Name: Ex utero elettroporazione e Organotipica Fetta Cultura del mouse ippocampale Tissue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Impara l'elettroporazione ex utero e la coltura di fette organotipiche per studiare la regolazione genica nello sviluppo ippocampale del topo. Questo metodo consente di etichettare e modificare singole cellule nel giro dentato.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft a SB (BR-2215; SFB 497/A9).

NOTA: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la legge tedesca e sono stati approvati dagli uffici governativi di Tübingen. 1. Preparazione di Micropipette, soluzioni e membrane <ol><li> Preparazione di Micropipette <ol><li> Tirare micropipette di vetro con un estrattore micropipetta con il seguente programma: Heat: 540, Pull: 125, Velocità: 20 e Delay: 140. Gli importi lunghezza dell&#39;ago a 5,5 centimetri. </li><li> Aghi conici con un Micromacinatore per ottenere un formato di punta adeguata di 4 mm. Conservare gli aghi in una scatola o 15 centimetri piastra di Petri per evitare di danneggiare le punte. </li></ol></li><li> Preparazione delle soluzioni <ol><li> Soluzione DNA plasmidico <ol><li> Preparare DNA plasmide contenente il costrutto cDNA desiderato utilizzando un kit Maxi-prep gratuito Endotoxin secondo il protocollo del produttore. </li><li> Regolare soluzione plasmide DNA per una concentrazione finale di 3 mg / mL (senza GFP spike vettoriale) o 4 mg /pl (con 1 mg di GFP picco vettore) in endotossine liberare tampone Tris-EDTA contenente verde veloce (concentrazione finale 0,05%). </li></ol></li><li> Soluzione laminina Archivio <ol><li> Sciogliere 1 mg di laminina in acqua sterile fino ad un volume finale di 1 ml. Preparare aliquote di 100 microlitri e conservare a -80 ° C. </li></ol></li><li> Poly-L-lisina soluzione Stock <ol><li> Sciogliere 50 mg di poli-L-lisina in 50 ml di acqua sterile ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. Preparare 1 ml aliquote e conservare a -20 ° C. </li></ol></li><li> Completa soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS Complete) <ol><li> Preparare Complete HBSS combinando 100 ml di 10x HBSS, 2,5 ml di buffer di 1 M HEPES (pH 7.4), 30 ml di 1 M D-glucosio, 10 ml di 100 mM CaCl 2, 10 ml di 100 mm MgSO 4, e 4 ml di 1 M NaHCO 3. Aggiungere acqua sterile fino a 1 L e conservare a 4 ° C. NOTA: Autoclave tutte le soluzioni tampone aspettarsi 1 M HEPES e 1 M D-glucosio, che sono filter sterilizzato. </li></ol></li><li> Fetta Cultura Media <ol><li> Preparare fetta mezzo di coltura con l&#39;aggiunta di 35 ml di basale medio Aquila, 12,9 ml di completo HBSS (1.2.4), 1,35 ml di 1 M D-glucosio, 250 ml di 200 mM L-glutammina, e 500 ml di penicillina streptomicina per ottenere un volume finale di 50 ml. Aggiungi siero di cavallo a una concentrazione finale di 5% e conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Low-Punto di fusione (LMP) Agarose <ol><li> Preparare una soluzione di agarosio al 4% LMP aggiungendo 2 g di agarosio LMP a 50 ml di HBSS completa (1.2.4) seguita da riscaldamento in un forno a microonde per 1-2 minuti ad alta potenza. Conservare la soluzione in un bagno di acqua a 37-39 ° C. Conservare la soluzione a 4 ° C e il riutilizzo. </li></ol></li><li> Paraformaldeide Solution <ol><li> In una cappa preparare una soluzione al 4% paraformaldeide (PFA) aggiungendo 4 g di paraformaldeide a 100 ml di PBS 1x. Riscaldare la soluzione a 60 ° C e aggiungere qualche goccia di NaOH 1 N fino a quando la soluzione diventa clear. </li></ol></li><li> Permeabilization Solution <ol><li> Sciogliere 9 g di BSA in 300 ml di 1x PBS contenente 0,3% Trition X-100 e conservare a 4 ° C. Aggiungere 10% di sodio azide per la conservazione a lungo termine. </li></ol></li></ol></li><li> Rivestimento di membrana Inserti <ol><li> Diluire un&#39;aliquota di soluzione laminina magazzino (1.2.2) ed una aliquota della soluzione madre poli-L-lisina (1.2.3) in acqua sterile per un volume finale di 12 ml. </li><li> Mettere inserti di membrana in 6 pozzetti con ogni ben contenente 2 ml di acqua sterile. Aggiungere 1 ml di soluzione di rivestimento sulla parte superiore della membrana e incubare O / N a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. </li><li> Dopo incubazione lavare la membrana inserisce tre volte con 1 ml di acqua sterile e asciutta. Utilizzare inserti membrana rivestiti nello stesso giorno o conservare a 4 ° C per un massimo di quattro settimane in un 6 piastra ben asciutta. </li></ol></li></ol> 2. iniezione DNA ed elettroporazione di E15.5 e E18.5 embrioni <ol><li&gt; Anestetizzare volta accoppiato topo femmina ponendolo in una camera anestetizzante saturata con 5% isoflurano e collegato ad un vaporizzatore. Circolare isoflurano e ossigeno ad una velocità di 1 L / min. Tenere l&#39;animale in scatola per 2-4 minuti o fino a quando inconscia che viene testato da pizzicare tra le zampe del mouse. </li><li> Euthanize il mouse inconscio dislocazione cervicale giorno embrionale (E) 15.5 o 18.5. Sezionare l&#39;utero contenente gli embrioni 13 e metterlo in una capsula di Petri contenente 15-20 ml di freddo completo HBSS. NOTA: Da questo punto in poi, a mantenere gli embrioni e tessuti su ghiaccio. </li><li> Utilizzare un paio di forbici per separare ogni embrione dal corno uterino e posto in un secondo piatto di Petri contenente freddo completa HBSS. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, recidere la parete muscolare dell&#39;utero e la placenta con un paio di pinze sottili (# 55) e forbici. Staccare con cautela l&#39;embrione dal sacco vitellino. </li><li> Utilizzare un paio di forbici a Bonn decapitate gli embrioni appena sopra gli arti anteriori ad un angolo di 60 °. Se l&#39;esperimento richiede genotipizzazione degli embrioni, raccogliere un campione di tessuto per l&#39;isolamento del DNA genomico (un piccolo pezzo di coda). </li><li> Trasferire la testa di una capsula di Petri pulita e asciutta. Perché la testa era stata decapitata in un angolo di 60 °, la testa deve inclinarsi da un lato, quando sono immessi dorsale verso l&#39;alto. </li><li> Inserire un ago con attenzione in mezzo dell&#39;emisfero vicino al bregma (Figura 1A, B). Iniettare circa 2-3 microlitri (a 3 o 4 mg / mL) di soluzione di DNA dal passo sul pedale del picospritzer III utilizzando 30 libbre di pressione per la durata del 10-15 msec per impulso, applicando impulsi di 5-8. La durata e il numero degli impulsi dipende dal diametro dell&#39;apertura dell&#39;ago con aperture più piccole che richiedono più tempo. L&#39;intervallo tra ogni impulso è pari a 1 sec. </li><li> Prima di posizionare gli elettrodi, applicare alcune gocce di completo HBSS sulla testa del embryo. Posizionare gli elettrodi in modo tale che il terminale &#39;negativo&#39; è sullo stesso lato come il ventricolo iniettato e l&#39;elettrodo &#39;positiva&#39; sul lato opposto del ventricolo iniettato sotto l&#39;orecchio della testa dell&#39;embrione (Figura 1C, D). Applicare 5 impulsi di 50 V. <ol><li> Utilizzare 3 elettrodi mm per E 15,5 e 5 elettrodi mm per E 18,5. </li></ol></li></ol> 3. La dissezione del cervello <ol><li> Dopo l&#39;elettroporazione, staccare la pelle dalla testa con l&#39;aiuto di un paio di pinze sottili. Utilizzando un paio di forbici molla fare una piccola incisione nel mezzo del cervelletto alla linea mediana del cranio. </li><li> Inserire le forbici primavera nell&#39;incisione e tagliare longitudinalmente lungo la sutura sagittale. Staccare il cranio e staccare il cervello dal cranio, utilizzando una pinza sottile. Trasferire l&#39;intero cervello in 15-20 ml fredda soluzione completa HBSS. </li><li> Nel frattempo, versate 4% LMP agarosio,mantenuti a 37-39 ° C in un bagno d&#39;acqua, in uno stampo pelabile. </li><li> Prendete il cervello dalla completa HBSS da una piccola paletta spatola e drenare l&#39;eccesso di HBSS utilizzando carta velina fine o Kimwipes. </li><li> Posizionare l&#39;intero cervello delicatamente nel agarosio e regolarne la posizione con un ago sottile. Mantenere lo stampo in ghiaccio fino al agarosio è solidificato e il blocco viene sezionato (per le sezioni coronali bulbi olfattivi punto up). </li></ol> 4. Vibratome Sezioni e Slice Cultura <ol><li> Tagliare i blocchi agarosio LMP e incollarli alla fase provino con &#39;super colla&#39;. Dopo che la colla è secca la fase di trasferimento del campione al vassoio buffer vibratome e riempire con ghiaccio freddo completare HBSS finché il blocco viene immerso nella soluzione. NOTA: Sterilizzare tutte le superfici degli strumenti e macchinari con il 70% di etanolo prima sezionamento. </li><li> Preparare 250 micron sezioni vibratome spesse con una nuova lama come seguito. <ol><li> Tagliare il blocco with le seguenti impostazioni; Frequenza - 60 Hz, ampiezza - 0,7 micron, velocità 16-18 mm / sec. Tagliare le sezioni contenenti il ​​tessuto desiderato con le impostazioni di cui sopra a bassa velocità (9 mm / sec). Avvio del sezionamento del hindbrain, raccogliere 5-7 sezioni del cervello. </li><li> Trasferire le sezioni per un piatto di cultura 6 ben pulito contenente 5 ml di ghiaccio freddo completare HBSS con l&#39;aiuto di una spatola piegata e tenere in ghiaccio fino a tutte le sezioni sono raccolte (Figura 1E). </li></ol></li><li> Bagnare la membrana in modo incrociato con 100 ml di HBSS completa prima di sezioni sulla membrana, per facilitare l&#39;orientamento delle sezioni. </li><li> Trasferire le sezioni usando una spatola piegata sulla membrana (prendere un angolo della sezione con una pinza e tirare sulla spatola e poi usare il forcipe per spingere la sezione sulla membrana). Luogo fino a cinque sezioni su una membrana e di organizzare, utilizzando una pinza (Figura 1F). Non sovrapporre le sezioni tra loro. <ol><li> Prendere l&#39;eccesso di HBSS fuori della membrana con una pipetta. Le membrane specifici utilizzati qui sono fissati ad un telaio e inserite nella piastra di coltura tissutale, che permette il tessuto di essere in contatto, ma non coperti dal mezzo. </li></ol></li><li> Posizionare gli inserti membrana in una piastra da 6 pozzetti contenenti 1,8 ml di terreno di coltura fetta (1.2.5) (Figura 1G, H). Incubare la piastra di coltura a 37 ° C con 5% di CO 2 per 11 o 14 DIV DIV. Cambiare metà del mezzo (0,9 ml) a giorni alterni. NOTA: In questa fase, aggiungere i reagenti come Bromodeossiuridina (BrdU; 10 micron concentrazione finale) per l&#39;etichettatura cellule proliferanti ai media per il primo 20 ore del tempo di cultura. </li></ol> 5. Fissazione delle Sezioni Seguito da immunofluorescenza colorazione <ol><li> Utilizzare una lama di bisturi pulito e affilato per tagliare e tagliare le membrane a seconda dell&#39;orientamento disezioni. </li><li> Trasferire sezioni con la membrana ad una piastra 24 pozzetti contenenti 1 ml di 4% PFA (1.2.7). Incubare le sezioni per 1 ora a RT seguito da 3 lavaggi con PBS 1x per 15 min ciascuno. Incubare sezioni O / N con la soluzione di permeabilizzazione a 4 ° C con agitazione. </li><li> Il giorno seguente, incubare le sezioni con anticorpi primari appropriati, diluito in soluzione permeabilizzazione, O / N o per 48 ore a 4 ° C con agitazione. </li><li> Lavare le sezioni 3 volte per 15 min con 1x PBS e incubare O / N a 4 ° C con gli opportuni anticorpi secondari diluito in soluzione permeabilizzazione. </li><li> Dopo l&#39;incubazione con anticorpi secondari, lavare una volta con sezioni 1x PBS per 15 minuti seguita da colorazione DAPI per 10 min. </li><li> Lavare le sezioni 3 volte con 1x PBS per 15 minuti ciascuno e trasferire al microscopio diapositive. Aggiungere ImmunoMount e delicatamente posto un coprioggetto sopra le sezioni. Asciugare il slides O / N a 4 ° C e seal con smalto. NOTA: Mantenere le diapositive sempre a 4 ° C. <ol><li> Analizzare le culture fetta di microscopia confocale (Figura 1I). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
<li>Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell+and+fiber+layers+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).</li>
<li>Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatally+born+granule+cells+numerically+dominate+adult+mice+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus.</a> Neuroscience. 148, 593-598 (2007).</li>
<li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+dentate+gyrus%3A+what+we+are+learning+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants.</a> Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).</li>
<li>Hsieh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+transcriptional+control+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis.</a> Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).</li>
<li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+dentate+gyrus+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis.</a> Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).</li>
<li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li>
<li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+function+of+Bcl11b%2FCtip2+in+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> Embo J. 31, 2922-2936 (2012).</li>
<li>Pilaz, L. J., Silver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+mitosis+in+the+developing+mouse+embryonic+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Hand, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-62 (2005).</li>
<li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), 19(2002).</li>
<li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J Vis Exp. (2), (2007).</li>
<li>Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+germinal+matrices+in+the+developing+dentate+gyrus+are+composed+of+neuronal+progenitors+at+distinct+differentiation+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages.</a> Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).</li>
<li>Lechler, T., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmoplakin%3A+an+unexpected+regulator+of+microtubule+organization+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis.</a> J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).</li>
<li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants%3A+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

L&#39;ippocampo ha una funzione importante nell&#39;apprendimento e nella memoria. Il giro dentato è anche una delle due regioni del cervello in cui si verifica la neurogenesi non solo durante lo sviluppo, ma anche in età adulta. Postnatale e adulti procede neurogenesi dell&#39;ippocampo in modo simile che coinvolge molti fattori comuni. Definizione dei meccanismi regolatori di questi fattori sarà molto utile per capire le malattie neurodegenerative che a sua volta portare a nuove terapie e misure preventive. Per ottene...

L&#39;ippocampo gioca un ruolo importante nella memoria e dell&#39;apprendimento e comportamento emotivo. Una funzione principale consiste consolidamento della memoria a breve termine in memoria a lungo termine, che richiede alta plasticità del sistema nervoso. Il giro dentato dell&#39;ippocampo agisce come gateway principale per le informazioni in ingresso ed è anche una delle due regioni cerebrali con la neurogenesi in corso in tutta l&#39;età adulta 1,2. Lo sviluppo della struttura dell&#39;ippocampo si verifica durante l&#39;embriogenesi tardiva e in particolare durante la prima 3 a 4 settimane postnatale 3. Durante lo sviluppo iniziale del giro dentato un pool di cellule staminali è istituito a richiesta per postnatale e adulta neurogenesi 4. Neuroni in via di sviluppo passano attraverso varie fasi, dalla cellule staminali attraverso diverse fasi di cellule progenitrici per la immatura e, infine, il neurone maturo durante postnatale e neurogenesi adulta. Alle diverse fasi della neurogenesi l&#39;espressione digeni specifici è necessario per consentire la maturazione e l&#39;integrazione dei nuovi neuroni nei circuiti dell&#39;ippocampo 5,6. Utilizzando genetica del topo e analisi fenotipo mediante immunoistochimica e metodi molecolari consentiti definire il pattern di espressione e la funzione di molti di questi geni. Inoltre l&#39;analisi microarray e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) fornito informazioni sui potenziali geni bersaglio diretti e indiretti 7,8. Tuttavia, ci sono ancora molte questioni aperte riguardanti i meccanismi di regolazione dello sviluppo dell&#39;ippocampo, in particolare lo sviluppo del giro dentato. Per ottenere una visione di come i geni specifici sono regolati è necessario un sistema che permette la manipolazione di un piccolo numero di cellule da down o up-regolazione del gene di interesse e / o dei suoi geni bersaglio e seguire il loro destino durante lo sviluppo. In utero elettroporazione di shRNAs, cDNA di geni di interesse o Cre recombinase fornisce un tale strumento. Per assicurare la presenza del DNA desiderato o piccoli RNA plasmidi di espressione dovrebbe essere utilizzato per elettroporazione. Questo approccio è implementata con successo in studio dello sviluppo corticale 9,10, ma è un approccio più impegnativo esaminando lo sviluppo del giro dentato causa della posizione delle strutture ippocampali negli strati più profondi del cervello. Elettroporazione utero Ex seguita dalla cultura fetta organotipica è un approccio per aggirare questo problema 11,12. In contrasto in utero non elettroporazione tutta dell&#39;embrione ma solo la testa è usato permettendo quindi di posizionare gli elettrodi in modo più favorevole per dirigere la shRNA / DNA verso l&#39;ippocampo e giro dentato. Il nostro gruppo impiegato con successo ex utero elettroporazione per studiare il ruolo del fattore di trascrizione Bcl11b durante lo sviluppo giro dentato 8. Bcl11b ha un duplice ruolo in sviluppo giro dentato per regulating proliferazione delle cellule progenitrici nonché la differenziazione come è stato dimostrato da immunoistochimica. Per definire ulteriormente un meccanismo di coinvolgimento Bcl11b in questi processi, protocolli del gruppo Polleux 11,12 sono stati adeguati per studiare giro dentato come descritto di seguito nella sezione del protocollo. In un primo approccio alla questione è stata affrontata se Bcl11b regolamenta autonomamente cellule differenziamento delle cellule neuronali. Un secondo approccio esaminato se desmoplakin, un gene bersaglio diretto di Bcl11b, è sufficiente per salvare il fenotipo Bcl11b.

<table><tbody><tr><td>Estrattore per micropipette fiammeggiante / marrone</td><td>Sutter Instruments Company (USA)</td> <td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro fine Warner</td><td>Instruments</td><td>G100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige, Giappone</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Unità di staffa per anestesia</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0412</td><td></td></tr><tr><td>Halovet Vaporizzatore</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0398</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac System</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0387</td><td></td></tr><tr><td>IMS Fluosorber</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0415</td><td></td></tr><tr><td>Camera di anestetizzazione</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0460</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore</td><td>BEX Company</td><td>CUY21 EDIT</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta con elettrodi a disco</td><td>BEX Company</td><td>LF650P3</td><td>Elettrodi da 3 mm per Pinzetta E15.5</td></tr><tr><td>con elettrodi a disco</td><td>BEX Company</td><td>LF650P5</td><td>elettrodi da 5 mm per E18.5</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>P/N 052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>HM 650 V Microtomo a lama vibrante, 230 V</td><td>Thermo Scientific</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Carl Zeiss Microscopy Gmbh</td><td>Stemi SV8</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Leica</td><td>Leica DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td>Sp5II</td><td></td></tr> piastra a <tr><td>6 pozzetti</td><td>BD Falcon</td><td>#353502</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 6 pozzetti</td><td>CELLSTAR#</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Inserti per colture tissutali</td><td>BD Falcon</td><td>#353090</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>#L2020</tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>#P5899</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Bonn extra fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Dumont #55</td><td>11255-20 Inox</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Life Technology</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Life Technology</td><td>Codice 41010-26</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero elettroporazione e organotipica fetta cultura del mouse ippocampale tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

La genetica del topo offre un potente strumento per determinare il ruolo di geni specifici durante lo sviluppo. L'analisi dei fenotipi risultanti mediante metodi immunoistochimici e molecolari fornisce informazioni sui potenziali geni bersaglio e sulle vie di segnalazione. Per chiarire ulteriormente specifici meccanismi regolatori è necessario un sistema che consenta la manipolazione di un piccolo numero di cellule di un tessuto specifico mediante sovraespressione, ablazione o reintroduzione di geni specifici e segua il loro destino durante lo sviluppo. Per ottenere questo risultato ex utero, l'elettroporazione delle strutture ippocampali, in particolare il giro dentato, seguita da una coltura organotipica a fette, fornisce un tale strumento. L'utilizzo di questo sistema per generare delezioni a mosaico consente di determinare se il gene di interesse regola i processi di sviluppo in modo autonomo delle cellule come la proliferazione delle cellule progenitrici o la differenziazione neuronale. Inoltre, facilita il salvataggio dei fenotipi reintroducendo il gene deleto o i suoi geni bersaglio. A differenza dell'elettroporazione in utero, l'approccio ex utero migliora la velocità di colpire con successo gli strati più profondi del cervello come il giro dentato. Nel complesso, l'elettroporazione ex utero e la coltura di fette organotipiche forniscono un potente strumento per studiare i meccanismi di regolazione in un ambiente semi-nativo che rispecchia le condizioni endogene.

Ablazione del fattore di trascrizione Bcl11b causa la perdita di valore della proliferazione delle cellule progenitrici e la differenziazione neuronale con conseguente dimensioni giro dentato ridotto e il numero di cellule. Inoltre neuroni mutanti non riescono a integrarsi nel circuito dell&#39;ippocampo causando l&#39;apprendimento e la memoria di valore 8. Per rispondere alle domande riguardanti il meccanismo di regolazione (s) di Bcl11b in questi processi ex elettroporazione utero è stato...

Qui presentiamo un protocollo che fornisce uno strumento per esaminare i meccanismi di regolazione di geni specifici durante lo sviluppo dell'ippocampo. L'impiego dell'elettroporazione ex utero e della coltura organotipica di fette consente l'up- e down-regolazione dell'espressione di geni di interesse in singole cellule e segue il loro destino durante lo sviluppo.

Ex utero elettroporazione e Organotipica Fetta Cultura del mouse ippocampale Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare e modificare singole cellule del giro dentato e seguirne lo sviluppo. Questo viene ottenuto innanzitutto iniettando DNA in un emisfero del cervello al giorno embrionale 15,5 o 18,5. Il secondo passaggio consiste nell'elettroporazione del DNA iniettato nell'area in via di sviluppo del giro dentato.In seguito, si preparano sezioni cerebrali utilizzando un vibratome e si mantengono le fette cerebrali in coltura fino a 14 giorni. L'ultimo passaggio consiste nella colorazione immunofluorescente delle fette cerebrali mediante anticorpi specifici. Infine, si utilizza la microscopia confocale a immunofluorescenza per evidenziare le modifiche delle cellule granulari modificate nel giro dentato in via di sviluppo.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della neurobiologia, come il ruolo di geni specifici nello sviluppo di particolari cellule neuronali in diverse aree cerebrali. Nel nostro caso, il fattore di trascrizione BC 11 B nello sviluppo del giro. Iniziare la procedura sezionando l'utero di un topo sacrificato, che contiene gli embrioni.Posizionarlo in una piastra di Petri contenente da 15 a 20 millilitri di HBSS completo freddo su ghiaccio. Successivamente, utilizzare un paio di forbici per separare ogni embrione dall'utero. Quindi, posizionarlo in una seconda piastra di Petri contenente HBSS completo freddo sotto un microscopio stereoscopico e recidere la parete muscolare uterina.Rimuovere con attenzione l'embrione dalla sacca vitellina e dalla placenta. Successivamente, utilizzare un paio di forbici da chirurgo per decapitare gli embrioni appena sopra gli arti anteriori con un angolo di 60 gradi.Se l'esperimento richiede il genotipaggio degli embrioni, raccogliere un campione di tessuto per l'isolamento del DNA genomico. Successivamente trasferire la testa in una piastra di Petri pulita e asciutta. Poiché la testa è stata decapitata con un angolo di 60 gradi, dovrebbe inclinarsi da un lato quando viene posizionata con il lato dorsale verso l'alto.Ora inserire con attenzione un ago al centro dell'emisfero, vicino al bgma. Iniettare circa due-tre microlitri di soluzione di DNA premendo il pedale del pico spritzer. Tre, utilizzando una pressione di 30 pound per la durata di 10-15 millisecondi per impulso.Applicare da cinque a otto impulsi con un secondo di intervallo tra un impulso e l'altro. Prima di posizionare gli elettrodi, applicare alcune gocce di HBSS completo sulla testa dell'embrione O. Quindi posizionare gli elettrodi in modo che il terminale negativo si trovi dallo stesso lato del ventricolo iniettato e l'elettrodo positivo sul lato opposto del ventricolo iniettato, al di sotto dell'orecchio della testa dell'embrione. Successivamente, applicare cinque impulsi di 50 volt.Dopo l'elettroporazione. Posizionare la testa dell'embrione in una piastra contenente da 15 a 20 millilitri di soluzione fredda di HBSS completa. Rimuovere la pelle dalla testa dell'embrione.Quindi effettuare un piccolo taglio nella parte centrale del cervelletto lungo la linea mediana del cranio. Inserire le forbici a molla nell'incisione e tagliare longitudinalmente lungo la sutura sagittale. Staccare il cranio e rimuoverlo, separando il cervello dal cranio stesso.Nel frattempo, versare l'agarosio LMP al 4% in uno stampo rimovibile ed eliminarlo a temperatura ambiente. Prelevare il cervello dall'HBSS completo mediante una spatola piccola e rimuovere l'eccesso di HBSS con carta da filtro fine o un fazzoletto chimico. Posizionare delicatamente l'intero cervello all'interno degli stampi in agarosio e aggiustarne la posizione con un ago sottile.Mantenere lo stampo sul ghiaccio fino a quando l'agar rosa si è solidificato e il blocco è stato sezionato. Ora tagliare il blocco di agarosio LMP e incollarlo sulla piattaforma del campione utilizzando colla istantanea. Dopo che la colla si è asciugata, trasferire la piattaforma del campione al vassoio del tampone nel vibratomo. Riempirlo con HBSS completo ghiacciato fino a quando il blocco è immerso nella soluzione. Per prepararsi al taglio, impostare il vibratomo sulle impostazioni appropriate. Tagliare i settori contenenti il tessuto desiderato a velocità ridotta, partendo dal cervelletto, e raccogliere da cinque a sette sezioni dal cervello.Quindi trasferire i frammenti in una piastra da coltura sterile a sei pozzetti contenente cinque millilitri di HBSS completo freddo di ghiaccio e mantenerla sul ghiaccio fino al completamento del prelievo di tutti i frammenti. Successivamente, posizionare gli inserti con membrana in una piastra a sei pozzetti contenente 1,8 millilitri di mezzo per colture di frammenti. Inumidire la membrana in senso incrociato con 100 microlitri di HBSS completo prima di posizionare i frammenti sulla membrana, al fine di facilitarne l'orientamento.Successivamente, trasferire i campioni sulla membrana. Posizionare fino a cinque campioni su una singola membrana, senza sovrapporli tra loro. Rimuovere l'eccesso di HBSS dalla membrana utilizzando una pipetta.Incubare la piastra colturale a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 11 o 14 giorni in vitro e sostituire metà del mezzo ogni due giorni. A questo stadio, aggiungere al mezzo reagenti come il bromodesossiuridina per etichettare le cellule in proliferazione, durante le prime 20 ore del periodo di coltura. In questo passaggio, utilizzare una lama di bisturi pulita e affilata per tagliare la membrana in base all'orientamento delle sezioni.Trasferire i campioni insieme alla membrana in una piastra a 24 pozzetti contenente un millilitro di PFA al 4% e incubare i campioni per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, lavarli tre volte con PBS 1X, per 15 minuti ogni lavaggio. Quindi, incubare i campioni tutta la notte con soluzione permeabilizzante a quattro gradi Celsius con agitazione delicata; il giorno seguente, incubare i campioni con le opportune soluzioni diluite di anticorpi primari in soluzione permeabilizzante, per tutta la notte o per 48 ore a quattro gradi Celsius con agitazione delicata.In seguito, lavare le sezioni tre volte per 15 minuti ciascuna con XPBS 1X e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius con gli opportuni anticorpi secondari, diluiti in soluzione permeabilizzante. Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni una volta con XPBS 1X per 15 minuti, seguito da colorazione con DAPI per 10 minuti; alla fine, lavare nuovamente le sezioni tre volte con XPBS 1X per 15 minuti ciascuna e trasferirle su vetrini. Aggiungere il mezzo di montaggio immuno e delicatamente.Posizionare un coprioggetto sopra le sezioni. Asciugare i vetrini per tutta la notte a quattro gradi Celsius e sigillarli con smalto per unghie prima di analizzarli mediante microscopia confocale. Qui viene mostrata l'iniezione di DNA che esprime GFP in un emisfero, seguita da colorazione immunoistochimica al giorno 18,5 dopo elettroporazione.Questa immagine mostra la colorazione DPI e la colorazione GFP è mostrata in questa immagine e l'immagine sovrapposta è mostrata qui. Questa figura mostra l'eliminazione a mosaico di BCL 11 B mediante elettroporazione in utero, seguita da coltura di fette organotipiche. Le sezioni sono state sottoposte a immunocolorazione utilizzando anticorpi che riconoscono GFP e NeuroD, gli insetti mostrano GFP e BCL 11 B. La colorazione a ingrandimento maggiore dimostra la perdita dell'espressione di BCL 11 B nelle cellule che esprimono la ricombinasi Cre.Di seguito è riportata l'analisi statistica delle cellule positive per GFP, neuro D e GFP neuro D. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore e mezza per quattro embrioni, se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di manipolare con attenzione il tessuto e di evitare contaminazioni.

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-culture-mouse-hippocampal

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Per condurre una rapida valutazione della funzione dei geni nello sviluppo della corteccia cerebrale, si descrivono i metodi che comportano...

Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

Fonte: Keener, D. G., et al. Elettroporazione a singola cellula in diverse colture organotipiche di neuroni eccitatori eccitatori e inibitori specifici di classe dell'ippocampo di topo. J. Vis. Exp. (2020).Questo video mostra il processo di elettroporazione a singola cellula per introdurre il DNA plasmidico nei neuroni all'interno di colture di fette di ippocampo di topo. La procedura prevede il posizionamento preciso della pipetta, la regolazione della pressione e gli impulsi di...

Espressione genica tramite elettroporazione di una singola cellula in colture di fette di ippocampo di topo

Questo video dimostra il protocollo per l'elettroporazione di geni a singola cellula sia nei neuroni eccitatori che in quelli inibitori in una serie di colture di fette di ippocampo in vitro. La tecnica è utile per esaminare specifiche funzioni molecolari e fisiologiche dei neuroni, compresi i meccanismi autonomi delle cellule e le interazioni proteiche transsinaptiche.

Elettroporazione di singole cellule in colture organotipiche di fette di cervello: una tecnica in vitro per fornire plasmidi all'interno di neuroni mirati in fette di ippocampo cerebrale

Questo protocollo descrive un procedimento di espianto che...

Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

Qui si descrive una tecnica per lo studio dell'ippocampo la neurogenesi postnatale utilizzando la tecnica organotipica cultura fetta. Questo metodo permette la manipolazione in vitro di neurogenesi adulta e permette l'applicazione diretta di agenti farmacologici per l'ippocampo in coltura.

Colture organotipiche Slice di studi di post-natale neurogenesi

Questo manoscritto fornisce protocolli che utilizzano in utero elettroporazione (IUE) per descrivere la connettività strutturale dei neuroni a livello di singola cellula e l'eccitabilità dei neuroni fluorescente. Istologia è utilizzato per caratterizzare dendritiche e le proiezioni assonali. registrazione a cellula intera a fette acuta viene utilizzato per studiare l'eccitabilità.

Elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

Descriviamo un protocollo per l'espressione specifica del tipo di cellula del sensore basato su FRET codificato geneticamente ATeam1.03YEMK nelle colture di sezioni organotipiche del prosencefalo del topo. Inoltre, mostriamo come utilizzare questo sensore per l'imaging dinamico dei livelli di ATP cellulare in neuroni e astrociti.

Imaging di ATP intracellulare in fette di tessuto organicino del cervello del topo utilizzando il sensore basato su FRET ATeam1.03YEMK

Presentato qui è un protocollo per l'elettroporazione a singola cellula in grado di fornire geni sia nei neuroni eccitatori che inibitori in una vasta gamma di età della coltura di fette ippocampali in vitro. Il nostro approccio fornisce un'espressione precisa ed efficiente dei geni nelle singole cellule, che può essere utilizzata per esaminare le funzioni cellulari autonome e intercellulari.

Elettroporazione a cella singola attraverso diverse culture di fette organotipiche di neuroni eccitatori ippocampali del topo e specifici della classe

Questo protocollo dimostra un metodo semplice e robusto per studiare la crescita degli assoni in situ e la dinamica dei coni di crescita. Descrive come preparare ex vivo fette di cervello acuto fisiologicamente rilevanti e fornisce una pipeline di analisi di facile utilizzo.

Sul posto Visualizzazione delle dinamiche dei coni di crescita e crescita degli assoni in colture di fette di cervello embrionali ex vivo acute

Impara l'elettroporazione ex utero e la coltura di fette organotipiche per studiare la regolazione genica nello sviluppo ippocampale del topo. Questo metodo consente di etichettare e modificare singole cellule nel giro dentato.

Ex utero elettroporazione e Organotipica Fetta Cultura del mouse ippocampale Tissue

Esplora altri video