Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An In Vitro Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare cellule staminali di derivazione adiposa e cocolture di gangli della radice dorsale o di neuroni DRG per lo studio della rigenerazione nervosa in vitro. Ciò si ottiene ottenendo prima cellule staminali di derivazione adiposa indifferenziate dal tessuto adiposo di ratto. Nella seconda fase, le cellule vengono differenziate in cellule simili a schwan utilizzando un cocktail di fattori di crescita.

Successivamente, i neuroni DRG vengono raccolti da un midollo spinale di ratto e associati nella fase finale, i neuroni vengono posizionati sulle cellule staminali differenziate per generare il sistema di co-coltura in vitro. Infine, le cellule vengono colorate per i marcatori neuronali e gliali per facilitare la crescita dei neuriti, la quantificazione e vengono visualizzate mediante microscopia elettronica a scansione per la valutazione morfologica. Questo metodo può aiutare a rispondere a diverse domande nel campo della medicina rigenerativa, ad esempio come le cellule staminali adipose e giuste interagiscono con i neuroni organoganali ug su diversi biomateriali?

Il motivo per cui la dimostrazione di questo metodo è fondamentale perché comporta passaggi difficili da apprendere a causa della scarsa accessibilità e delle piccole dimensioni dei tessuti in un armadio biologico. Inizia usando un paio di forbici e una lama di rasoio sterile per tritare finemente il grasso viscerale e inguinale raccolto dai ratti maschi adulti di spro dolly in una consistenza fine. Successivamente, trasferire l'impasto grasso risultante in una provetta contenente 15 millilitri di filtro appena preparato, una soluzione di collagenasi sterilizzata di tipo uno e posizionare una provetta in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius in agitazione continua per 30-60 minuti.

Monitorare attentamente la digestione, interrompendo prima che il tessuto sia completamente dissociato per migliorare la vitalità e la resa cellulare. Quando il tessuto è pronto, filtrarlo attraverso un colino cellulare da 100 micron. Una buona digestione si tradurrà in una consistenza omogenea dei grassi che appare beige con un leggero vortice.

Neutralizzare gli enzimi digestivi con 15 millilitri di terreno di crescita delle cellule staminali a 37 gradi Celsius integrato con FBS. Quindi centrifugare le cellule per raccogliere la frazione vascolare stromale. Aspirare il supinato partendo dallo strato superiore di grasso.

Risospendere il pellet in un millilitro di tampone ISIS per globuli rossi con pipettaggio. Dopo un minuto, interrompere la lisi aggiungendo 10 millilitri di fresco, terreno e centrifugare nuovamente alle cellule. Ora aspirare con cura il surnatante S.

Risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno e seminare le cellule in 75 centimetri quadrati. Palloni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Mantenere le cellule a livelli sub confluenti fino al primo o al secondo passaggio in cui le cellule sono pronte per la differenziazione in cellule simili a schwan mediante trattamento con etanolo beta more cap e acido retinoico per ottenere i neuroni DRG dopo aver raccolto il midollo spinale.

Inizia rimuovendo tutte le parti dorsali e poi usa forbici chirurgiche sterili e affilate per dividere la colonna vertebrale a metà lungo l'asse longitudinale, esponendo il tessuto del midollo. Tagliare la colonna vertebrale in due segmenti più piccoli sotto il livello della gabbia toracica, quindi utilizzare una pinza fine per rimuovere delicatamente tutto il tessuto del cordone. Facendo attenzione a non tirare e rimuovere le radici DRG, che appaiono come filamenti bianchi che escono direttamente dai canali.

Una volta rimosso tutto il tessuto centrale, utilizzare una pinza molto sottile per estrarre l'intera radice DRG, raggiungendo in profondità i canali verticali e facendo attenzione a non danneggiare le radici dei gangli. Metti il DRG in un piatto di 60 millimetri quadrati contenente tre o quattro millilitri di prosciutti F 12 medium integrati con antibiotici. Quindi, sotto un microscopio da dissezione, utilizzare una pinza sterile e un bisturi per eliminare le radici nervose in eccesso che circondano i gangli per ridurre la contaminazione delle cellule satelliti.

Quindi, trasferire il DRG in una capsula di Petri da 35 millimetri quadrati contenente 1,8 millilitri di terreno F 12 fresco e aggiungere 200 microlitri di collagenasi. Soluzione madre di tipo quattro. Incubare il DRG per un'ora e poi aspirare accuratamente il terreno con una pipetta di vetro.

Facendo attenzione a non aspirare o danneggiare il DRG. Ripetere il passaggio della collagenasi e lavare il DRG con F 12 medium. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 1,8 millilitri di terreno F 12 e 200 microlitri di tripsina alle cellule.

Rimuovendo la tripsina e aggiungendo un millilitro di terreno integrato con 500 microlitri di FBS per arrestare la reazione enzimatica. Quindi aspirare il terreno e lavare delicatamente il DRG con F 12 medium tre volte per rimuovere ogni traccia del siero. Ora alimenta le cellule con due millilitri di terreno F 12 fresco e usa una pipetta di vetro per trasferire con cura la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri.

Pipettare su e giù da otto a 10 volte per dissociare delicatamente i neuroni e quindi lasciare che il palato si accumuli sul fondo del tubo quando il palato si è stabilizzato. Trasferire il supinato in un nuovo tubo e aggiungere al palato due millilitri di F 12 medium fresco. La ripetizione della dissociazione meccanica e il trasferimento del fluido nella sospensione diventano omogenei.

Quindi ricalibrare la sospensione cellulare tre o quattro volte, seguita dalla filtrazione della sospensione omogeneizzata risultante attraverso un filtro cellulare da 100 micron in un nuovo tubo da 50 millilitri. Centrifugare le cellule in una provetta da 15 millilitri mentre girano lentamente, pipettare appena preparate. 15% di albumina sierica bovina all'interno di un tubo da 15 millilitri, tenuto a un angolo di 45 gradi per creare una scia proteica graduale.

Utilizzando i numeri sul tubo come riferimento per la traccia di formazione, aspirare quindi la staffetta dalle cellule, risparmiando gli ultimi 500 microlitri per il ressus, sospendendo il pellet e dispensando lentamente le cellule lungo la scia proteica nel nuovo tubo. Dopo aver fatto girare le cellule, risospendere nuovamente il pellet in un millilitro di terreno BS modificato e seminare le cellule in un piccolo volume di terreno. In una piastra a 24 pozzetti per due ore, quando le cellule si sono attaccate, aggiungere un terreno BS fresco integrato con 15 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita nervoso dopo la dissociazione.

Le cellule DRG possono anche essere utilizzate per la co-coltura con le cellule staminali adipose simili a cellule di cigno seminandole sopra le cellule pre-semina. Queste immagini dimostrano l'importanza delle cellule staminali adipose simili a cellule di schwan per la germinazione di DRG Neurite in un modello di co-coltura che utilizza film di policaprolattone come substrati. Non sono stati osservati neuriti su superfici non trattate in assenza di cellule staminali adipose simili a cellule di cigno, mentre la formazione dei neuriti è stata chiaramente migliorata nel sistema di co-coltura.

In media, il numero di neuriti per corpo cellulare aumenta significativamente in presenza di cellule staminali. Infatti, come illustrano queste immagini, la capacità dei neuroni DRG di far germogliare i neuroni avviene preferenzialmente in combinazione con cellule staminali differenziate, come indicato dalle frecce gialle rosa. Quindi, dopo aver visto questo video, ora dovrebbe essere in grado di ottenere cellule staminali derivate e di dissociare i neuroni DGen.

Ma dovresti anche essere in grado di impostare un modello da studiare nella degenerazione media periferica.