Name: Valutare lencefalopatia spongiforme trasmissibile Specie Barriere con un In Vitro Prion Protein Assay Conversion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Scopri un saggio in vitro per valutare le barriere di specie nelle encefalopatie spongiformi trasmissibili senza utilizzare animali. Questo metodo misura il rapporto di efficienza di conversione per prevedere i rischi di trasmissione interspecifica.

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Ringraziamo John Olsen (Dipartimento delle Risorse Naturali del Wisconsin), Tom Cooley, Daniel O'Brien e Steve Schmitt (Dipartimento delle Risorse Naturali del Michigan) e il Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) per l'assistenza nell'acquisizione dei tessuti. Ringraziamo anche il Wisconsin State Laboratory of Hygiene per i servizi di test diagnostici e la dottoressa Tonie Rocke e il suo staff (USGS National Wildlife Health Center) per l'uso delle attrezzature. Qualsiasi uso di nomi commerciali, di prodotti o di aziende è solo a scopo descrittivo e non implica l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.

Animal lavoro condotto presso l&#39;USGS National Wildlife Health Center è stata eseguita in accordo con l&#39;Ufficio NIH di linee guida Laboratory Animal Welfare e sotto la cura degli animali istituzionale e comitato uso protocollo # EP080716. I tessuti di animali cacciatori-raccolta erano doni del Wisconsin o Michigan dipartimenti delle risorse naturali. 1. Soluzione Preparazione NOTA: Le soluzioni elencate di seguito sono necessari per la preparazione del substrato test CER nella Sezione 2 sotto. Preparare ciascuna di queste soluzioni di elevate soluzioni concentrazione azionari; Le concentrazioni consigliate per soluzioni madre sarà dato in parentesi dopo ogni rispettivo nome chimico elencato. Preparare tutte le soluzioni fresche sulla preparazione del substrato e conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;utilizzo. <ol><li> Per tampone di lisi, preparare una soluzione delle seguenti in Tris 10 mM, pH 7.5 (1 M Tris, pH 7.5 soluzione madre consigliato): 100 mm scloruro di odium (NaCl, 1 M soluzione madre), 10 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, EDTA 500 mm, pH 8.0 soluzione madre), 0,5% NP-40 (10% soluzione madre), 0,5% desossicolato (DOC, 10% soluzione madre ). </li><li> Per buffer di conversione, preparare una soluzione di 0,05% sodio dodecil solfato (SDS, 10% soluzione madre) e 0,5% Triton X-100 (10% soluzione madre) in 1 tampone fosfato salino (PBS, 10, pH 7.4 soluzione stock). </li><li> Per le soluzioni caotropici, preparare due 3 M soluzioni di guanidina cloridrato (GdnHCl, 8 m stock) in 1x PBS (10x soluzione madre). Regolare il pH di una delle soluzioni di 3,5 ± 0,05 con acido cloridrico concentrato (HCl). Verificare che il pH della seconda soluzione rimane a pH 7,4 ± 0,05 e regolare utilizzando idrossido concentrato HCl o di sodio (NaOH) se necessario. </li></ol> 2. Preparare CER Assay substrato Pairs <ol><li> Ottenere tessuto cerebrale sano, non-TSE-infettati da specie di interesse e preparare un volume peso-per-10%(W / v) omogenato in tampone di lisi utilizzando uno dei seguenti metodi: Dounce, branello-mulino, o mortaio e pestello omogeneizzazione. Ulteriori definire risultante omogenati sottoponendoli a siringa e ago omogeneizzazione, usando aghi di calibro crescente fino substrato può essere aspirato ed espulsa con facilità attraverso un ago di siringa G 27. <ol><li> Per sottofondi preparati da roditori e altri piccoli mammiferi, omogeneizzare tutto il cervello (s); per substrati preparati da grandi mammiferi, utilizzare OBEX (tronco encefalico) tessuto da preparare omogeneizzati. Quando si seleziona la quantità di omogenato cerebrale, preparare non più del 50% della capacità della centrifuga utilizzata per precipitazione delle proteine ​​nel passo 2.6. </li><li> Se la qualità del tessuto cerebrale acquisita è discutibile, valutare i livelli di PrP C da SDS-PAGE 16 e immunoblot 17 prima del substrato di preparazione. </li></ol></li><li> Dividere omogenato cervello in due volumi uguali a tubi conici di plastica etichettati separati. Aggiungi GdnHCl (3 M soluzioni in 1 PBS) a pH 3,5 o 7,4 a ciascuna provetta in un rapporto 1: 1 volume di omogenato cerebrale. </li><li> Controllare i valori di pH delle due soluzioni. Regolare il pH del pH 3.5 ± substrato a pH 0,05 con HCl concentrato. Assicurarsi che il pH del altro substrato rimane a pH 7,4 ± 0,05 e regolare il pH se necessario con HCl o NaOH come necessario. Evitare di superamento dei valori di pH da giudiziosa aggiunta di acido o di base. </li><li> Ruotare soluzioni in un mixer end-over-end a temperatura ambiente (RT) per 5 ore. </li><li> Precipitato proteico aggiungendo quattro volumi di metanolo alle soluzioni substrato in ogni provetta conica, vortex per miscelare bene, e incubare a -20 ° C per 16-18 ore. </li><li> Campioni di sedimento di centrifugazione a 13.000 xg per 30 min a 4 ° C. Decantare con cautela e scartare il surnatante e lasciare evaporare il metanolo dai pellet. Utilizzare applicatori con punta di cotone per aiutare ad assorbire metanolo aggrappato alla parte interna del tubo. Non permettere pellets di over-dry e una volta metanolo non è più visibile, procedere al passo successivo. </li><li> Pellets proteine ​​Risospendere in tampone di conversione. Utilizzare una quantità di tampone di conversione pari alla quantità di omogenato cerebrale materiale di partenza erogato in ogni provetta nel passo 2.2. NOTA: E &#39;fondamentale che il buffer di conversione usato per risospendere pellet di proteine ​​sia da pH 3,5 e preparati substrato 7,4-trattati è la soluzione di cui al precedente punto 1.2 (che contiene bassi livelli di detersivi e un pH fisiologico). </li><li> Soluzioni brevemente agli ultrasuoni substrato in un sonicatore cuphorn (10 sec al ~ 30% di potenza massima), aliquota in 0,5-1,0 ml di volume in etichetta 1,5 ml microprovette. Eseguire un immunoblot controllo di qualità (passo 2.9) su un&#39;aliquota di ciascun substrato. Conservare le altre aliquote a -80 ° C fino al momento di effettuare test CER (sezione 4). </li><li> Eseguire il controllo della qualità su coppie substrato CER prima dell&#39;uso (Figura 2). Questi passaggi assicurano che substrati CER saranno provide risultati ottimali in studi di conversione. <ol><li> Garantire quantità comparabili di PrP C nei due substrati. Confronta i livelli di PrP in 10-25 ml di ogni substrato mediante SDS-PAGE 16 e immunoblotting 17. Se i livelli di proteine ​​nel pH 7.4 e 3.5 supporti si trovano a circa il 10% di ogni altro, le coppie substrato sono appropriati per l&#39;utilizzo in studi CER. NOTA: Le immunoblots PrP non dovrebbero mostrare la prova di un&#39;eccessiva degradazione PrP C. L&#39;immunoreattività PrP dovrebbe essere principalmente&gt; 20 kDa. Bands meno di questa massa molecolare possono essere prodotti di degradazione. Modelli banding dovrebbero essere più o meno equivalente tra coppie substrato. </li><li> Come la PrP C in entrambi i substrati dovrebbe essere sensibile PK, trattare 10-25 microlitri di ciascun substrato con PK ad una concentrazione finale di 100 mg / ml e digerire campioni a 1,000 rpm a 37 ° C per 1 ora in termo-shaker. Valutare qualsiasi segnale PrP rimanente SDS-PAGE 16 e immunoblotting 17.Substrati con res PrP non sono adatti per l&#39;utilizzo in studi CER. </li></ol></li></ol> 3. Preparare TSE Agente Seeds <ol><li> Ottenere tessuto cerebrale TSE-infettati da specie di interesse e di preparare un 10% (w / v) omogeneizzato in 1x PBS pH 7.4 con le modalità di cui al punto 2.1. NOTA: Semi potrebbero essere ottenuti anche da altri tessuti infetti da TSE fuori del sistema nervoso centrale, tuttavia, l&#39;efficienza di conversione del cervello derivato substrati da semi derivati ​​da tessuti periferici TSE-infette non è ancora stata valutata sperimentalmente nella letteratura pubblicata. </li><li> Aliquota risultante omogeneizzato (s) in 100-300 volumi microlitri in 0,5 ml provette da microcentrifuga e conservare a -80 ° C fino al momento di eseguire il test CER. </li></ol> 4. CER Assay NOTA: Il test CER comporta aggiunta di una quantità relativamente piccola di PrP TSE (fornito nel &quot;seme&quot;) da una speciein un eccesso relativo di PrP C (fornito nel cervello non infette &quot;substrato&quot;) da un&#39;altra specie che è stato parzialmente denaturati a pH 3.5 o 7.4. Dopo un periodo di incubazione prolungato tremante, la conversione template-driven di PrP C da PrP TSE in ogni reazione è valutata dal segnale densitometrica di PrP res rimanente dopo PK digestione e la rilevazione immunoblot. Confrontando livelli res PrP nei substrati precedentemente denaturate a pH 3,5 contro 7,4 fornisce una misura della barriera di specie. Una panoramica sperimentale di questa procedura di analisi è fornito in Figura 1. <ol><li> Lentamente scongelare infetti coppie substrato CER (test richiede volumi uguali di substrati precedentemente denaturato sia a pH 3.5 e 7.4) e le soluzioni di semi TSE-infetti mettendoli sulla cima di un letto di ghiaccio (a circa 1 ora di tempo disgelo). </li><li> Una volta completamente scongelati, aspirare e poi espellere ogni soluzione substrato attraverso un27 G siringa più volte a ri-omogeneizzare. Brevemente agli ultrasuoni ogni soluzione seme TSE-infettati per 10 secondi al ~ 30% di potenza massima. Tenere tutte le soluzioni sul ghiaccio mentre si prepara reazioni di conversione. </li><li> Label 5 singoli, pareti sottili tubi basso legame PCR per agente TSE in fase di sperimentazione. </li><li> Preparare reazioni di conversione in questi tubi aggiungendo 5 ml di soluzione al 10% di semi TSE-infetta a 95 ml di (a) substrato CER preparati a pH 7,4 e (b) substrato CER preparati a pH 3,5. <ol><li> Per ogni campione sperimentale, preparare reazioni parallele a coppie substrato CER precedentemente denaturato sia a pH 3,5 e 7,4. </li><li> Ottimizzare i rapporti di TSE seme agente per substrato cervello infetto attraverso la determinazione empirica. Seme Comune: rapporti substrato impiegati mantengono un volume totale di reazione di 100 ml e comprendono 1:99 microlitri, 2:98 e 5:95 ul ul. Per la maggior parte delle applicazioni, il seme 5:95 microlitri: rapporto volume del substrato è adeguato ed è quello che si presenta in thè il protocollo. </li></ol></li><li> Preparare tre campioni di controllo per agente TSE in fase di test nel modo seguente: (a) aggiungere 5 ml di soluzione al 10% di semi di TSE-infetta al buffer di conversione 95 microlitri come controllo per ingresso res PrP; aggiungere buffer di conversione 5 ml a 95 ml di substrato preparato a (b) pH 3.5 (c), pH 7,4 come controlli per non-specifico, la conversione non su modelli. </li><li> Brevemente vortice ogni campione nella sua provetta PCR chiuso mescolare semi e substrato bene. Seguire con un impulso momentaneo in una bassa velocità da banco mini-centrifuga per rimuovere qualsiasi volume della miscela di reazione intrappolato nel coperchio provetta PCR. </li><li> Caricare i campioni in tubi PCR singolarmente etichettati in un banco top termo-shaker attrezzato per accettare provette PCR. Agitare campioni a 1,000 rpm a 37 ° C per 24 ore. </li><li> Dopo agitazione, aggiungere sarcosile ad una concentrazione finale del 2% (w / v) e PK ad una concentrazione finale di 100 mg / ml. Campioni Digest a 1,000 rpm a 37 ° C per 1 ora in termo-shaker. NOTE: aggiunta di sarcosile campioni aiuti post-conversione in PK digestione di PrP C. Segnali positivi falsi in campioni non teste di serie (punto 4.5) sono virtualmente eliminati con l&#39;aggiunta di sarcosile. </li><li> Aggiungere tampone campione SDS-PAGE, campioni di calore a 95 ° C per 5 minuti e risolvere rimanenti PrP res in ciascun campione mediante SDS-PAGE seguita da immunoblotting 16 17. NOTA: Dopo l&#39;aggiunta di tampone campione e riscaldamento, i campioni possono essere immediatamente elaborato o campioni possono essere conservati a -20 ° C o -80 ° C prima di immunoblotting. Tutti i dati qui presentati sono stati generati utilizzando i sistemi di gel e di trasferimento Novex NuPAGE. I singoli campioni del test CER sono stati trattati con il tampone e la riduzione dell&#39;agente secondo le istruzioni del produttore. I campioni sono stati successivamente riscaldati a 95 ° C per 5 min e 30 microlitri di ciascun campione sono stati caricati in un 12% bis-tris gel prefabbricati. </li><li> Calcolare il rapporto efficienza di conversione (CER) come misurabarriera di specie. Misura i livelli di res PrP di densitometria 17 e dividono la densità totale del campione pH 7,4 da quella del campione di 3,5 pH. Moltiplicare per 100 per produrre una percentuale. </li><li> Compilare i dati da repliche sperimentali indipendenti di generare una media CER ± deviazione standard per una specie con un determinato agente TSE. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per il completamento di questo protocollo, occorre prestare attenzione ai livelli PrP C nel tessuto cerebrale infetto usato per la preparazione del substrato (fase 2.1.2) e il seme al substrato rapporto per le reazioni di conversione (passo 4.4.2). Nella nostra esperienza, cervello possono essere estratte per uso come substrato CER dopo un sostanziale periodo post-mortem, purché PrP C è presente per immunoblotting (Figura 4). In effetti, alcuni autolisi è stato osservato nel cervel...

Encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE, malattie prioniche) sono un gruppo di malattie neurodegenerative fatali con periodi di incubazione lunghi che interessano una varietà di animali ed esseri umani. L&#39;agente eziologico putativo di TSE comprende un isomero misfolded della proteina prionica host (PrP) che è in grado di auto-propagazione per conversione template-driven della forma cellulare normale PrP (PrP C) in una, associata malattia infettiva forma (PrP TSE) che si accumula nei tessuti del sistema nervoso centrale dell&#39;ospite infettato 1. Prioni mammiferi infettive in genere trasmettono da host-to-host in modo specifico per le specie, che ha dato origine al concetto di &quot;TSE specie barriera&quot; limitare gli eventi di trasmissione interspecie 2. I fattori biologici della barriera prione specie non sono ben compresi. Sequenza aminoacidica somiglianza tra il infettiva PrP TSE e l&#39;host PrP C cUn&#39;influenza fortemente se conversione avviene 3-5, ma rimane insufficiente per spiegare tutti gli eventi di trasmissione dei prioni osservati in vivo 6,7. Così, la caratterizzazione delle barriere di specie TSE ha largamente invocato studi di provocazione animale: esporre animali ingenui da una determinata specie di prioni da un altro e misurando il tempo di incubazione risultante per l&#39;insorgenza della malattia e il tasso di attacco come indicatori di efficienza di trasmissione. I topi che esprimono PrP C da specie eterologhe sono utilizzati anche per questo tipo di studio 8. I costi associati alla produzione di topo transgenico e biotest prioni prolungati, così come le considerazioni etiche di utilizzo degli animali, sono ostacoli alla ricerca sperimentale di TSE barriere di specie. Valutazione della barriera di specie umana di TSE si basa su topi ingegnerizzati per esprimere umana PrP C. Questi topi richiedono periodi di incubazione lunghi a soccombere alle TSE o modifiche al T umaniegli molecola PrP C umana per la malattia rapida insorgenza 9. Periodi di incubazione delle EST non umano in questi topi possono estendersi oltre la normale durata di vita del mouse facendo interpretazione dei risultati negativi difficili. I primati non umani sono stati utilizzati anche come proxy per lo studio delle barriere di specie umane, ma questi studi sono irto le stesse sfide degli altri tipi di sperimentazione animale e primati non umani non può ricapitolare precisamente malattia procede nell&#39;ospite umano. Analisi su animali rimangono il metodo &quot;gold standard&quot; per misurare la suscettibilità di una specie di TSE, ma gli ostacoli, i costi e l&#39;etica di questi studi su animali vivi hanno costretto indagini alternative. Un certo numero di saggi in vitro, basati sulla valutazione della conversione di ospitante PrP C ad una proteinasi K (PK) Stato -resistenti (res PrP) quando seminato da PrP TSE, sono stati sviluppati e utilizzati per studiare TSE spECIES barriere 10-12. Esempi di saggi in vitro includono test cell-free di conversione, proteine ​​misfolding di amplificazione ciclica (PMCA), e il rapporto di efficienza di conversione (CER) dosaggio 10-14. Anche se nessuno di questi test tiene conto di fattori periferici coinvolti in barriere di specie dopo l&#39;infezione naturale, tutto può essere utile per identificare gli host potenzialmente sensibili per le TSE. Qui vi presentiamo il protocollo per il test CER, in cui due substrati denaturati PrP C derivati ​​da normali omogenati cerebrali sono utilizzati in reazioni di conversione prione banco (Figura 1) 13. PrP C nel substrato denaturato a pH 7,4 può essere convertito solo res PrP da PrP TSE seminate nella reazione in assenza di una barriera di specie 14. Al contrario, denaturazione di PrP C in altro substrato a pH 3.5 permette di essere convertito PrP res seguente incubazionecon PrP TSE da qualsiasi specie e serve come controllo per la conversione. Il rapporto di conversione di PrP C res PrP in pH 7,4 substrato rispetto a quella del substrato pH 3.5 fornisce una misura della barriera di specie. Abbiamo scoperto che il test CER predice noto barriere di specie di topi di laboratorio per varie TSE e hanno utilizzato il test nel tentativo di prevedere la barriera di specie di numerose specie di mammiferi, tra cui pecore bighorn, alla malattia del dimagrimento cronico (CWD) e altre TSE 14, 15. Gli investigatori interessati in uno strumento che consenta il rapido screening delle TSE specie barriere o valutazione della conversione PrP C-to-PrP res troveranno questa metodologia utile.

<table><tbody><tr><td>Gel 12% Bis-Tris SDS-PAGE</td><td>Life Technologies</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>Perle di ossido di zirconio da 0,5 mm</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td>Altre varietà di perle sono efficaci Anche</td></tr><tr><td>gli anticorpi</td><td>vari fornitori</td><td></td><td>Seleziona gli anticorpi primari e secondari appropriati per la rilevazione immunoblot di PrPres da specie di interesse</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td> <td>di perlineIl prossimo articolo Advance</td><td>BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coltro</td><td>369434</td><td>Alta velocità con controllo della temperatura</td></tr><tr><td>Tubi conici</td><td>di qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applicatore con punta in cotone</td><td>Uline</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore Cuphorn</td><td>Sistemi di calore-Ultrasonics</td><td>W-380</td><td>Sistemi di calore-Ultrasonics, Inc. è ora Qsonica, LLC</td></tr><tr><td>Densitometria programma software</td><td>UVP</td><td>Vision Works LS Software di acquisizione e analisi delle immagini</td><td>Anche altri programmi, come NIH ImageJ, funzioneranno</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore Dounce</td><td>Kimble Chase</td><td>885300</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore end-over-end</td><td>Labnet International</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetra acetico</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-770</td><td>Sostanza chimica pericolosa: irritazione oculare</td></tr><tr><td>Guanidina cloridrato, 8 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24115</td><td>Sostanza chimica pericolosa: tossicità acuta, irritazione della pelle, irritazione degli occhi</td></tr><tr><td>Blocco riscaldante</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435570</td><td>Sostanza chimica pericolosa:</td></tr><tr><td>acido forte tampone per campioni di dodecil solfato di litio, 4x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td>Sostanze chimiche pericolose: pelle e irritazione respiratoria, gravi lesioni oculari, solido infiammabile</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Sostanza chimica pericolosa: tossicità acuta, liquido infiammabile</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>di qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifuga</td><td>Labnet International</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroil-sarcosina (sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L-5125</td><td>Sostanze chimiche pericolose: tossicità acuta, irritazione della pelle, danni agli occhi</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Amresco</td><td>M158</td><td>Sostanze chimiche pericolose: irritazione della pelle, danni agli occhi</td></tr><tr><td>Sistema di gel SDS-PAGE</td><td>Life Technologies</td><td>Sistema di elettroforesi NuPAGE Altri</td><td>sistemi SDS-PAGE funzioneranno anche</td></tr><tr><td>con provette PCR (a basso legame</td> )<td>Axygen</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td> <td>a pestelloFisher Scientific</td><td>03-392-106</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH</td><td>Sentron</td><td>SI600</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in polivinildifluoruro</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Promega</td><td>V3021</td><td>Sostanze chimiche pericolose: irritazione della pelle e degli occhi, sensibilizzazione respiratoria, tossicità d'organo</td></tr><tr><td>Agente riducente per campioni SDS-PAGE, 10x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6750</td><td>Sostanza chimica pericolosa: tossicità acuta</td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28364</td><td>Sostanza chimica pericolosa: tossicità acuta, irritazione cutanea, lesioni oculari, solido infiammabile</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Sostanza chimica pericolosa; base forte</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>BD Biosciences</td><td>vari</td><td>Utilizzare siringhe di dimensioni adeguate ai volumi di substrato da omogeneizzare</td></tr><tr><td>Aghi per siringa</td><td>BD Biosciences</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker (agitatore per provette PCR)</td> <td>Hangzhou All Sheng Instruments</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1</td><td>Sostanze chimiche pericolose: pelle, occhi, irritazione respiratoria</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Integra Chemical Company</td><td>T756.30.30</td><td>Sostanze chimiche pericolose: tossicità acuta, irritazione oculare</td></tr><tr><td>Vortice</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

valutare l&#39;encefalopatia spongiforme trasmissibile specie barriere con un<em&gt; in vitro</em&gt; prion protein assay conversion

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Gli studi per comprendere la trasmissione interspecie delle encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE, malattie da prioni) sono impegnativi in quanto in genere si basano su lunghi e costosi studi di provocazione animale in vivo. Sono stati sviluppati numerosi saggi in vitro per aiutare a misurare le barriere tra le specie di prioni, riducendo così l'uso da parte degli animali e fornendo risultati più rapidi rispetto ai biotest sugli animali. Qui, presentiamo il protocollo per un test di conversione rapida dei prioni in vitro chiamato test del rapporto di efficienza di conversione (CER). In questo saggio, la proteina prionica cellulare (PrPC) proveniente da un cervello ospite non infetto viene denaturata sia a pH 7,4 che a 3,5 per produrre due substrati. Quando il substrato a pH 7,4 viene incubato con l'agente TSE, la quantità di PrPC che si converte in uno stato resistente alla proteinasi K (PK) viene modulata dalla barriera della specie dell'ospite originale all'agente TSE. Al contrario, la PrPC nel substrato a pH 3,5 è mal ripiegata da qualsiasi agente TSE. Confrontando la quantità di proteina prionica resistente alla PK nei due substrati, è possibile effettuare una valutazione della barriera di specie dell'ospite. Mostriamo che il test CER predice correttamente le barriere note tra le specie di prioni dei topi di laboratorio e, ad esempio, mostriamo alcuni risultati preliminari che suggeriscono che le linci rosse (Lynx rufus) possono essere suscettibili all'agente della malattia del deperimento cronico del cervo dalla coda bianca (Odocoileus virginianus).

Uso di successo del dosaggio CER dipende in gran parte dalla qualità delle coppie substrato utilizzati nelle reazioni di conversione. Per questo motivo, secondo procedure per preparare CER coppie substrato, un immunoblot controllo di qualità deve essere eseguito (Figura 2). Per entrambi i substrati, dosaggio 10-25 ml per immunoblotting. PrP C dovrebbe essere facilmente rilevabile in ogni substrato e livelli di PrP C deve essere di circa la stessa tra i due. Immunoreattività sarà pr...

Misurare la barriera alla trasmissione interspecie delle malattie da prioni è impegnativo e in genere comporta sfide animali o saggi biochimici. Qui, presentiamo un saggio di conversione della proteina prionica in vitro con la capacità di prevedere le barriere di specie.

Valutare l&#39;encefalopatia spongiforme trasmissibile Specie Barriere con un<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Protein Assay Conversion

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la barriera di specie delle encefalopatie spugniformi trasmissibili, note come TSE, nei confronti di una determinata specie, senza dover sottoporre animali vivi a prove di infezione. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando due substrati per saggi di conversione da utilizzare in un saggio in vitro. Il secondo passaggio consiste nell'incubare questi substrati con gli agenti TSE che si desidera testare successivamente.Dopo la digestione con proteasi K, i campioni vengono sottoposti a elettroforesi SDS-PAGE e immunoblotting. L'ultimo passaggio consiste nel misurare la quantità di proteina PreOn resistente alla proteinasi K in ogni substrato mediante citometria D e confrontare queste quantità calcolando un rapporto di efficienza di conversione, o CER. In definitiva, il CER fornisce una misura della barriera tra specie per il TSE testato rispetto alla specie ospite da cui è stato preparato il substrato.I vantaggi di questo saggio includono il basso costo, il breve lasso di tempo sperimentale e la sostituzione di animali vivi con campioni di tessuto. Sebbene questo metodo sia particolarmente adatto a fornire informazioni sull

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Qui si descrive un nuovo metodo di analisi per monitorare l'assorbimento del prione e del traffico da parte delle cellule immunitarie subito dopo l'inoculazione intraperitoneale purificando e fluorescente etichettatura aste prioni aggregati da materiale cerebrale infetto allora monitoraggio loro adozione, e il movimento dal sito di iniezione e caratterizzare le cellule che mediano questi eventi.

Monitoraggio Traffico di cellule immunitarie fluorescente Rods prioni ore dopo l&#39;infezione intraperitoneale

Misfolding amplificazione proteina ciclica (PMCA) è un test in vitro per lo studio della conversione prionica e barriere deformazione e specie. Può anche essere usato come un test di rilevazione prione.

Proteine ​​ciclica Amplificazione misfolding di prioni

Incubare con un enzima proteolitico per digerire i prioni normali, lasciando intatti gli aggregati resistenti.

Rilevamento di aggregati di proteine prioniche mal ripiegati nel tessuto cerebrale di topo mediante Western blotting

Spazzini hanno un potenziale di traslocare infettive trasmissibili prioni dell'encefalopatia spongiforme nelle loro feci in aree indenni. Abbiamo metodi di dettaglio utilizzati per determinare se i prioni scrapie mouse adattati rimangono contagiosi dopo il passaggio se il tratto digestivo di corvi americani (Corvus brachyrhynchos), un consumatore comune di animali morti.

Procedure per l&#39;identificazione Infettive prioni dopo il passaggio attraverso l&#39;apparato digerente di una specie aviaria

La propagazione di aggregati proteici simile ai prioni è recentemente emersa come implicata in molte malattie neurodegenerative. L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere come utilizzare il nematode C. elegans come sistema modello per monitorare la diffusione delle proteine e per studiare fenomeni simili ai prioni.

Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello<em&gt; C. elegans</em

Questo protocollo descrive una metodologia di alto-rendimento allo schermo funzionalmente per base di proteine di ereditarietà in S. cerevisiae.

High throughput Screening per eredità a base di proteine in S. cerevisiae

Qui, presentiamo un protocollo per descrivere una tecnica di amplificazione del prion semplice, veloce ed efficiente, il metodo di conversione indotta da tremare in tempo reale (RT-QuIC).

In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

L'immunomarcatura della proteina prionica anomala utilizzando protocolli immunoistochimici richiede specifiche metodologie di preparazione di campioni e anticorpi anti-PrP. Il presente protocollo descrive i passaggi chiave del demasking degli epitopi per garantire una corretta etichettatura immunologica della PrP e per ridurre al minimo la colorazione di fondo non specifica. Inoltre, questo approccio considera le misure di biosicurezza quando si conducono studi di immunoistochimica con i...

Rilevazione di proteine prioniche anomale mediante immunoistochimica

Manca un metodo per valutare le aree comunemente utilizzate in laboratorio per la contaminazione da prioni e un'efficace decontaminazione. Il protocollo qui descritto fornisce i fondamenti chiave per l'implementazione di un test di sicurezza con strisciamento di prioni di laboratorio che può essere facilmente modificato per soddisfare le esigenze individuali di laboratori specifici.

Test di strisciamento del laboratorio di sicurezza dei prioni

Descriviamo un modello murino del disturbo post traumatico da stress (PTSD) che rivela le alterazioni persistenti della funzione neuroendocrina e del ritardato a lungo termine, di risposta paura esagerata, caratteristici dei pazienti con PTSD. Il modello animale e metodi descritti qui sono utili per correlare biomarcatori nei nuclei del cervello, che sono meccanicistica ma non possono essere misurati nei pazienti, con biomarcatori nelle periferie globuli bianchi, che può.

Biomarcatori in un modello animale per Rivelare correlati neurali, ematologiche, e comportamentali di PTSD

Scopri un saggio in vitro per valutare le barriere di specie nelle encefalopatie spongiformi trasmissibili senza utilizzare animali. Questo metodo misura il rapporto di efficienza di conversione per prevedere i rischi di trasmissione interspecifica.

Valutare l'encefalopatia spongiforme trasmissibile Specie Barriere con un

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