Name: Linfociti Isolamento da Pelle umana per lanalisi fenotipica e Ex Vivo Cell Culture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Impara a isolare linfociti residenti nella pelle umana per analisi fenotipica e coltura ex vivo. Questo metodo efficiente utilizza biopsie cutanee per ottenere cellule vitali per citometria a flusso e studi immunologici.

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biopsie cutanee da pazienti affetti da psoriasi sono stati gentilmente forniti dal Dr. Andreas Koerber (dipartimento di Dermatologia presso l&#39;Università di Essen, Germania) dopo il consenso orale o scritta informato per uso scientifico. XH è anche supportato da NSFC 61.263.039 e 11.101.321 NSFC.

NOTA: Le biopsie cutanee da individui sani sono stati ottenuti da addominale avanzi pelle di individui sottoposti a chirurgia plastica elettiva dopo consenso informato orale o scritta per uso scientifico. L&#39;uso di pelle umana è stato approvato e in conformità con le norme stabilite dai comitati etici medici per la ricerca umana del centro medico dell&#39;Università Radboud, Nijmegen, Paesi Bassi e dell&#39;Università di Essen, in Germania. 1. Preparazione di sospensioni singola cella dalla pelle umana (lavoro sterile in un flusso-armadietto se successiva coltura cellulare è obbligatorio) <ol><li> Preparare terreno di coltura cellulare: RPMI 1640 + penicillina / streptomicina (concentrazioni finali 100 unità / ml e 100 mg / ml, rispettivamente) + piruvato (0,02 mm) e Glutamax (0,02 mm), senza siero aggiunto. </li><li> Preparare terreno di coltura completo: terreno di coltura preparato al punto 1.1 + 10% di siero umano pool (HPS); Conservare a 4 ° C. Portate medie a 20 ° C ± 2 prima di noiing. </li><li> Ottenere la biopsia della pelle utilizzando un round strumento biopsia pugno 4 mm e tenerlo in RPMI1640 terreno di coltura completo a 20 ° C ± 2 per un massimo di 4 ore oppure a 4 ° C ON. Elaborare la biopsia appena possibile all&#39;arrivo in laboratorio. NOTA: più lunga conservazione di pelle influenzerà il rendimento delle cellule e la vitalità delle cellule. </li><li> Etichettare un tubo blu-capped dissociazione e aggiungere 5 ml di terreno di coltura completo nel tubo etichettati. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno di coltura completo in ogni pozzetto (in totale 3 pozzi) di una piastra sterile cultura 6-bene. Utilizzare strumenti sterili per posizionare la biopsia in un singolo pozzetto, lavare, spostarlo verso un secondo pozzo e ripetere questo passo ancora una volta, ottenendo così un totale di tre risciacqui. </li><li> Trasferire la biopsia cutanea ben sciacquati ad una piastra di Petri sterile, aggiungere 100 ml di mezzo di coltura completo sulla parte superiore della biopsia, e con attenzione raschiare il tessuto adiposo sottocutaneo utilizzando un bisturi sterile monouso acciaio inox. NOTA: Thè è un passaggio fondamentale. </li><li> Tagliare ogni biopsia cutanea in 4 pezzi più piccoli su una piastra di Petri sterile. campioni di trasferimento (fino a quattro di biopsie di 4 mm per tubo) al tubo di dissociazione preparato contenente 5 ml di terreno di coltura completo. </li><li> Chiudere bene le provette con il tappo, e collegare testa in giù per la manica del dissociatore tessuti automatizzato. Assicurarsi che tutto il materiale di esempio si trova nella zona del rotore. </li><li> Avviare il processo di dissociazione eseguendo il &quot;programma di m_spleen _01&quot; (un programma predefinito fornito dalla memoria interna dello strumento o tramite la carta del programma accompagnati) per dissociare la biopsia alla velocità di rotazione appropriato per 56 sec. </li><li> Dopo l&#39;elaborazione, staccare il tubo di dissociazione dal dissociatore e assicurarsi che tutto il materiale dissociato viene raccolto sul fondo della provetta. </li><li> Aggiungere 150 microlitri collagenasi IA (80 mg / ml) nel tubo di dissociazione e incubare il campione in un bagno d&#39;acqua a 37° C per 60 min. Aggiungere 100 ml di DNasi I (5 MU / ml) nel tubo thedissociation, mescolare bene. NOTA: maggiore concentrazione di collagenasi o il tempo di incubazione più lungo altererà la vitalità delle cellule. </li><li> Fissare il tubo di dissociazione al manicotto del dissociatore tessuti automatizzati ed eseguire il &quot;programma di m_ milza _01&quot; dissociare la biopsia ancora una volta. </li><li> Inserire un 70 mM colino cella nylon sulla parte superiore di un tubo Falcon 50 ml. Applicare materiali campione dissociati a questo filtro per rimuovere cellule grumi di cellule / tessuti detriti. </li><li> Lavare setaccio cellule una volta con 5 ml di terreno di coltura completo. Centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 10 minuti e aspirare il surnatante. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta. pellet cellulari risospendere in 300 ml di terreno di coltura completo. cella singola sospensioni sono pronti per ulteriori analisi; continuare con protocolli per colture cellulari ex vivo o citometria a flusso di analisi. </li><li> In caso di ulteriore intracellular citochina colorazione, stimolare cellule con PMA (12,5 ng / ml), Ionomicina (500 ng / ml) e brefeldina a (5 mg / ml) per 4 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 4 ore prima di eseguire il flusso analisi di citometria. </li></ol> 2. Polyclonal attivazione delle cellule T della pelle-residente (Ex Vivo Cell Culture) <ol><li> Aliquota sospensioni monocellulari 100 pl (preparata al punto 1.15) in un piatto fondo rotondo a 96 pozzetti. NOTA: Per ciascuna mm biopsia 4 pelle, le sospensioni monocellulari acquisiti possono essere suddivisi in almeno due pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere anti-CD3 / anti-CD28 mAb microsfere rivestite (25.000 perle per bene), ricombinante citochina umana rIL-2 (concentrazione finale 25 U / ml) e rIL-1b (concentrazione finale 50 ng / ml). </li><li> Coprire la piastra di coltura con un coperchio piatto ben etichettato-, incubare 5% di CO 2, 100% di umidità, 37 ° C incubatore. Cambiare media quando il colore medio si trasforma in giallo. <br/&gt; Nota: Una colonia a cellule chiare si può osservare dal giorno 8 di coltura cellulare. </li></ol> 3. Citometria a flusso Analisi di primaria / coltura le cellule della pelle-Resident T <ol><li> Preparare FACS buffer: PBS + 0,2% di BSA. </li><li> Trasferire le cellule di interesse in una piastra a 96 pozzetti v-bottom. Centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 100 ml di PBS. Centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante. </li><li> cellule macchia con 100 ml di eFluorescence780 preparati coniugati risolvibile colorante vitalità (1: 1000 diluizione utilizzando PBS) a 4 ° C per 30 min. Aggiungere 100 pl di tampone FACS, centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante. </li><li> Scegliete il termine anticorpi monoclonali marcatore di superficie delle cellule, per esempio: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 01:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 01:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1,10), e CD1c-APC (AD5-8E7, 1,10), preparare gli anticorpi monoclonali miscela utilizzando tampone FACS in base ad ogni fattore di diluizione mAb testato. Definire le impostazioni del cancello utilizzando il controllo isotipo di anticorpo insieme con il campione non macchia. </li><li> Aggiungere 25 ml di anticorpi monoclonali preparato miscela in ciascun pozzetto. Incubare 20 minuti a 20 ° C ± 2, proteggere dalla luce. </li><li> Aggiungere 100 pl di tampone FACS, centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante. </li><li> Per i campioni che richiedono soltanto la superficie di colorazione delle cellule, continuare con il passo 3.16. </li><li> In caso di intracellulare colorazione Foxp3: <ol><li> Preparare fissazione e tampone permeabilizzazione miscelando una parte di concentrato con 3 parti di diluenti. </li><li> Preparare buffer di permeabilizzazione 1x: 1 parte di 10x permeabilizzazione tampone + 9 parti di H 2 O. sterilizzato </li></ol></li><li> pellet Risospendere in 100 ml di fissazione e permeabilitampone zione, mescolare bene e incubare a 4 ° C per 30 min. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di buffer permeabilizzazione a ciascun pozzetto, centrifugare a 450 xg a temperatura ambiente per 2 minuti, e aspirare il surnatante. </li><li> Lavare le cellule con tampone permeabilizzazione ancora una volta. </li><li> Selezionare anticorpi monoclonali intracellulari necessario, ad esempio, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) e IFNγ-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Preparare l&#39;impasto mAbs utilizzando tampone permeabilizzazione contenente 2% di siero normale di ratto in base ad ogni fattore di diluizione mAb testato. Definire le impostazioni del cancello utilizzando il controllo isotipo di anticorpo insieme con il campione non macchia. </li><li> Aggiungere 20 ml di preparato MAB-composto in ogni pozzetto. Incubare a 4 ° C per 30 minuti, al riparo dalla luce. </li><li> Dopo 30 minuti di incubazione, aggiungere 100 ml di tampone permeabilizzazione in tutti i pozzetti. Centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante. </li><li> Lavare le cellule con permeabilizzazione BuffeR ancora una volta. Risospendere il pellet in 110 ml di buffer di FACS, e sospensioni cellulari trasferimento in tubo microFACS. NOTA: Il campione è pronto per la misurazione della citometria a flusso a 10 colori. </li><li> In caso di numero di cellule esatta richiesta, aggiungere 10 ml di sospensione uniforme ben miscelato di fluorosfere in ciascun campione immediatamente prima di eseguire misurazioni di citometria a flusso. </li></ol>

<ol><li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vast+majority+of+CLA%2B+T+cells+are+resident+in+normal+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin.</a> J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).</li>
<li>Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+dermis+contains+distinct+populations+of+CD11c%2BBDCA-1%2B+dendritic+cells+and+CD163%2BFXIIIA%2B+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages.</a> J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+in+nonlymphoid+tissue+that+provide+enhanced+local+immunity+during+infection+with+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus.</a> Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).</li>
<li>Boyman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+psoriasis+in+a+new+animal+model+shows+an+essential+role+for+resident+T+cells+and+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Exp Med. 199, 731-736 (2004).</li>
<li>Christophers, E., Mrowietz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+infiltrate+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The inflammatory infiltrate in psoriasis.</a> Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infection+generates+non-migratory+memory+CD8%2B+T%28RM%29+cells+providing+global+skin+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity.</a> Nature. 483, 227-231 (2012).</li>
<li>Havran, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+diversity+of+T-cell+receptor+gamma-chain+expression+of+murine+Thy-1%2B+dendritic+epidermal+cells+revealed+by+V+gamma+3-specific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).</li>
<li>Campbell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+expression+and+memory+T+cell+diversity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CCR7 expression and memory T cell diversity in humans.</a> J Immunol. 166, 877-884 (2001).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+PKC+in+human+T+cells+using+sotrastaurin+%28AEB071%29+preserves+regulatory+T+cells+and+prevents+IL-17+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production.</a> J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).</li>
<li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+isolation+of+skin+resident+T+cells+from+normal+and+diseased+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin.</a> J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).</li>
<li>Clark, R. A., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+and+dermal+fibroblasts+induce+proliferation+of+natural+regulatory+T+cells+isolated+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin.</a> Blood. 109, 194-202 (2007).</li>
<li>Keijsers, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+induction+of+cutaneous+inflammation+results+in+the+accumulation+of+extracellular+trap-forming+neutrophils+expressing+RORgammat+and+IL-17%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17.</a> J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).</li>
<li>Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).</li>
<li>Hennino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-infiltrating+CD8%2B+T+cells+initiate+atopic+dermatitis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions.</a> J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare in modo efficace le cellule T della pelle residenti da biopsie cutanee umane. Il vantaggio di questo protocollo è l&#39;isolamento del numero relativamente elevato di linfociti vitali, ed esprimendo marcatori di superficie rilevanti. I sottoinsiemi di cellule identificate sono state: le cellule, CD11c + DCs CD4 + e cellule T CD8 + e Foxp3 + CD25 +. È importante sottolineare che, ex vivo coltura di cellule T dell...

La pelle, come l&#39;interfaccia principale tra il corpo e l&#39;ambiente, fornisce la prima linea di difesa contro fisica esterna, chimiche e insulti biologici quali ferite, radiazioni ultraviolette e microrganismi. Pelle è composto da due vani principali, l&#39;epidermide e il derma, e contiene una varietà di cellule del sistema immunitario, tra cui le cellule di Langerhans, macrofagi, cellule dendritiche (DC), e circa 20 miliardi di cellule T di memoria, quasi il doppio del numero di presenti in tutto il volume di sangue 1 , 2. Un numero sempre crescente di dati supporta l&#39;idea che la pelle ha funzioni immunologiche essenziali, sia durante l&#39;omeostasi dei tessuti e in diverse condizioni patologiche. Le cellule immunitarie residenti nella cute normale si pensa di condurre immunosorveglianza 3 e hanno dimostrato di giocare un ruolo nello sviluppo di malattie infiammatorie come la psoriasi 4. Nella cute lesionata psoriasica, sia CD4 + e CD8 + infiltrati cellule T erano osserved ed è stato dimostrato che il rapporto tra il CD4 e CD8 varia a seconda dello stato di malattia 5. Tuttavia, queste popolazioni di cellule sono difficili da studiare perché le tecniche esistenti consentono l&#39;isolamento di solo poche cellule. Le tecniche attualmente largamente utilizzati per l&#39;isolamento delle cellule T da pelle umana combinano dissociazione pelle meccanica con trattamento enzimatico. Biopsie cutanee umane sono ampiamente tritata e incubate con enzimi come tripsina, collagenasi e / o EDTA 6-8. Considerando che la pelle è un tessuto barriera che è altamente resistente alle forze di trazione e disgregazione meccanica, i metodi stabiliti di isolamento delle cellule T prodotte pochissime cellule, e anche i numeri inferiori di cellule vitali, che rende ex vivo di coltura cellulare di queste popolazioni cellulari difficile e stimolante. Qui, riportiamo un metodo modificato per isolare i linfociti provenienti sia sano e coinvolto pelle umana psoriasica combinando Mechanla dissociazione iCal della pelle utilizzando un dissociatore tessuto automatizzato invece del metodo stabilito di ampiamente tritare, insieme a digestione enzimatica con collagenasi. sono stati osservati vari sottoinsiemi di cellule immunitarie vitali tra DC e cellule T dopo la preparazione di una cella singola sospensione. È importante sottolineare che l&#39;espressione dei marcatori di superficie CD3, CD4 e CD8 è stato ben conservato. Le cellule così preparate, sono pronte per l&#39;uso in colture cellulari ex vivo o analisi di citometria di flusso. Questo protocollo è stato impiegato con successo per l&#39;analisi di biopsie cutanee singoli (4 mm) derivati ​​dalla cute lesionale di pazienti affetti da psoriasi. I risultati hanno mostrato che le cellule T dei pazienti della pelle residente prodotte citochine infiammatorie come più IL-17 e IFNγ rispetto ai volontari sani 9.

<table><tbody><tr><td>Punzone monouso per biopsia</td><td>Kai Europe</td><td>BP-40F</td><td>4 mm</td></tr><tr><td>Bisturi sterili monouso</td><td>Dalhausen</td><td>1100000510</td><td></td></tr><tr><td>delicataMACS C tubo</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td>Tappo blu, utilizzato come tubo di dissociazione.</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociatore</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Dissociatore tissutale automatizzato. Utilizzo del "programma spleen_01" per la dissociazione della biopsia cutanea.</td></tr><tr><td>Filtro cellulare&nbsp;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 & m piastra</td></tr><tr><td>con fondo a U a 96 pozzetti</td><td>in nylon Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Umano Siero aggregato (HPS)</td> <td>preparato</td><td></td><td></td>in casa</tr><tr><td>Collagenasi I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>Tipo 1-A, adatto per colture cellulari</td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Colorante di vitalità fissabile (FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td>Colorare le cellule morte prima della fissazione cellulare; diluire con PBS a 1:1.000</td></tr><tr><td>Concentrato di fissazione/permeabilizzazione</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Diluente di fissazione/permeabilizzazione</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di permeabilizzazione (10x)</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Clone di CD45 BD 563879 anti-umano di topo</td><td></td><td></td><td>: HI30; fattore di diluizione 1:50</td></tr><tr><td>FITC Topo anti-umano CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>Clone: TUK4; fattore di diluizione 1:50</td></tr><tr><td>PE Topo anti-umano CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>Clone: MOC-1; fattore di diluizione 1:50</td></tr><tr><td>ECD Topo anti-umano CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>Clone: UCHT1; fattore di diluizione 1:50 per colorazione superficiale; fattore di diluizione 1:25 per colorazione intracellulare.</td></tr><tr><td>PC5.5 Topo anti-umano CD4</td><td>Beckman - Coulter</td><td>B16491</td><td>Clone: 13B8.2; fattore di diluizione 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 Topo anti-umano CD11c</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A80249</td><td>Clone: BU15; fattore di diluizione 1:50</td></tr><tr><td>APC Topo anti-umano CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>Clone: AD5-8E7; fattore di diluizione 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 Topo anti-umano CD8</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A66332</td><td>Clone: B9.11; fattore di diluizione 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 Topo anti-umano CD19</td><td>Beckman - Coltro</td><td>A94681</td><td>Clone: J3-119; fattore di diluizione 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Topo anti-umano CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>Clone: BC96; fattore di diluizione 1:50</td></tr><tr><td>&nbsp; PE Ratto anti-umano CLA</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>clone: HECA-452; fattore di diluizione 1:</td></tr><tr><td>eFluo450 Rat anti-umano Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>Clone: PCH101; colorazione intracellulare; fattore di diluizione 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>Clone: eBio64DEC17; colorazione intracellulare; fattore di diluizione 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>Clone: 4S. B3; colorazione intracellulare; fattore di diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Fluorosfere a flusso</td><td>Beckman - Coulter</td><td>7547053</td><td>Sfere di conteggio, per citometria a flusso</td></tr></tbody></table>

linfociti isolamento da pelle umana per l&#39;analisi fenotipica e<em&gt; ex vivo</em&gt; cell culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

La pelle umana ha una importante funzione di barriera e contiene varie cellule del sistema immunitario che contribuiscono a omeostasi tissutale e la protezione da agenti patogeni. Come la pelle è relativamente facile da accesso, fornisce una piattaforma ideale per lo studio periferici meccanismi di regolazione del sistema immunitario. cellule residenti immunitario in buona salute immunosorveglianza condotta della pelle, ma anche svolgere un ruolo importante nello sviluppo di malattie infiammatorie della pelle, come la psoriasi. Nonostante intuizioni emergenti, la nostra comprensione della biologia di base varie malattie infiammatorie della pelle è ancora limitata. Vi è una necessità di una buona qualità popolazioni (singolo) di cellule isolate da campioni di pelle biopsiati. Finora, procedure di isolamento sono stati gravemente ostacolati dalla mancanza di ottenere un numero sufficiente di cellule vitali. Isolamento e successiva analisi sono stati colpiti dalla perdita di marcatori lignaggio cellule immunitarie, a causa dello stress meccanico e chimico causato dalle procedure di dissociazione correnti averesospensione singola cella. Qui, descriviamo un metodo modificato per isolare le cellule T sia da salutare e coinvolto pelle umana psoriasica combinando dissociazione pelle meccanico utilizzando un dissociatore tessuto automatizzato e il trattamento collagenasi. Questa metodologia conserva espressione della maggior parte dei marcatori lignaggio immunitario come CD4, CD8, Foxp3 e CD11c sulla preparazione di sospensioni di cellule singole. Sono mostrati esempi di isolamento successo + T CD4 cellule e successiva analisi fenotipica e funzionale.

Il protocollo presentato qui produrrà tra 2.200 ± 615 (media ± SEM, pelle di volontari sani) fino a 178.000 ± 760 (media ± SEM, cute lesionata dei pazienti affetti da psoriasi) linfociti vitali da pelle umana quando si utilizza un singolo 4 millimetri biopsia cutanea. Diversi tipi di CD45 + cellule sono state identificate in cella singola sospensioni derivate dalla pelle di individui sani, tra cui CD4 + T-cellule (~ 45%), CD8 + T-cellule (~ 30%), e CD11c <sup...

Descriviamo un protocollo per isolare in modo efficiente le cellule T residenti nella pelle da biopsie cutanee umane. Questo protocollo produce un numero sufficiente di linfociti residenti nella pelle umana vitali per l'analisi citofluorimetrica e la coltura ex vivo.

Linfociti Isolamento da Pelle umana per l&#39;analisi fenotipica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare in modo efficiente le cellule T residenti nella pelle da biopsie cutanee umane. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando biopsie cutanee umane mediante un punch per biopsie circolare. Successivamente, ogni biopsia cutanea viene tagliata in quattro pezzi più piccoli in una piastra di Petri.Successivamente, il tessuto cutaneo viene dissociato meccanicamente ed enzimaticamente per ottenere una sospensione monocellulare. Infine, i linfociti residenti nella pelle vengono analizzati mediante citometria a flusso e coltivati ex vivo. In definitiva, è possibile isolare e analizzare un numero sufficiente di linfociti umani vitali residenti nella pelle mediante immunomarcatura e analisi FACS.Questo metodo contribuirà a rispondere a domande fondamentali in dermatologia e immunologia dei tumori della pelle. Ad esempio, come i linfociti T residenti nella pelle contribuiscono alla malattia. La procedura sarà dimostrata da Xuehui He, uno studente di dottorato del nostro laboratorio.Dopo aver preparato il mezzo di coltura, secondo il protocollo indicato, aggiungere due millilitri di mezzo completo a tre pozzetti di una piastra da coltura sterile a sei pozzetti. Successivamente, utilizzare un punch per biopsia circolare da quattro millimetri per ottenere un campione di biopsia cutanea. Posizionarlo in mezzo di coltura completo RPMI 1640 e lasciarlo in incubazione sul banco per un massimo di quattro ore, oppure a quattro gradi Celsius durante la notte.Mentre il campione di biopsia è in incubazione, etichettare un tubo di dissociazione con tappo blu e aggiungere cinque millilitri di mezzo di coltura completo. Successivamente, utilizzare strumenti sterili per posizionare il campione di biopsia nel primo pozzetto per il risciacquo. Trasferire il tessuto nel secondo pozzetto, risciacquare, quindi ripetere il processo un’altra volta nel terzo pozzetto.Trasferire la biopsia cutanea ben risciacquata in una piastra di Petri sterile e aggiungere con la pipetta 100 microlitri di mezzo di coltura completo sulla superficie del campione. Successivamente, utilizzare un bisturi sterile monouso in acciaio inossidabile per rimuovere con attenzione il tessuto adiposo sottocutaneo. In una nuova piastra di Petri sterile, tagliare ogni biopsia cutanea in quattro frammenti più piccoli.Quindi trasferire i campioni nel tubo di dissociazione preparato contenente cinque millilitri di mezzo completo. Chiudere ermeticamente il tubo e fissarlo capovolto sulla manica del dissociatore tessutale automatico. Assicurarsi che tutto il materiale campione si trovi nella zona del rotore.Successivamente, avviare il processo di dissociazione eseguendo il programma M spleen zero one. Dissociare il campione di biopsia alla velocità di rotazione appropriata per 56 secondi. Al termine dell'elaborazione, staccare il tubo di dissociazione dal dissociazione e assicurarsi che tutto il materiale dissociato sia raccolto sul fondo del tubo.Aggiungere 150 microlitri di collaghenasi I A nel tubo di dissociazione e incubare il campione in un bagno termoagitato a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di DNasi nel tubo di dissociazione e mescolare accuratamente. Fissare il tubo di dissociazione alla manica del dissociatore tessutale automatico ed eseguire il programma M milza zero uno per dissociare ulteriormente il campione di biopsia.Quindi, posizionare un filtro cellulare in nylon da 70 micromolari sulla parte superiore di una provetta falcon da 50 millilitri ed applicare i materiali campione dissociati sul filtro cellulare per rimuovere gli aggregati cellulari e i detriti tissutali. Utilizzare cinque millilitri di mezzo completo per lavare una volta il filtro cellulare. Successivamente, centrifugare il filtrato a 450 G e 20 gradi Celsius, più o meno due gradi, per 10 minuti prima di aspirare il sopranatante.Dopo aver ripetuto ulteriormente il passaggio di lavaggio, utilizzare 300 microlitri di mezzo di coltura completo per risospendere i pellet cellulari. Le sospensioni di singole cellule sono ora pronte per ulteriori analisi. Per eseguire la colorazione intracellulare delle citochine, utilizzare PMA, ionomicina e brefeldina A per stimolare le cellule e incubare a 37 gradi Celsius e al 5 percento di anidride carbonica per quattro ore prima di eseguire l'analisi mediante citometria a flusso.Per eseguire l'attivazione policlonale delle cellule T residenti nella pelle, aliquotare 100 microlitri di sospensione cellulare singola in una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo. Aggiungere microsferette rivestite con anticorpi monoclonali anti-CD3 e anti-CD28, citochina umana ricombinante IL-2 e IL-1B. Coprire la piastra con un coperchio etichettato e pesato, quindi incubare a 37 gradi Celsius, con il 5 percento di anidride carbonica e umidità al 100 percento.Successivamente, quando il colore del mezzo diventa giallo, sostituirlo. Un chiaro colonia cellulare può essere osservata all'ottavo giorno in coltura cellulare. Per eseguire l'analisi FACS, trasferire le cellule di interesse in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V.Centrifugare a 450 G e 20 gradi Celsius, più o meno due gradi, per due minuti. Quindi, aspirare il soprannatante. Utilizzare 100 microlitri di colorante vitalizio fissabile coniugato fluorescente 780 preparato per colorare le cellule, incubando a quattro gradi Celsius per 30 minuti.Quindi, aggiungere 100 microlitri di buffer FACS e centrifugare prima di aspirare il sopranatante. Successivamente, dopo aver selezionato gli anticorpi monoclonali per i marcatori della superficie cellulare dall'elenco fornito nel protocollo testuale, utilizzare il buffer FACS per preparare le soluzioni anticorpali. Utilizzare il controllo isotopico degli anticorpi insieme a un campione non colorato per definire le impostazioni dei gate.Ora, aggiungere 25 microlitri della miscela di anticorpi murini preparata in ciascun pozzetto, proteggendo dalla luce. Incubare a 20 gradi Celsius per 20 minuti. Aggiungere 100 microlitri di buffer FACS, centrifugare ed aspirare il soprannatante.Utilizzando i tamponi preparati per la colorazione di foxp3 secondo il protocollo descritto, aggiungere 100 microlitri di tampone fissativo e permeabilizzante per risospendere i pellet. Mescolare accuratamente e incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di tampone permeabilizzante in ogni pozzetto e centrifugare prima di aspirare il sovranatante.Dopo aver lavato le cellule un'ulteriore volta e aver scelto gli anticorpi corretti, aggiungere 20 microlitri della miscela di anticorpi monoclonali preparata in ogni pozzetto e proteggere dalla luce prima di incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzando il buffer di permeabilizzazione, lavare le cellule un'ulteriore volta. Successivamente, usare 110 microlitri di buffer FACS per risospendere i pellet e trasferire le sospensioni cellulari in provette FACS da microcentrifuga.Infine, se è richiesto il numero esatto di cellule, aggiungere 10 microlitri di una sospensione uniforme ben mescolata di fluorosfere a ogni campione immediatamente prima di effettuare le misurazioni mediante FACS. Come mostrato qui, diversi tipi di leucociti positivi per CD45 sono stati identificati in sospensioni cellulari singole ottenute dalla pelle di individui sani, inclusi linfociti T positivi per CD4, linfociti T positivi per CD8 e cellule dendritiche positive per CD11c.Mentre sono state osservate poche cellule B, cellule NK o microfagi. Inoltre, la metodologia consente l'analisi di cellule CD4 positive CD25 positive foxp3 positive in biopsie cutanee umane. Ad esempio, utilizzando una colorazione intracellulare dopo fissazione e permeabilizzazione, è possibile dimostrare l'espressione del fattore di trascrizione foxp3 nelle cellule T positive per CD25.Come dimostrato qui, per evitare la fluorescenza autofluorescente di fondo e per escludere la popolazione cellulare autofluorescente, si raccomanda l'uso dell'anticorpo murino anti-umano CD45 coniugato a un fluorocromo brilliant violet 421 per la selezione della popolazione linfocitaria. Questa figura illustra che la maggior parte delle cellule residenti nella pelle umana erano linfociti T positivi per CD3. Per l'analisi della vitalità cellulare, si raccomanda l'uso di un colorante vitalizio fissabile per distinguere le cellule vitali da quelle morte o morenti.Per ulteriori analisi funzionali, utilizzando una singola biopsia cutanea di quattro millimetri di tessuto lesionale da pazienti affetti da psoriasi, si è dimostrato che le cellule T derivate dalla biopsia producono IL-17a e interferone gamma. Dopo una stimolazione di quattro ore con PMA e ionomicina in presenza di brefeldina A. Infine, questa figura mostra che le cellule T di individui affetti da psoriasi hanno una capacità molto maggiore di produrre le citochine associate alla psoriasi, IL-17a e interferone gamma. Non dimenticare che lavorare con tessuti umani e agenti di laboratorio può essere pericoloso.Tenere sempre in considerazione le misure di sicurezza.

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