Name: In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervoso enterico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Impara l'imaging del calcio in situ nel sistema nervoso enterico utilizzando preparati di intestino e indicatori fluorescenti. Questo metodo permette di studiare l'attività neuronale e gliale in tempo reale per comprendere la fisiologia intestinale.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni della Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (a B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women's Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) e fondi di avviamento della Michigan State University (B. Gulbransen).

NOTA: Le procedure seguenti che coinvolgono il tessuto da animali da laboratorio sono coerenti con le linee guida AVMA per l&#39;eutanasia degli animali 2013 e sono state approvate in anticipo dal Michigan State University IACUC. 1. Preparazione del tessuto <ol><li> Anestetizzare animali ricerca in una camera contenente 2,5% isoflurano in ossigeno o mettendo 3-5 ml di isoflurano liquido su un materiale assorbente sul pavimento della camera, in modo che una barriera fisica impedisce animali dal contatto diretto con l&#39;isoflurano. Test per la profondità dell&#39;anestesia pizzicando la zampa. NOTA: La profondità di anestesia è ritenuto appropriato quando non c&#39;è prelievo riflesso dell&#39;arto posteriore. Una volta adeguatamente anestetizzato, eutanasia il mouse dislocazione cervicale </li><li> Posto l&#39;animale in posizione supina e pulire la pelle addominale con etanolo al 70%. Utilizzare pinze per pizzicare la pelle addominale in linea mediana e usare le forbici chirurgiche per fare un supporto 6 centimetril incisione lungo la linea alba di esporre gli organi digestivi interni. </li><li> Utilizzare pinze smussato per individuare ed esporre l&#39;ileo all&#39;interno del peritoneo. Tagliare il mesentere ileale / colon con le forbici e iniziare a svelare l&#39;intestino. </li><li> Una volta che la lunghezza dell&#39;intestino è adeguatamente dipanato, intercettato distale dell&#39;intestino allo stomaco e prossimale al cieco per una preparazione ileo. Per una grande preparazione intestinale, tagliare il distale colon al cieco e prossimale al retto. </li><li> Rimuovere rapidamente il segmento intestinale e metterlo in un bicchiere con i media DMEM / F12 addizionato con 3 micron nicardipina cloridrato e 1 micron scopolamina cloridrato (di seguito denominato &quot;media&quot;) su ghiaccio. L&#39;aggiunta di questi inibitori facilita microdissezione e immagini successive paralizzando la muscolatura liscia dell&#39;intestino. </li><li> Segmento Taglio di interesse (ad esempio, digiuno, ileo, colon distale o prossimale) sulla base di marcatori anatomici stabiliti. Tipicamente utilize tessuto dal ileo distale o del colon distale. Tuttavia, utilizzare la stessa procedura di base per isolare, di carico e di immagine neuroni e glia mienterici in tutte le regioni intestinali. </li><li> Rimuovere un piccolo segmento (4-6 cm) di un segmento dell&#39;intestino desiderato e posto in una capsula di Petri Sylgard rivestite pieno di mezzi refrigerati. </li><li> Fissare l&#39;estremità prossimale e distale del segmento intestinale con perni di insetti e aprire il tubo intestinale facendo una dritta, longitudinale tagliare lungo il confine mesenterica. </li><li> Tessuto piatto sotto leggera tensione con il lato mucosa e attenzione sezionare via strato mucoso utilizzando una pinza sottile (5 # e # 5/45 di lavoro migliore) e forbici primavera molto fini Pin. NOTA: La rimozione della mucosa può essere molto traumatico per il ENS se non fatto correttamente. Per i preparati di qualità, fare attenzione a limitare brusca eliminazione della mucosa dalla secchezza o raschiamento. La pratica migliore è quello di sollevare la mucosa e tagliare con le forbici sotto pregiati. </li><li> Tagliare il tessuto in preparazione più piccolos (circa 0,5 cm2) e pin in piatti di imaging (4 angoli con strato muscolare circolare verso l&#39;alto) immessi sul ghiaccio con mezzi freschi. </li><li> Sezionare con attenzione via muscolo circolare da prendere in giro a parte con le pinzette sottili per esporre il plesso mioenterico. Evitare eccessivo allungamento. </li><li> Porre piatto di imaging indietro soluzione ghiaccio e il cambiamento con mezzi freschi. </li><li> Preparare 2 ml di miscela enzimatica per piatto [dispasi 1 U / ml (4.48 mg / 8 ml), Collagenase Tipo II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) nei media]. </li><li> Rimuovere piatti da ghiaccio e aggiungere il mix enzima dal punto 1.13. </li><li> Incubare piatti a temperatura ambiente per 15 minuti con 5% di CO 2/95% di aria. </li><li> Preparazioni di tessuto Lavare con i media 3 volte e angoli re-pin. </li></ol> 2. Loading Fluo-4 Dye NOTA: Evitare photobleaching lavorando con la luce limitata durante la manipolazione di coloranti fluorescenti e tessuto carichi di indicatore coloranti. <ol><li> Preparare 4 mM Fluo-4 soluzione di carico. <ol><li> Aggiungere 1,5 ml media e 1,2 ml di una probenecid magazzino 250 mm ad un&#39;aliquota di 1,5 ml di 4 mm Fluo-4 stock. 4 mM Fluo-4 stock viene preparato aggiungendo 11,4 ml di Pluronic F-127 (20% in DMSO; integrato con 0,25% cremaphor-EL) a 50 mg di Fluo-4, AM. </li></ol></li><li> Incubare preparazioni in Fluo-4 soluzione di carico per 45 minuti in un incubatore buio a 37 ° C. </li><li> Togliere dal incubatore e lavare preparazioni di media 3 volte. </li><li> Mezzi di scambio per supporti contenente 200 mM probenecid e incubare 15 min a 37 ° C prima di imaging. NOTA: Probenecid è un farmaco che inibisce trasportatori di resistenza ai farmaci in neuroni. L&#39;aggiunta di questo farmaco inibisce la capacità dei neuroni di estrudere coloranti e migliora etichettatura neuronale. Bulk-caricamento di Ca 2+ indicatori coloranti in assenza di probenecid produce principalmente gliali loading cellule. L&#39;aggiunta di probenecid permette la visualizzazione delle risposte neuronali e gliali. </li><li> Preparare Modified KreBuffer bs. <ol><li> Fare un tampone Krebs modificato tale che le concentrazioni finali (in mM) dei componenti sono come segue: 121 NaCl, KCl 5,9, CaCl 2 2,5, 1,2 MgCl 2, 1.2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO 3, 1 piruvico acidi e 8 glucosio (pH aggiustato a 7,4 con NaOH). Aggiungere 3 micron nicardipina e 1 micron scopolamina per inibire le contrazioni muscolari durante Ca 2+ imaging e tutto il montaggio dissezioni. </li></ol></li></ol> 3. Imaging e analisi NOTA: utilizzare almeno un impianto di imaging di base con una sorgente di luce fluorescente, microscopio, una camera CCD di qualità e adeguato software di acquisizione. Variare l&#39;aggiunta di altri componenti a seconda della sorgente di luce e l&#39;applicazione specifica. Una ruota del filtro e otturatore devono essere usati con una sorgente di luce allo xeno ad arco tradizionale. Tuttavia, fonti di luce LED e sistemi di illuminazione non richiedono tali componenti. <ol><li> Posizionare il recording camera sotto il microscopio e utilizzando un sistema di perfusione a gravità con più serbatoi siringa riscaldati stabilire un tasso perfusione continua di 2-3 ml / min a 37 ° C tampone Krebs. Assicurati di evitare la formazione di bolle d&#39;aria sia nella linea di ingresso e di aspirazione collegato ad una trappola del vuoto. </li><li> Portare il plesso desiderati a fuoco in condizioni di illuminazione in campo chiaro. Evitare sovraesposizione del tessuto, che può portare a foto sbiancamento. </li><li> Esaminare il Fluo-4 di carico all&#39;interno dei gangli e selezionare gangli sano per l&#39;imaging. Malsano gangli / danneggiati esporranno autofluorescenza o puntata morfologia e non devono essere utilizzati per l&#39;imaging. </li><li> Una volta selezionato ganglio, deviare il percorso della luce per fotocamera e di ottenere immagini dal vivo con il software di acquisizione delle immagini. Assicurarsi che ganglio è a fuoco e impostare l&#39;immagine di tasso di acquisizione e di esposizione volte. NOTA: i tassi di acquisizione delle immagini e tempi variano a seconda degli eventi investigatori vogliono registrare. Per la maggior parte degli esperimenti, le immaginisono tradizionalmente acquisita a 0,5-1 Hz per le cellule gliali e fino a 2-10 Hz per i neuroni, perché gliali Ca 2+ risposte non sono così rapidi come Ca 2+ transitori nei neuroni. </li><li> Inizia esperimento e stabilire attività di base per 30 sec. </li><li> Applicare farmaci preriscaldate di interesse come agonisti e antagonisti del recettore utilizzando il sistema di perfusione a gravità ad una velocità di 2-3 ml / min. Seguire applicazione di agonisti / antagonisti ritornando ad una perfusione di tampone normale e consentire un periodo di wash / recupero di almeno 10 min. NOTA: I tempi Drug Application varieranno a seconda del composto individuale e disegno sperimentale. In generale, un&#39;applicazione 20-30 sec di agonista è sufficiente per attivare G-proteine ​​recettori accoppiati in neuroni e cellule gliali. Tuttavia, i canali ionici ligando-dipendenti (come i recettori nicotinici) richiedono tempi di applicazione di non più di 5-10 sec. Ulteriori esposizioni durata causerà canali ionici ligando gated a Dese rapidamentensitize. Antagonisti dovrebbero essere applicate per circa 3-15 minuti per garantire la completa blocco delle vie del recettore. Tuttavia, questa è una generalizzazione lordo e investigatori deve sempre ottimizzare qualsiasi farmaco sperimentale in loro particolare paradigma. </li><li> Interrompere la registrazione e visualizzazione di film time-lapse dell&#39;esperimento. Selezionare con attenzione regioni di interesse (ROI) utilizzando il software di analisi di immagine appropriata. </li><li> Utilizzare software per normalizzare e confrontare l&#39;intensità fluorescenza ROI contro il suo valore di base fluorescente iniziale. Le variazioni nella fluorescenza normalizzata sono direttamente proporzionali alle variazioni [Ca 2+]. <ol><li> Utilizzare una modifica di un metodo descritto in precedenza 26 con Af / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) sfondo, dove F1 è la fluorescenza in un dato point e F0 è la fluorescenza basale, per migliorare la precisione di valutazione. Questo aiuti modificanella riduzione del rumore da variazioni di fluorescenza in preparati tissutali che mostrano il movimento dello strato muscolare sottostante plesso mioenterico. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le metodologie descritte in questo manoscritto forniscono un approccio coerente per studiare efficacemente i neuroni e la glia enterica nell'ENS. Sebbene l'imaging dei neuroni e della glia enterica in coltura abbia prodotto una grande quantità di informazioni sulla funzione delle singole cellule, lo studio di queste cellule nel loro ambiente nativo e multicellulare è fondamentale per comprendere la loro fisiologia e fisiopatologia. La microscopia a fluorescenza è una tecnica cruciale per valutare le interazioni multidirezionali delle cellule nell'ENS. Il caricamento delle celle dell'ENS con marcatori fluorescenti selettivi e l'acquisizione di immagini con microscopia ad alta risoluzione consentono osservazioni quantitative dell'attività cellulare nell'ENS. L'imaging di campioni di tessuto vivo dell'ENS viene eseguito in modo relativamente rapido e genera grandi quantità di dati funzionali e spaziali approfonditi. I preparati del plesso mienterico e sottomucoso di topo utilizzati in questi esperimenti consentono approcci di manipolazione molecolare e genetica. L'imaging Ca2+ in preparazioni a montatura intera fornisce uno strumento utile per la valutazione delle interazioni neurone-glia.
Nei paradigmi sperimentali avanzati, diverse sonde possono essere combinate per ottenere informazioni su diversi eventi all'interno delle cellule. La microscopia a fluorescenza può registrare immagini con un contrasto maggiore di molecole specifiche, se viene utilizzata un'etichetta fluorescente appropriata. Fluo-4 è stato scelto perché possiede un'ampia gamma dinamica. Un tempo di incubazione sufficiente è fondamentale quando si utilizzano i coloranti AM in ENS. Potrebbe essere necessario regolare la concentrazione del colorante e il metodo di caricamento per ottenere i migliori risultati. Le preparazioni ideali dovrebbero essere caricate con una quantità sufficiente di colorante per visualizzare i cambiamenti nella fluorescenza, ma non così tanto da consentire al colorante di chelare gli ioni bersaglio e interferire con la segnalazione intracellulare. L'esposizione alla luce fluorescente deve essere limitata per prevenire la fototossicità nelle cellule e il fotosbiancamento dei coloranti. 
Gli investigatori devono prestare attenzione a diverse fasi di questo esperimento, in particolare alla preparazione della soluzione e dei tessuti. Particolare attenzione deve essere prestata durante il trattamento e la dissezione del tessuto ENS al fine di mantenere le funzioni cellulari. Il tratto gastrointestinale contiene diversi strati e varietà di tessuti, che rappresentano una sfida per la dissezione e la qualità dell'imaging in queste preparazioni a montatura intera 27. Inoltre, i tratti di fibre di interconnessione dell'MP sono più larghi e i gangli sono più grandi di quelli dell'SMP 2. La densità neuronale del plesso mienterico è maggiore rispetto a quella del plesso sottomucoso 28. Dissezioni lente e imprecise avranno effetti dannosi sulla qualità dei preparati del plesso e quindi sul successo complessivo degli esperimenti. Pertanto, gli strumenti puliti/non danneggiati, la pratica e la destrezza manuale sono fondamentali per questa procedura. 
Nelle preparazioni tissutali a montaggio intero, è necessario prestare particolare attenzione quando si disegnano le regioni di interesse (ROI) per valutare correttamente la cinetica e il grado di variazione osservata nell'intensità della fluorescenza del tipo di cellula desiderato. Poiché i gangli si trovano su uno strato muscolare contrattile, gli artefatti di movimento causati dalla motilità intestinale sono una preoccupazione primaria durante l'imaging in situ . Pertanto, la soppressione di questi disturbi del movimento attraverso il re-pinning delle preparazioni tissutali dopo l'incubazione con enzimi e l'aggiunta di inibizione farmacologica (nicardipina/scopolamina) ai tamponi consente un'acquisizione di immagini chiara e affidabile. Oltre alla farmacologia e agli approcci meccanici per prevenire il movimento dei tessuti, studi recenti illustrano l'applicazione di metodologie software avanzate e caratteristiche di risposta del tipo di cellula per correggere il movimento del tessuto residuo nelle registrazioni e migliorare l'accuratezza dell'analisi 29. Escludendo questi ostacoli tecnici, questo metodo fornisce le condizioni fisiologicamente rilevanti per valutare le caratteristiche morfologiche e quantitative dei neuroni e della glia enterica nell'ENS.

Il sistema nervoso enterico (ENS) è organizzata in due plessi ganglionated incorporato all&#39;interno della parete del tubo digerente 1. Questi circuiti neurali intramuscolari, plesso mienterico (MP) e sottomucosa plesso (SMP), sono composti da neuroni e glia enterica (Figura 1) 2. Il deputato e SMP regolano gastrointestinali (GI) funzioni come la motilità intestinale e l&#39;assorbimento epiteliale e la secrezione, rispettivamente, 3. Glia enterica si trovano in prossimità di neuroni all&#39;interno gangli ma le popolazioni di glia enterica esistono anche all&#39;interno di interconnessione tratti di fibre e porzioni extra-gangliari della parete intestinale 3,4. Glia enterici sono stati originariamente credeva di fornire solo il supporto nutritivo per i neuroni. Tuttavia, studi recenti suggeriscono che le interazioni neuroni-glia sono essenziali per ENS funziona 5,6. Ad esempio, i dati mostrano che glia enterica &quot;ascoltare&quot; per l&#39;attività neuronale 7e modulare circuiti neuronali 6,8, proteggere i neuroni enterici dallo stress ossidativo 9 e sono in grado di generare nuovi neuroni enterici in risposta al danno 10,11. Il protocollo presentato in questa tecnica offre un metodo semplice e robusto per esaminare la complessa interazione tra neuroni e glia enterica utilizzando in situ intracellulare Ca 2+ imaging. Ca 2+ è una molecola di segnalazione ubiquitario nelle cellule eccitabili e svolge un ruolo essenziale in eventi di segnalazione sinaptica nel sistema nervoso 12. Eccitazione dei neuroni o glia enterica suscita un aumento della concentrazione citoplasmatica di Ca 2+ sia afflusso attraverso Ca 2+ canali -permeable o Ca 2+ rilascio dai depositi intracellulari di calcio. Imaging Ca 2 + transitori in neuroni e glia con coloranti fluorescenti è un fondato e tecnica ampiamente utilizzata per studiare l&#39;organizzazione funzionale e dinamica dell&#39;ENS 13-17. Ca 2+ di imaging ha dimostrato di essere uno strumento importante per studiare i segmenti di tessuto GI intatte per chiarire la diffusione di eccitabilità attraverso ICC reti pacemaker 18 e intestino muscolatura liscia 19,20. Esso consente ai ricercatori di sondare un ampio spettro di parametri fisiologici e fornisce informazioni sia la loro distribuzione spaziale e la dinamica temporale. Le celle possono essere efficacemente colorati in modo minimamente invasivo utilizzando indicatori fluorescenti membrana permeabile e protocolli di colorazione ottimizzati 21. Ciò offre la possibilità di controllare un gran numero di neuroni e glia enterica in preparazioni funzionalmente conservati 14-16,22, così come in vivo 23. -Montaggio interi preparati di tessuto sono di massa caricato con un alta affinità Ca 2+ colorante indicatore come Fluo-4 che ne aumenta la fluorescenza quando si lega a Ca 2+. Le variazioni di fluorescenza sono registrate da una telecamera CCD e anazati digitalmente 6. L&#39;avvento di Ca 2+ ha fornito la possibilità di controllare neuroni e cellule gliali interazioni, risposta a vari stimoli, e il coinvolgimento di questi tipi di cellule nei processi gastrointestinali in tempo reale. In situ Ca 2+ di imaging ha dato grande intuizione dei meccanismi di segnalazione di neuroni enterici e glia e possiede diversi vantaggi rispetto ai modelli di coltura cellulare 6,24. In primo luogo, in situ preparati mantenere l&#39;ambiente di matrice nativa di neuroni e glia e lasciano la maggior parte delle loro connessioni con il tessuto intatto bersaglio. In secondo luogo, la genetica e la morfologia di colta glia enterica sono significativamente modificati rispetto al vivo 6,24. In terzo luogo, molte interazioni eterotipiche si perdono in colture cellulari primarie e questo limite valutazione interazioni cellula-cellula. Anche se le cellule coltivate sono particolarmente adatte per le indagini di proprietà fondamentali, la loro usefulness per studiare le interazioni complesse tra glia e neuroni enterici è limitata. Indagare interazione neuroni-glia utilizzando un approccio in situ è fisiologicamente più rilevante come i percorsi sinaptici rimangono intatti 25. Rispetto agli approcci di coltura cellulare, un approccio in situ offre migliori condizioni per la comprensione sistematica delle interazioni complesse tra i neuroni e glia enterica. Inoltre, l&#39;organizzazione planare del plesso ganglionated nei preparati tutto il montaggio è ideale per l&#39;imaging fluorescente intracellulari di Ca 2+ transitori e questa tecnica offre un approccio diretto per valutare l&#39;attività dei neuroni-glia nella ENS.

<table><tbody><tr><td>Riscaldatore a siringa BubbleStop&nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi, Tipo II, polvere</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti di dissezione</td><td>Roboz&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a stadio fisso</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM colorante</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Spilli per insetti</td><td>Strumenti di scienza</td><td>fine Minutien Pins</td><td></td></tr><tr><td>iQ Software di imaging di cellule vive</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS Camera</td> di perfusione <td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr> Camera di <tr><td>perfusione</td><td>Pompa</td> peristaltica personalizzata <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Harvard Apparatus</td><td>Modello 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>Sonde</td> molecolari Invitrogen <td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td></td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Scopolamina</td><td>Sigma</td><td>S1013&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ ca 2+ imaging del sistema nervoso enterico

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

I comportamenti riflessi dell'intestino sono controllati dal sistema nervoso enterico (ENS). L'ENS è una rete integrativa di neuroni e glia in due plessi ganglionati alloggiati nella parete intestinale. I neuroni enterici e la glia enterica sono gli unici tipi di cellule all'interno dei gangli enterici. L'attività dei neuroni enterici e della glia è responsabile del coordinamento delle funzioni intestinali. Questo protocollo descrive i metodi per osservare l'attività dei neuroni e della glia all'interno dell'ENS intatto mediante imaging di transienti intracellulari di calcio (Ca2+) con coloranti indicatori fluorescenti. La nostra discussione tecnica si concentra sui metodi per l'imaging del Ca2+ in preparazioni a montatura intera del plesso mienterico dall'intestino del roditore. Il caricamento di massa di montature intere ENS con un indicatore di Ca2+ ad alta affinità come Fluo-4 consente di misurare le risposte di Ca2+ in singoli neuroni o cellule gliali. Queste risposte possono essere evocate ripetutamente e in modo affidabile, il che consente studi quantitativi utilizzando strumenti farmacologici. Le risposte del Ca2+ nelle cellule dell'ENS vengono registrate utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera con dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) raffreddata. Le misure di fluorescenza ottenute utilizzando l'imaging con Ca2+ in preparazioni a montatura intera offrono un mezzo semplice per caratterizzare i meccanismi e le potenziali conseguenze funzionali delle risposte al Ca2+ nei neuroni enterici e nelle cellule gliali.

L&#39;uso corretto di questa tecnica permette ai ricercatori di misurare con precisione intracellulare Ca 2+ [Ca 2+] i transitori nei neuroni enterici e glia in tutto il montaggio preparazioni di tessuto. Un esempio rappresentativo di un agonista-evocato Ca 2+ risposte in glia all&#39;interno di un ganglio myenteric dal colon del mouse è mostrato in Video 1. I risultati seguenti hanno lo scopo di illustrare alcuni risultati rappresentativi che abbiamo ottenuto con questo metodo. In primo luogo, la figura 2 illustra i risultati di un esperimento di misurazione gliali enteriche [Ca 2+] i cambiamenti in risposta alla stimolazione con ATP all&#39;interno cavia del colon longitudinale plesso muscolare mienterico (LMMP) preparati. Specificamente, questa figura mostra il metodo per la corretta analisi del protocollo sperimentale sopra elencati compreso il contorno del ganglio myenteric analizzato e asterischi denotano la posizione dei neuroni enterici. Questi risultati anche illustrate la dose ottimale di un centinaio micromolar ATP sulla mobilitazione del [Ca 2+] i nella cavia glia myenteric. Questa risposta può essere utilizzata per calibrare la stimolazione gliale enterica e normalizzare risposte per testare stimoli. Avanti, Figura 3 chiarisce come selezionare correttamente regioni di interesse (ROI) che circonda le cellule gliali, mostrato con circostante cerchi gialli. Questi risultati mostrano anche le variazioni di fluorescenza desiderati in condizioni basali e in risposta a stimoli farmacologici. Infine, la Figura 4 mostra le considerazioni spaziali per la scelta glia enterica e neuroni per [Ca 2+] i risposte in preparati tutto il montaggio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> Figura 1. Organizzazione della ENS. L&#39;ENS contiene due grandi plessi ganglionated. Il plesso mienterico si trova tra l&#39;lstrati muscolari ongitudinal e circolari. Il plesso sottomucosa si trova tra la mucosa e lo strato muscolare circolare. L&#39;ENS è esclusivamente composto da neuroni e glia enterica. Tratti di fibre del nervo collegano gangli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> Figura 2. enterica glia nella cavia del colon plesso mioenterico rispondere alle atp in situ. (A) Fluo-4 fluorescenza in un ganglio mienterici (illustrato a tratteggio) in condizioni basali. Le frecce indicano spessi tratti di fibre interganglionic. (B) Dopo stimolazione con 100 mmol / L ATP, le cellule gliali, ma non i neuroni, aumentano rapidamente Fluo-4 fluorescenza indica un aumento di [Ca 2+] <sub&gt; i. Si noti che le cellule che rispondono sono piccole e circondano i neuroni molto più grandi (spazi bui contrassegnati da un asterisco). (C) glia enterica rispondere alle ATP in modo dose-dipendente con 1 mmol / L suscitare risposte massime 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare un grande versione di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> Figura 3. murino S-100-GFP + cellule del colon plesso rispondere mienterico ATP in situ. (A) cellule gliali (verde) in un mouse del colon ganglio mienterico S-100-GFP + (delineati dalla linea tratteggiata). Sei regioni di interesse (ROI) che circonda le cellule gliali all&#39;interno dei gangli sono mostrate come cerchi gialli. Le frecce indicano tratti di fibre spesse portano nel ganglio. Asterischi dposizione enote di 2 neuroni enterici. (B) Stesso ganglio mostrando Rhod-2 fluorescenza in condizioni basali. (C) A seguito di stimolazione con 100 mmol / L ATP, le cellule gliali rispondono con un aumento [Ca 2+] i, come indicato da un aumento Rhod- 2 di fluorescenza. (D) Tracce corrispondente a ciascun ROI mostrato in A-C. (E) la risposta media (media ± SEM) delle 6 ROI mostrati in D 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> Figura 4. In situ imaging comunicazione enterica neurone-to-glia. (A) Immagini rappresentative (pseudocolored) da un esperimento di imaging Ca 2+ in cui un intero-mountpreparazione del plesso mioenterico è stata impugnata con l&#39;agonista del recettore neuronale P2X7 BzATP (100 micron, 30 sec). Si noti che l&#39;agonista neuronale provoca un aumento della fluorescenza Fluo4 nel neurone (A &#39;) prima che le cellule circostanti enteriche gliali (A &quot;). (B) Analisi della variazione di fluorescenza nel tempo glia (blu) e neuroni (rosso ) in seguito all&#39;applicazione del agonisti neuronale, BzATP. (C) neuronale e risposte gliali a BzATP in tampone normale (linee continue) e in tampone contenente bassa Ca 2+ e Mg 2+ (linee tratteggiate) per potenziare i recettori P2X7 neuronali 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Video 1. Agonist-evocato Ca 2+ risposta glia enterica insitu. Questo video mostra un ganglio myenteric dal mouse colon distale caricato con il Ca 2+ colorante indicatore, Fluo-4. L&#39;agonista cellule gliali, ADP, viene aggiunto al bagno quando indicato. ADP suscita un aumento intracellulare Ca 2+ in glia enterica come ha rilevato l&#39;innalzamento transitorio in Fluo-4 fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a>

Il sistema nervoso enterico (ENS) è una rete di neuroni e glia situata nella parete intestinale che controlla i riflessi intestinali. Questo protocollo descrive i metodi per registrare l'attività dei neuroni enterici e della glia in preparazioni vive di ENS utilizzando l'imaging Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervoso enterico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare l'attività dei neuroni e delle cellule gliali enteriche in preparati interi di intestino vivi, utilizzando coloranti fluorescenti indicatori di calcio. Questo viene realizzato prima asportando una porzione di intestino dall'animale e posizionandola in un mezzo preriscaldato. Il secondo passaggio consiste nell'aprire l'intestino lungo il margine mesenterico e nel fissarlo piatto, con una leggera tensione, in modo che la superficie mucosa sia rivolta verso l'alto.Preparati interi del plesso mienterico vengono preparati mediante microdissezione e posizionati in piatti per imaging. Successivamente, i preparati interi vengono caricati con un colorante fluorescente indicatore flu oh four in un incubatore. Nelle fasi finali, i preparati caricati vengono analizzati mediante un microscopio a fluorescenza dotato di una telecamera ad alta risoluzione controllata da un software di acquisizione e analisi delle immagini per registrare l'attività di base.Successivamente vengono aggiunti i farmaci in fase di studio e vengono registrati i transitori di calcio nei neuroni e nelle cellule gliali, infine in situ. L'imaging del calcio nel sistema nervoso enterico viene utilizzato per studiare come l'attività cellulare nei neuroni e nelle cellule gliali contribuisca alla regolazione delle funzioni fisiologiche intestinali e al malfunzionamento del sistema nervoso enterico nella patofisiologia intestinale.Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la comprensione della fisiologia e della patofisiologia dei disturbi funzionali intestinali e della malattia infiammatoria intestinale, attraverso l'utilizzo di un metodo semplice e robusto per esaminare l'interazione complessa tra neuroni e glia enterica mediante imaging del calcio con due coloranti. La dimostrazione di questa procedura sarà messa a disposizione gratuitamente dei ricercatori da parte del mio laboratorio. Le seguenti procedure che coinvolgono tessuti di animali da laboratorio sono conformi alle linee guida A VMA per l'eutanasia degli animali del 2013 ed sono state approvate in anticipo dal comitato I-A-C-U-C della Michigan State University. Dopo aver praticato l'eutanasia all'animale secondo le procedure approvate, posizionare l'animale in posizione supina e detergere la cute dell'addome con etanolo al 70%. Utilizzare una pinza per sollevare la cute addominale in corrispondenza della linea mediana, quindi usare forbici chirurgiche per effettuare un'incisione mediana di sei centimetri lungo la linea alba, al fine di esporre gli organi digestivi interni.Successivamente, utilizzare pinze ottuse per individuare ed esporre il colon all'interno del peritoneo. Tagliare il mesentere ileo-colico con le forbici e iniziare a srotolare l'intestino. Una volta che l'intestino è stato sufficientemente srotolato, tagliare il colon a valle del cieco e a monte del retto per preparare il grosso intestino, come verrà mostrato in questo video.Quindi rimuovere rapidamente il segmento intestinale e collocarlo in un becher contenente mezzo DM EMF 12 integrato con tre micromolari di cloridrato di nicardipina e un micromolare di cloridrato di S-scopolamina, posto sul ghiaccio. L'aggiunta di questi inibitori facilita la microdissezione e la successiva analisi mediante imaging, paralizzando il muscolo liscio intestinale. Rimuovere un piccolo segmento di quattro-sei centimetri del tratto intestinale desiderato e collocarlo in una piastra di Petri rivestita con Sylgard, riempita con mezzo supplementato freddo.Quindi fissare le estremità prossimale e distale del segmento intestinale con puntine da insetto e aprire il tubo intestinale praticando un'incisione longitudinale dritta lungo il margine mesenterico. Ora fissare il tessuto piatto sotto leggera tensione con la mucosa rivolta verso l'alto e dissezionare con attenzione il foglietto mucoso sollevando la mucosa con pinzette fini numero cinque e tagliando al di sotto con forbici a molla molto sottili. Tagliare il tessuto in preparazioni più piccole di circa 0,5 centimetri quadrati e posizionare ogni pezzo in una piastra per imaging riempita con mezzo integrato, quindi mettere sul ghiaccio.Fissare ogni preparazione ai quattro angoli con il strato di muscolo circolare rivolto verso l'alto. Dissezionare con attenzione il muscolo circolare separandolo delicatamente con pinzette fini. Per esporre il plesso mienterico, evitare stiramenti eccessivi, riporre nuovamente le capsule per imaging sul ghiaccio e sostituire la soluzione in ogni capsula con mezzo supplementato fresco.Successivamente, rimuovere le piastre dal ghiaccio e aggiungere due millilitri di mix enzimatico a ciascuna piastra, quindi incubare a temperatura ambiente con 5% di anidride carbonica e 95% di aria per 15 minuti. Infine, lavare i preparati di tessuto con il mezzo tre volte ed eseguire i risciacqui agli angoli, operando in condizioni di luce limitata per evitare il fotobiancamento, aggiungendo 1,5 millilitri di mezzo supplementato e 1,2 microlitri di una soluzione stock di probit 250 millimolare a 1,5 microlitri di Eloqua di una soluzione stock di Fluro four 4 millimolare, ottenendo circa 1,5 millilitri di soluzione di carico flu oh four da aggiungere alle piastre per l'analisi di imaging; quindi incubare in un incubatore al buio a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Dopo aver rimosso le piastre dall'incubatore, lavare i preparati tre volte con il mezzo.Quindi aggiungere mezzo fresco contenente 200 micromolar di acido propionico per potenziare l'etichettatura neuronale e incubare come in precedenza per 15 minuti. Durante l'incubazione, preparare un buffer di Krebs modificato seguendo le istruzioni riportate nella parte scritta del protocollo, e aggiungere tre micromolar di nicardipina e un micromolare di scopolamina per inibire le contrazioni muscolari. Durante l'acquisizione dell'immagine del calcio due più e le dissezioni in toto, posizionare la camera di registrazione sotto il microscopio a fluorescenza e utilizzare un sistema di perfusione a flusso gravitazionale con più serbatoi riscaldati di siringhe.Stabilire un flusso di perfusione continuo di due-tre millilitri al minuto di tampone di Krebs a 37 gradi Celsius. Assicurarsi di prevenire la formazione di bolle d'aria sia nella linea di ingresso che in quella di aspirazione collegata a un trappola sotto vuoto. Portare il plesso desiderato a fuoco in illuminazione a campo chiaro.Evitare un'eccessiva esposizione del tessuto, che potrebbe portare a fotobiancamento. Esaminare il caricamento del flu oh four nei gangli e selezionare gangli sani per l'acquisizione delle immagini. I gangli danneggiati e non sani mostreranno autofluorescenza o una morfologia puntiforme e non dovrebbero essere utilizzati per l'acquisizione delle immagini.Una volta selezionato un ganglio, deviare il percorso della luce verso la telecamera e ottenere un'immagine in tempo reale. Mediante un software di acquisizione delle immagini, assicurarsi che il ganglio sia a fuoco e impostare la frequenza di acquisizione e i tempi di esposizione. Le frequenze e i tempi di acquisizione varieranno a seconda degli eventi che i ricercatori desiderano registrare. Per la maggior parte degli esperimenti, le immagini vengono tradizionalmente acquisite a una frequenza compresa tra 0,5 e 1 hertz per le cellule gliali e fino a 2-10 hertz.Per i neuroni, poiché i transitori del calcio nelle cellule gliali non sono rapidi come quelli nei neuroni, avviare la registrazione e stabilire l'attività fisiologica di base del ganglio selezionato in assenza di stimoli sperimentali per 30 secondi. Successivamente, applicare i farmaci di interesse preriscaldati, come agonisti e antagonisti recettoriali, utilizzando il sistema di perfusione a flusso gravitazionale a una velocità di due-tre millilitri al minuto, secondo un protocollo ottimizzato per il farmaco in uso. Arrestare la registrazione e visualizzare il filmato con dilatazione temporale dell'esperimento.Selezionare attentamente le regioni di interesse o ROI utilizzando un software di analisi delle immagini appropriato. Infine, utilizzare un software di imaging adeguato per normalizzare e confrontare l'intensità fluorescente delle regioni di interesse rispetto al valore iniziale di base. Le variazioni del valore di fluorescenza normalizzata sono direttamente proporzionali alle variazioni di calcio. Le tre immagini seguenti dimostrano che la glia enterica nel criceto risponde a un TP in situ.In condizioni basali, è visibile un basso livello di fluorescenza di fluoro quattro, indicato dalla linea tratteggiata. Le frecce indicano spessi tratti di fibre intergangliari; dopo stimolazione con 100 micro mol/L di ATP, le cellule gliali, ma non i neuroni, aumentano rapidamente la fluorescenza di fluoro quattro, indicando un incremento del calcio. Si noti che le cellule che rispondono sono di piccole dimensioni e circondano i neuroni molto più grandi, indicati dagli spazi scuri contrassegnati dall'asterisco.Questo istogramma mostra che la glia enterica risponde a un TP in maniera dose-dipendente, con un millimole per litro che induce risposte massimali. Questo video mostra un ganglio mienterico del colon distale del topo carico con un colorante indicatore di calcio due più, flu oh quattro. L'agonista delle cellule gliali a DP viene aggiunto al bagno quando indicato.Un DP induce un aumento del calcio intracellulare due più nei glia enterici, come osservato dall'elevazione transitoria della fluorescenza di flu oh quattro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come esaminare accuratamente l'interazione complessa tra neuroni e glia utilizzando l'imaging del calcio. La caratterizzazione dei meccanismi e delle potenziali conseguenze funzionali delle risposte al calcio in preparazioni a tutto monte richiede dissezioni precise per ottenere una qualità ideale dell'imaging.L'uso di marcatura fluorescente e stimoli farmacologici all'interno di questa tecnica basata sulla microscopia consente una valutazione migliorata di queste cellule nel loro ambiente multicellulare nativo.

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Questo protocollo illustra come voltaggio-sensibile coloranti attivare la registrazione ottica di attività elettrica da intatte le reti neurali, come i plessi della cavia sistema nervoso enterico, con una risoluzione regolabile che va dal singolo cellule gangliari a più circuiti.

La registrazione ottica di attività elettrica in Guinea-maiale Reti enterici utilizzando tensione sensibile Coloranti

Questo video mostra un metodo per isolare le cellule gliali enteriche dalla sottomucosa e dalla lamina propria dell'intestino del topo. Delinea le fasi coinvolte nell'estrazione della sottomucosa e del tessuto della lamina propria, isolando le cellule gliali enteriche da esse e coltivando le cellule su una piastra a pozzetti rivestita per stabilire una coltura di cellule gliali enteriche.

Isolamento delle cellule gliali enteriche dalla sottomucosa e dalla lamina propria di un topo

Questo video dimostra l'immunocolorazione del tratto gastrointestinale murino embrionale per visualizzare e analizzare la distribuzione della popolazione neuronale utilizzando l'immunofluorescenza e la microscopia confocale.

Colorazione immunofluorescente di popolazioni neuronali nel tratto gastrointestinale murino embrionale

Fonte: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Imaging del sistema nervoso enterico. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Questo video dimostra il calcio imaging per visualizzare e analizzare l'attività dei neuroni enterici e della glia nelle preparazioni del plesso mienterico del colon di topo.

Imaging del calcio delle attività dei neuroni enterici e della glia in un plesso mienterico del colon di topo

Fonte: Doser, R., et al. Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Questo video mostra l'imaging in vivo del flusso di calcio subcellulare nei neuroni del cordone nervoso ventrale dei ceppi transgenici di Caenorhabditis elegans. Vengono impiegati due indicatori di calcio distinti: un indicatore citoplasmatico in un ceppo e un indicatore mitocondriale in un altro. I neuroni vengono osservati al microscopio a fluorescenza per monitorare in tempo...

Imaging della dinamica subcellulare del calcio nei neuroni di Caenorhabditis elegans

Dimostriamo un protocollo di coltura cellulare per lo studio diretto dei componenti neuronali e gliali del sistema nervoso enterico. Un neurone / cultura mista glia su vetrini è preparato dal plesso mienterico di topo adulto fornendo la possibilità di esaminare singolo neurone e la funzione glia di elettrofisiologia,...

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparazione dei neuroni enterici isolati e glia dal plesso mienterico del topo adulto

Il sistema nervoso enterico è formato da cellule della cresta neurale che proliferano, migrano e colonizzano l'intestino. Le cellule della cresta neurale si differenziano in neuroni con marcatori specifici per il loro fenotipo di neurotrasmettitore. Questo protocollo descrive una tecnica per la dissezione, il fissaggio e l'immunocolorazione del tratto gastrointestinale embrionale murino per visualizzare l'espressione dei neurotrasmettitori del sistema nervoso enterico.

Immunostaining Per visualizzare Murine enterico nervoso Sistemi Di Sviluppo

Questo articolo descrive una tecnica di imaging video e una mappatura spazio-temporale ad alta risoluzione per identificare i cambiamenti nella regolazione neurale della motilità del colon nei topi adulti. Effetti sottili sulla funzione gastrointestinale (GI) possono essere rilevati utilizzando questo approccio in preparati tissutali isolati per migliorare la nostra comprensione della malattia gastrointestinale.

Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

I nervi afferenti mesenterici trasmettono informazioni dal tratto gastrointestinale verso il cervello riguardanti la normale omeostasi e la fisiopatologia. L'attività del nervo afferente gastrointestinale può essere valutata montando segmenti intestinali isolati con nervi afferenti attaccati in un bagno d'organo, isolando il nervo e valutando l'attività basale e stimolata.

In Vitro registrazione di mesenterica afferenti attività del nervo nel topo digiunale e segmenti del colon

La microscopia A scattering Raman stimolato (SRS) consente l'imaging senza etichette di biomolecole in base alla loro vibrazione intrinseca di specifici legami chimici. In questo protocollo, viene descritta la configurazione strumentale di un microscopio integrato SRS e fluorescenza a due fotoni per visualizzare le strutture cellulari nel midollo spinale di topi vivi.

In vivo Imaging di tessuti biologici con fluorescenza combinata a due fotoni e microscopia a dispersione Raman stimolata

Questo protocollo descrive l'esposizione chirurgica del ganglio della radice dorsale (DRG) seguito da GCaMP3 (indicatore Ca2+ codificato geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging degli insiemi neuronali utilizzando topi Pirt-GCaMP3 mentre si applica una varietà di stimoli alla zampa posteriore omolaterale.

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

Impara l'imaging del calcio in situ nel sistema nervoso enterico utilizzando preparati di intestino e indicatori fluorescenti. Questo metodo permette di studiare l'attività neuronale e gliale in tempo reale per comprendere la fisiologia intestinale.

In Situ Ca ²⁺ Imaging del sistema nervoso enterico

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