Busulfan come mielosoppressiva agente per la generazione stabile ad alto livello di midollo osseo chimerismo nei topi

L'obiettivo generale di questa procedura è sostituire il compartimento del midollo osseo di topi riceventi con cellule del midollo osseo di topi donatori che esprimono ubiquitariamente la proteina verde fluorescente. In assenza di irradiazione. Questo risultato si ottiene innanzitutto condizionando il topo ricevente mediante iniezioni intraperitoneali seriali del composto mielosoppressivo busulfano.

In seguito, le cellule del midollo osseo vengono isolate dai femori e dalle tibie di un topo donatore che esprime ubiquitariamente la proteina verde fluorescente. Infine, le cellule del midollo osseo del donatore vengono trapiantate nel topo ricevente condizionato mediante iniezione nella vena della coda. Alla fine, il sangue viene prelevato dal topo trapiantato e analizzato mediante citometria a flusso per stimare il grado di chimera del midollo osseo.

I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'irradiazione corporea totale, consistono nella possibilità di ottenere un elevato grado di chimera midollare senza gli effetti citotossici dell'irradiazione corporea totale e senza la necessità di strutture e attrezzature specializzate. Questo metodo non solo permette di studiare l'accumulo di cellule di origine midollare nel sistema nervoso centrale, ma può anche essere utilizzato per indagare temi di ricerca come lo sviluppo della linea ematopoietica, l'immunobiologia e la leucemia. Per condizionare i topi riceventi, preparare busulfan diluito secondo il protocollo descritto nel testo ed eseguire un'iniezione intraperitoneale di 20 milligrammi per chilogrammo ai topi riceventi ogni giorno.

Dopo l'eutanasia dei topi secondo le linee guida istituzionali, sotto una cappa a flusso laminare, spruzzare un topo con etanolo al 70%. Sollevare la pelle a livello dell'addome e, con forbici chirurgiche, praticare un'incisione attraverso la pelle dalla cavità addominale, risalendo lungo la gamba verso la caviglia tenendo il piede. Tirare con fermezza la pelle dalla caviglia verso l'anca, esponendo il tessuto della gamba.

Rimuovere con cura il muscolo e il grasso dal femore per esporre l'articolazione dell'anca, tirando delicatamente sul piede. Per estendere l'arto, appoggiare le forbici contro le ossa pelviche e tagliare appena sopra la testa del femore, avendo cura di non recidere il femore stesso. Per favorire il mantenimento della sterilità, tenere l'arto dal piede e rimuovere con le forbici qualsiasi tessuto residuo dal femore, quindi pulire la superficie ossea con tessuti sterilizzati in autoclave.

Separare il femore e la tibia tagliando attraverso l'articolazione del ginocchio e posizionare il femore in una piastra di coltura contenente PBS, incubando sul ghiaccio. Successivamente, rimuovere e scartare la fibula tagliando nei punti in cui essa si collega alla tibia. Poi pulire la tibia.

Rimuovere il piede tagliando la tibia dove termina il midollo rosso, quindi posizionare la tibia nella piastra di coltura insieme al femore e incubare sul ghiaccio. Utilizzare pinze per tenere fermo il femore e, con forbici chirurgiche, rimuovere con cura le estremità distali dell'osso. Asportare la minor quantità possibile di osso per esporre la cavità midollare con tre millilitri di PBS sterile.

Riempire una siringa e applicare un ago da 23 gauge. Inserire con attenzione l'ago nella cavità midollare ed eseguire una lavanda per espellere il midollo osseo in una piastra di coltura sterile. Utilizzare la punta dell'ago per raschiare la cavità midollare, assicurandosi della rimozione di tutte le cellule desiderate dopo l'estrazione.

Assicurarsi che il midollo osseo rosso non sia più visibile e che l'osso appaia ora bianco. Utilizzare una pinza per tenere il perone e, con forbici chirurgiche, raschiare con cura l'estremità dove il perone era attaccato al ginocchio. Per esporre la cavità midollare, riempire una siringa con tre millilitri di PBS sterile e applicare un ago da 25 gauge.

Inserire con attenzione l'ago nella cavità midollare ed estrarre il midollo osseo nella piastra contenente il midollo osseo raccolto dai femori. Con una punta da pipetta da un millilitro, agitare delicatamente il midollo osseo per dissociare le cellule. Far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro a maglia da 40 micron in un tubo da centrifuga sterile da 50 millilitri.

Usare PBS per risciacquare la piastra al fine di recuperare tutte le cellule rimanenti e trasferire il tampone attraverso il filtro nel tubo da centrifuga. Aggiungere PBS al tubo fino a ottenere un volume finale di 30-40 millilitri e centrifugare a 450 ×g e 4 °C per cinque minuti. Rimuovere quindi e scartare il soprannatante.

Risospendere il pellet con tre millilitri di tampone lisante per eritrociti, incubare in ghiaccio per 8,5 minuti. Successivamente, aggiungere circa 30 millilitri di PBS sterile per arrestare l'azione del tampone lisante, centrifugare e scartare il soprannuotato. Utilizzare un millilitro di PBS sterile per risospendere il pellet e mantenere in ghiaccio.

Con PBS diluire una piccola quantità di omogenato cellulare e utilizzare un emocitometro per contare le cellule. Diluire la sospensione cellulare fino a otto volte 10 alla sesta cellule per millilitro e incubare sul ghiaccio fino all'iniezione. Per eseguire il trapianto di midollo osseo, aggiungere 300 microlitri della sospensione cellulare diluita in una siringa da 0,5 millilitri.

Per ogni mouse da iniettare, assicurarsi di rimuovere eventuali bolle d'aria. Posizionare la gabbia del mouse con i soggetti riceventi condizionati su un tappetino riscaldante e lasciare dilatare le vene laterali della coda. Introdurre un mouse ricevente in un dispositivo di contenimento delle dimensioni adeguate, pulire la coda con garza chirurgica imbevuta di etanolo al 70%, afferrare saldamente la coda e inserire delicatamente, con la bisellatura rivolta verso l'alto, l'ago in una delle vene laterali della coda, quindi iniettare la sospensione cellulare.

Tenere una garza chirurgica sul sito di iniezione fino a quando il sanguinamento non si arresta. Prima di trasferire il topo in una nuova gabbia pulita, circa due o tre settimane dopo il trapianto di midollo osseo, posizionare il topo in un tubo di contenimento e rasare il pelo sulla zampa posteriore per esporre la vena safena laterale. Successivamente, applicare uno strato sottile di vaselina sulla zampa e utilizzare un ago da 25 gauge per perforare la vena safena con un capillare rivestito di eparina.

Prelevare circa 50 microlitri di sangue, quindi utilizzare una garza chirurgica per arrestare l'emorragia. Una volta arrestata l'emorragia, restituire il topo nella gabbia. Aggiungere il sangue a un tubo da microcentrifuga contenente un millilitro di buffer fax.

Mescolare il tubo per inversione e conservare in ghiaccio. Centrifugare i campioni di sangue a 900 ×g per cinque minuti. Dopo aver rimosso e scartato il soprannatante, utilizzare 500 microlitri di tampone lisante per eritrociti per risospendere il pellet e incubare in ghiaccio per 8,5 minuti. Successivamente, aggiungere un millilitro di tampone fax per bloccare il tampone lisante e centrifugare a 900 ×g per cinque minuti.

Dopo aver lisato e centrifugato una seconda volta, secondo il protocollo descritto, verificare che il pellet sia ora bianco. Se è rosso, ripetere il passaggio di lisi una terza volta risospendendo. Risospendere il pellet nel buffer fax e utilizzare la citometria a flusso per quantificare la proporzione di cellule positive per GFP.

Questo grafico mostra i livelli di chimera quantificati settimanalmente nel sangue periferico di topi sottoposti a condizionamento con 100 milligrammi per chilogrammo di busulfano e che hanno ricevuto un trapianto di midollo osseo sinnogenico di successo, e di topi sottoposti a condizionamento con 80 milligrammi per chilogrammo di busulfano e che hanno ricevuto un trapianto di midollo osseo allogenico non riuscito. Livelli di chimera superiori all'80% vengono generalmente raggiunti entro tre-quattro settimane dal trapianto di midollo osseo; qui sono riportati dati rappresentativi del sangue periferico che mostrano un trapianto di midollo osseo riuscito e non riuscito a tre settimane dal trapianto. Questi dati di citometria a flusso dimostrano che un elevato grado di chimera permane stabile per almeno un anno nel midollo osseo e che il condizionamento con il veicolo non è sufficiente a indurre la chimera midollare.

Sebbene non vi siano differenze significative nei livelli di chimere midollari ottenuti utilizzando dosi di busulfano comprese tra 60 e 100 milligrammi per chilogrammo, le cellule GFP positive si accumulano nel sistema nervoso centrale in maniera dipendente dalla dose. Questa figura illustra l'accumulo di cellule di origine midollare GFP positive nella regione lombare del midollo spinale in un topo di tipo selvaggio e, in misura maggiore, in un modello murino della malattia neurodegenerativa sclerosi laterale amiotrofica. Quando si attua questa procedura, è importante utilizzare topi riceventi e donatori sinnigenici dello stesso sesso al fine di minimizzare la possibilità di rigetto del trapianto seguendo questa procedura.

Altri metodi come la citometria a flusso e l'immunohistochimica possono essere utilizzati per studiare i meccanismi attraverso cui le cellule derivate dal midollo osseo entrano nel sistema nervoso centrale.