Valutare l'encefalopatia spongiforme trasmissibile Specie Barriere con un

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la barriera di specie delle encefalopatie spugniformi trasmissibili, note come TSE, nei confronti di una determinata specie, senza dover sottoporre animali vivi a prove di infezione. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando due substrati per saggi di conversione da utilizzare in un saggio in vitro. Il secondo passaggio consiste nell'incubare questi substrati con gli agenti TSE che si desidera testare successivamente.

Dopo la digestione con proteasi K, i campioni vengono sottoposti a elettroforesi SDS-PAGE e immunoblotting. L'ultimo passaggio consiste nel misurare la quantità di proteina PreOn resistente alla proteinasi K in ogni substrato mediante citometria D e confrontare queste quantità calcolando un rapporto di efficienza di conversione, o CER. In definitiva, il CER fornisce una misura della barriera tra specie per il TSE testato rispetto alla specie ospite da cui è stato preparato il substrato.

I vantaggi di questo saggio includono il basso costo, il breve lasso di tempo sperimentale e la sostituzione di animali vivi con campioni di tessuto. Sebbene questo metodo sia particolarmente adatto a fornire informazioni sulle barriere di specie delle malattie da prioni selvatiche, può essere applicato a qualsiasi altra specie di interesse. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà nella preparazione del substrato, nel controllo di qualità e nella standardizzazione.

Dopo aver ottenuto tessuto cerebrale sano e non infetto dalla specie di interesse, preparare un omogenato al 10% peso/volume in buffer di lisi utilizzando un macinino a sfere o un mortaio e pestello. Successivamente, affinare ulteriormente gli omogenati sottoponendoli a un'omogenizzazione con siringa e ago, utilizzando aghi di calibro crescente fino a quando il substrato possa essere aspirato ed espulso con facilità attraverso un ago da siringa calibro 27. In seguito, dividere l'omogenato cerebrale in due volumi uguali in due provette coniche di plastica separate e contrassegnate, e aggiungere in ciascuna provetta cloridrato di guanidina 3 M in XPBS a pH 3,5 o 7,4 in rapporto volumetrico uno a uno rispetto all'omogenato cerebrale.

Ora, verificare i valori di pH delle soluzioni di substrato e utilizzare acido cloridrico concentrato o idrossido di sodio, secondo necessità, per garantire che il pH di ciascun substrato rimanga entro ± 0,05 dal pH obiettivo. Ruotare le soluzioni su un agitatore end-over-end a temperatura ambiente per cinque ore. Successivamente, precipitare le proteine aggiungendo quattro volumi di metanolo alle soluzioni di substrato in ciascun vortice conico, mescolare bene e incubare a -20 gradi Celsius per 16-18 ore.

Dopo l'incubazione, sedimentare i campioni mediante centrifugazione a 13.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, decantare con attenzione e scartare i supernatanti S e lasciare evaporare il metanolo dai pellet. Utilizzare applicatori di cotone per aiutare ad assorbire il metanolo aderente all'interno del tubo.

Non permettere che i pellet si secchino eccessivamente. Procedere al passaggio successivo quando il metanolo non è più visibile, utilizzando una quantità di buffer di conversione pari alla quantità di materiale iniziale di omogenato cerebrale per risospendere i pellet proteici. Dopo la risospensione, sottoporre brevemente le soluzioni di substrato a sonificazione per 10 secondi.

In un corno a coppa, sottoporre a sonica al circa 30% della potenza massima. Quindi aliquotare le soluzioni in volumi da 0,5 a 1 millilitro in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro etichettate, poiché la proteina prionica cellulare in entrambi i substrati dovrebbe essere sensibile alla proteinasi K. Trattare da 10 a 25 microlitri di ciascun substrato con proteinasi K a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro e digerire i campioni a 1000 giri al minuto a 37 gradi Celsius per un'ora nel termoagitatatore; caricare i substrati digeriti con proteinasi K, insieme a da 10 a 25 microlitri di ciascun substrato non digerito.

Su una gel di elettroforesi SDS-PAGE, eseguire un blocco immuno con un anticorpo specifico per la proteina prionica per valutare la proteina prionica dell'ospite, la resistenza alla proteinasi K e i livelli di proteina non digerita. Questa immagine mostra i risultati del blot immuno. Le prime due corsie contengono i substrati non digeriti e le due corsie a destra contengono il substrato digerito con la proteinasi K.

Se i livelli proteici nei substrati a pH 7,4 e 3,5 sono approssimativamente entro il 10% l'uno rispetto all'altro e non sono resistenti alla proteinasi K, le coppie di substrati sono adatte per essere utilizzate negli studi di CER; conservare altri aliquote a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'esecuzione del saggio CER. Gli agenti TSE devono essere manipolati adottando adeguate precauzioni di biosicurezza e seguendo le linee guida istituzionali. Dopo aver ottenuto il tessuto cerebrale infetto da TSE dalla specie di interesse, preparare un omogeneato al 10% peso su volume in un PBS a pH 7,4 utilizzando il metodo di omogeneizzazione precedentemente impiegato per la preparazione delle coppie di substrati.

Trasferire gli omogenati risultanti in volumi da 100 a 300 microlitri in provette microcentrifuga da 0,5 millilitri e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'esecuzione del saggio CER. Per iniziare, scongelare lentamente quantità uguali del substrato CER non infetto a pH 3,5 e 7,4, delle coppie e delle soluzioni di inizializzazione infette da TSE, posizionandole sopra un letto di ghiaccio per circa un'ora. Dopo lo scongelamento, mantenere le soluzioni sul ghiaccio e riomogeneizzarle aspirando ed espellendo ciascuna soluzione di substrato attraverso un ago da siringa calibro 27.

Quindi sottoporre brevemente a sonica ciascuna soluzione infetta da TSE per 10 secondi a circa il 30% della potenza massima. Successivamente, preparare le reazioni di conversione in provette PCR a pareti sottili e a basso legame, etichettate, pipettando 95 microlitri di substrato CER preparato a pH 7,4 in duplicato in due delle provette e 95 microlitri di substrato CER preparato a pH 3,5 in duplicato in altre due provette.

Quindi aggiungere cinque microlitri di soluzione di seme infetto al 10% TSE a un tubo per ciascun substrato a pH 7,4 e 3,5. Parallelamente, aggiungere cinque microlitri di buffer di conversione all'altro tubo per ciascun substrato a pH 7,4 e 3,5, per controllare la conversione non specifica e non templata. Inoltre, preparare un controllo per la proteina prionica resistente alla proteinasi K in ingresso.

Per ogni agente TSE in fase di test, aggiungere cinque microlitri di soluzione di seme infetto al 10% TSE a 95 microlitri di buffer di conversione come controllo. Vortexare brevemente ogni campione nel suo tubo PCR chiuso, con toe e substrato. Procedere quindi con un'impulso momentaneo in una mini centrifuga da banco a bassa velocità per rimuovere qualsiasi volume della miscela di reazione intrappolato nel coperchio del tubo PCR.

Caricare i tubi in un agitatore termoregolato da banco predisposto per accogliere provette PCR e agitare i campioni a 1000 giri al minuto a 37 gradi Celsius per 24 ore; il giorno successivo, aggiungere sarco cell a una concentrazione finale del 2% peso/volume e proteinasi K a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro; digerire i campioni a 1000 giri al minuto a 37 gradi Celsius per un'ora nell'agitatore termoregolato. Aggiungere il tampone campione per SDS-PAGE, riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per 10 minuti e separare la proteina PreOn resistente alla pronasi K rimanente in ciascun campione mediante SDS-PAGE, seguito da immunoblotting come in precedenza. Infine, calcolare il rapporto di efficienza di conversione come misura della barriera tra specie.

Secondo le istruzioni riportate nel protocollo scritto, il substrato per il saggio CER preparato a pH 7,4 o 3,5 è stato incubato con RML adattato al topo, scrapie ovina domestica, scrapie classica, malattia da wasting cronica del cervo coda bianca o ceppo 263K di hamster adattato allo scrapie. Nel saggio CER, i campioni di controllo etichettati come nessuno contenevano una quantità uguale di agente infettivo e nessun campione di substrato murino è stato analizzato per la presenza di proteina prionica resistente alla proteinasi K mediante immunoblot con l'anticorpo monoclonale SAF 83.

I valori grezzi di tric per ogni campione sono visualizzati al di sotto di ciascuna corsia risultante dalla proteinasi. I livelli di proteina prionica resistente alla proteinasi K sono risultati variabili tra i diversi substrati murini, denaturati a pH 7,4 e inoculati con diversi agenti TSE. Sebbene la proteina prionica resistente alla proteinasi K sia stata riscontrata in tutti i substrati, denaturati a pH 3,5 e inoculati con un agente TSE, questo istogramma mostra i rapporti medi più o meno la deviazione standard tra i substrati murini a pH 7,4 e 3,5 per ciascun agente infettivo, basati su almeno tre ripetizioni indipendenti del saggio.

Le lettere minuscole indicano sottoinsiemi statisticamente omogenei determinati da un valore p inferiore a 0,05 mediante analisi della varianza. Con il metodo delle differenze significative minime di Tookie Kramer, una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 48 ore se effettuata correttamente. Il saggio CER può essere utilizzato come valutazione iniziale dell'esistenza di una barriera di specie TSE che potrebbe giustificare o rendere superflui ulteriori studi in animali vivi.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i substrati, impostare le reazioni di conversione e calcolare i rapporti di efficienza di conversione per valutare le barriere tra specie.