In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervoso enterico

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare l'attività dei neuroni enterici e della glia in preparazioni intestinali vive a montatura intera utilizzando coloranti indicatori di calcio fluorescenti. Ciò si ottiene asportando prima una parte dell'intestino dall'animale e mettendola in un mezzo di preriscaldamento. Il secondo passo consiste nell'aprire l'intestino lungo il bordo mesenterico e appiattirlo sotto leggera tensione con una superficie mucosa rivolta verso l'alto.

Le preparazioni di montatura intera del plesso mienterico vengono preparate mediante microdissezione e poste in piastre di imaging. Successivamente, l'intera preparazione della montatura viene caricata con un colorante indicatore fluorescente influenza oh quattro in un'incubatrice. Nelle fasi finali, le preparazioni caricate vengono visualizzate utilizzando un microscopio per immagini fluorescente dotato di una fotocamera ad alta risoluzione controllata da un software di acquisizione e analisi delle immagini per registrare l'attività di base.

Quindi vengono aggiunti i farmaci in esame e vengono registrati i transitori del calcio nei neuroni e nella glia. In ultima analisi, in situ. L'imaging del calcio del sistema nervoso enterico viene utilizzato per studiare come l'attività cellulare nei neuroni e nella glia contribuisca alla regolazione delle funzioni intestinali fisiologiche e alla disfunzione del sistema nervoso enterico nella fisiopatologia intestinale.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la comprensione della fisiologia e della fisiopatologia dei disturbi funzionali intestinali e delle malattie infiammatorie intestinali attraverso l'uso di un metodo semplice e robusto per esaminare la complessa interazione tra neuroni e glia enterica utilizzando l'imaging del calcio NC due che dimostra che questa procedura sarà gratuita per gli scienziati del mio laboratorio. Le seguenti procedure che coinvolgono tessuti provenienti da animali da laboratorio sono coerenti con le linee guida dell'A VMA per l'eutanasia degli animali 2013 e sono state approvate in anticipo dalla Michigan State University I-A-C-U-C Dopo l'eutanasia dell'animale secondo le procedure approvate, posizionare l'animale in posizione supina e pulire la pelle sopra l'addome con etanolo al 70%. Usa una pinza per pizzicare la pelle addominale sulla linea mediana e poi usa le forbici chirurgiche per praticare un'incisione mediale di sei centimetri lungo il gomito lineare per esporre gli organi digestivi interni.

Quindi, usa una pinza smussata per individuare ed esporre il colon all'interno del peritoneo. Tagliate il mesentere ileale del colon con le forbici e iniziate a sbrogliare l'intestino. Una volta che la lunghezza dell'intestino è adeguatamente dipanata, tagliare il colon distalmente al cieco e prossimalmente al retto per una preparazione dell'intestino crasso, che verrà mostrata in questo video.

Quindi rimuovere rapidamente il segmento intestinale e metterlo in un becher contenente DM EMF 12 Media integrato con tre micromolari di nicardipina cloridrato e un micromolare di S scopolamina cloridrato su ghiaccio. L'aggiunta di questi inibitori facilita la microdissezione e il successivo imaging paralizzando la muscolatura liscia intestinale. Rimuovere un piccolo segmento di quattro o sei centimetri del segmento intestinale desiderato e metterlo in una capsula di Petri rivestita di syl guard riempita con terreno integrato refrigerato.

Quindi fissare le estremità prossimale e distale del segmento intestinale con spilli per insetti e aprire il tubo intestinale praticando un taglio longitudinale lungo il bordo mesenterico. Ora appiattire il tessuto sotto una leggera tensione con la mucosa rivolta verso l'alto e sezionare con cura lo strato mucoso sollevando la mucosa con una pinza fine numero cinque e tagliando sotto con forbici a molla molto sottili. Tagliare il tessuto in preparazioni più piccole di circa 0,5 centimetri quadrati e posizionare ogni pezzo in una piastra di imaging riempita con terreni integrati e posizionare su ghiaccio.

Appunta ogni preparazione ai quattro angoli con uno strato muscolare circolare rivolto verso l'alto. Seziona con cura il muscolo circolare separandolo con una pinzetta sottile. Per esporre il plesso mienterico, evitare un eccessivo allungamento, riposizionare le piastre di imaging sul ghiaccio e sostituire la soluzione in ogni piastra con un terreno fresco integrato.

Quindi, togliete i piatti dal ghiaccio e aggiungete due millilitri di miscela enzimatica a ciascun piatto e incubate a temperatura ambiente con il 5% di anidride carbonica e il 95% di aria per 15 minuti. Infine, lavare le preparazioni tissutali con terreno tre volte e tenere a freno gli angoli mentre si lavora in condizioni di luce limitata per evitare il fotosbiancamento a 1,5 millilitri di terreno integrato e 1,2 microlitri di un brodo probit da 250 millimolari a 1,5 microlitri di Eloqua di quattro millimolari Fluro quattro ceppi a circa 1,5 millilitri di flu o quattro soluzione di caricamento alle piastre di imaging e incubare in un'incubatrice buia a 37 gradi Celsius per 45 verbale. Dopo aver tolto i piatti dall'incubatrice, lavare le preparazioni tre volte con i media.

Quindi aggiungere un terreno fresco contenente 200 micromolari di acido prop per migliorare la marcatura neuronale neurale e incubare come prima per 15 minuti. Durante l'incubazione, preparare un tampone Krebs modificato secondo le istruzioni nella parte scritta del protocollo e aggiungere tre micromolari di nicardipina e un micromolare di scopolamina per inibire le contrazioni muscolari. Durante le dissezioni del calcio due più l'imaging e l'intera montatura, posizionare la camera di registrazione sotto il microscopio a fluorescenza e utilizzando un sistema di perfusione a flusso gravitazionale con più serbatoi di siringhe riscaldati.

Stabilire un tasso di perfusione continua di due o tre millilitri al minuto di 37 gradi Celsius tampone di Krebs. Assicurarsi di evitare la formazione di bolle d'aria sia nell'ingresso che nella linea di aspirazione collegata a un sifone. Mettere a fuoco il plesso desiderato in condizioni di illuminazione a campo chiaro.

Evitare di sovraesporre il tessuto che potrebbe portare al fotosbiancamento. Esaminare l'influenza oh quattro carico all'interno dei gangli e selezionare gangli sani per l'imaging. I gangli danneggiati malsani mostreranno autofluorescenza o morfologia puntata e non dovrebbero essere utilizzati per l'imaging.

Una volta selezionato un ganglia, deviare il percorso della luce verso la telecamera e ottenere un'immagine dal vivo. Con il software di acquisizione delle immagini, assicurarsi che il ganglio sia a fuoco e impostare la velocità di acquisizione delle immagini e i tempi di esposizione Le velocità e i tempi di acquisizione delle immagini variano a seconda degli eventi che gli investigatori desiderano registrare. Per la maggior parte degli esperimenti, le immagini vengono tradizionalmente acquisite a una velocità compresa tra 0,5 e un hertz per le cellule gliali e fino a due a 10 hertz.

Per i neuroni, poiché i transienti del calcio gliale non sono rapidi come i neuroni transienti del calcio, avviare la registrazione e stabilire l'attività fisiologica di base del ganglio scelto in assenza di stimoli sperimentali per 30 secondi. Quindi applicare i farmaci di preriscaldamento di interesse, come gli agonisti e gli antagonisti dei recettori, utilizzando il sistema di perfusione a flusso gravitazionale a una velocità di due o tre millilitri al minuto, secondo un protocollo ottimizzato per il farmaco. Interrompi la registrazione e visualizza il filmato time lapse dell'esperimento.

Seleziona attentamente le regioni di interesse o il ROI utilizzando l'apposito software di analisi delle immagini. Infine, utilizzare un software di imaging appropriato per normalizzare e confrontare l'intensità fluorescente delle regioni di interesse con la sua linea di base iniziale Le variazioni di valore nella fluorescenza normalizzata sono direttamente proporzionali alle variazioni di calcio. Le tre immagini seguenti dimostrano che la glia enterica nella cavia risponde a un TP in situ.

In condizioni basali, è visibile una fluorescenza a basso livello di fluoro quattro, come delineato dalla linea tratteggiata. Le frecce indicano spessi tratti di fibre intergangliari dopo la stimolazione con 100 micro mo per litro di cellule gliali A TP, ma non i neuroni aumentano rapidamente la fluorescenza del fluoro quattro indicando un aumento del calcio. Si noti che le cellule che rispondono sono piccole e circondano i neuroni molto più grandi indicati dagli spazi scuri contrassegnati da asterisco.

Questo istogramma mostra che la glia enterica risponde a un TP in modo dose-dipendente con un milli mole per litro suscitando risposte massime. Questo video mostra un ganglio mienterico del colon distale del topo caricato con un colorante indicatore di calcio due più influenza oh quattro. L'agonista delle cellule gliali a DP viene aggiunto al bagno quando indicato.

Un DP provoca un aumento del calcio intracellulare due più nella glia enterica come osservato dall'aumento transitorio nell'influenza o nella fluorescenza quattro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esaminare accuratamente la complessa interazione tra i neuroni e utilizzare empiricamente l'imaging del calcio. La caratterizzazione dei meccanismi e delle potenziali conseguenze funzionali delle risposte al calcio nelle preparazioni a montatura intera richiede dissezioni precise per una qualità di imaging ideale.

L'uso della marcatura fluorescente e degli stimoli farmacologici all'interno di questa tecnica basata sulla microscopia consente una migliore valutazione di queste cellule nel loro ambiente multicellulare nativo.