata può essere identificato monitorando il rilascio del gene reporter.

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