Name: LEPR Db Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Scopri l'isolamento degli isleti pancreatici dal modello murino Lepr db per il diabete di tipo 2 e l'imaging live-cell con microscopia a due fotoni. Questo metodo permette di studiare la secrezione insulinica in tempo reale.

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Questo lavoro è stato supportato da un Australian Research Council Grant DP110100642 (a PT) e da un National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 e APP1059426 (a PT e HYG).

NOTA: Tutte le presenti esperimenti sono stati eseguiti secondo le locali procedure di etica animale dell&#39;Università di Queensland (approvati dalla University of Queensland, anatomico Biosciences Comitato Etico). 1. Islet Isolamento <ol><li> Preparazione dei reagenti <ol><li> Miscela di enzimi <ol><li> Per la digestione pancreatica, utilizzare una miscela di liberase e collagenasi tipo IV. Diluire liberase TL (termolisina basso) 1 flacone di 5 mg con 26 ml di DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium). </li><li> Preparare collagenasi di tipo IV in tampone di Hank ad una concentrazione di 0,5 mg / ml, supplementato con 5 mM HEPES, 0.5mm CaCl 2, 0,1 mg / ml e DNAsi 1mg / ml sieroalbumina bovina. </li><li> Mescolare il TL liberase e soluzioni collagenasi in un rapporto di 4: 1 (in volume), cioè, 4 ml liberase TL + 1 ml di collagenasi. Aliquota della miscela di enzimi per 2,5 ml ciascuna e conservare a -20 ° C. NOTA: Le ore di incubazione tessuto vary un po &#39;tra i lotti di enzima (30 sec a differenza di 1 min). Pertanto, un test di gruppo può essere richiesto. </li></ol></li><li> RPMI Isolamento media <ol><li> Sciogliere una fiala di RPMI 1640 polvere in 1 l di acqua a temperatura ambiente e integrare con 2 g NaHCO 3, 4.02 g HEPES. </li><li> Combina i media isolamento RPMI in una grande beuta, mescolare con agitatore magnetico, regolare a pH 7,4 con NaOH, filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> RPMI Media Cultura </li><li> Utilizzare coltura RPMI con 10% di siero fetale bovino e 1% di antibiotici (ad esempio, penicillina 100 U / ml, streptomicina 100 mg / ml). </li></ol></li><li> Isolamento Islet e Coltura <ol><li> Sacrificio animale <ol><li> Sacrificio topi di dislocazione cervicale o di CO 2 asfissia secondo le procedure di etica dell&#39;istituzione locale. Spruzzare accuratamente il corpo del mouse con il 70% di etanolo. </li></ol></li><li> Perfusione pancreas <ol><li> USE 2 tagli lunghi lateralmente attraverso la pelle addominale e del peritoneo per fare un lembo a forma di V. Tirare il lembo della pelle fino a scoprire l&#39;intera cavità addominale, messo da parte dell&#39;intestino e mantenere il fegato in posizione da una carta velina ripiegata per rivelare il dotto biliare comune (figure 1 e 2). Mettere l&#39;animale in modo che la testa verso il chirurgo e la coda dal chirurgo. </li><li> Applicare un morsetto vascolare nella ampolla sulla parete del duodeno per bloccare gli enzimi iniettati di entrare duodeno (Figura 1). NOTA: Questo è un passo importante in quanto determina se gli enzimi iniettati andranno nel dotto pancreatico e profumato il pancreas o reflusso al sito di iniezione (oltre morsetto) o andare nel duodeno (sotto pinza). </li><li> Incannulare dotto biliare comune con un ago G 31 nei pressi dello svincolo del dotto epatico comune e dotto cistico (Figura 1) e lasciare spazio per una seconda iniezione se the pancreas non riesce a perfusione la prima volta. Lentamente (sopra ~ 10 sec) iniettare circa 2 ml di miscela di enzimi freddo nel mouse dotto biliare comune. NOTA: Il pancreas saranno perfusi rapidamente se la pinza è nella posizione corretta. </li><li> Regolare la posizione di blocco se l&#39;ago si trova all&#39;interno del dotto biliare comune, ma non può profumato pancreas (es., Spostare la pinza un po &#39;lontano dal fegato se oltre bloccato o spostarlo verso il basso un po&#39; per il fegato se sotto bloccato). NOTA: L&#39;ago volte va nella capsula circostante piuttosto che il lume del dotto. Un segno utile per verificare se l&#39;ago è all&#39;interno del dotto biliare comune è la dilatazione del condotto d&#39;iniezione. Se il pancreas non riesce a perfusione, un&#39;alternativa è la miscela enzima potrebbe essere iniettato a più siti del pancreas con minore rendimento previsto. La perfusione del sito sinistra del pancreas (lobo splenica) è importante per la massimizzazione della resa isolotto. </li><li> Dopo il pancreas è perfused, rimuovere rapidamente il pancreas, metterla in una fiala (~ 20 ml, vetro) e incubare per ~ 19 min in un bagno di 37 ° C Acque. NOTA: Il tempo di incubazione può variare un po &#39;a seconda del ceppo di topo ed età. </li><li> Dopo il tempo di incubazione, arrestare il processo di digestione aggiungendo ~ 20 ml di terreni di isolamento freddo. Agitare delicatamente il flacone di interrompere il pancreas e versare attraverso un normale colino del tè (diametro dei pori di 1 mm) in una sterile tubo da 50 ml. Rabboccare il tubo con terreni di isolamento e centrifugare a 400 xg per 1 min a 4 ° C con freno off. </li><li> Sciogliere di nuovo il pellet in terreni di isolamento e trasferire due provette da 15 ml, quindi si centrifuga a 400 xg per 1 min a 4 ° C con freno off. Dopo l&#39;aspirazione del surnatante, miscelare i due palline bene con 6 ml di mezzi di separazione cellulare gradiente di densità (Histopaque soluzione 1077) per provetta nel vortex o pipettando su e giù. Poi aggiungere delicatamente ~ 6 ml dei terreni di isolamento al lato del tubo in cimai mezzi di separazione gradiente di densità e centrifugare a 100 xg per 15 min a 4 ° C con freno off. </li><li> Raccogliere il surnatante nella parte superiore (terreni di isolamento), media e bassa (densità cellulare gradiente di mezzi di separazione) strato in 3 piatti separati. Handpick isolotti in questi 3 piatti, usando una pipetta sotto un microscopio da dissezione. NOTA: Lo strato intermedio contiene la maggior parte degli isolotti. Isolotti sono riconosciuti come strutture compatte di ~ 50 a 500 micron di dimensione (Figura 3). Otteniamo ~ 200 isolotti in topi WT e 300- &lt;100 isolotti nei topi db / db. </li></ol></li><li> Islet Culturing <ol><li> Per aiutare gli isolotti riprendersi dalla digestione enzimatica, gruppi culturali di 40 isolotti in un 25 centimetri capsula di Petri con 6 ml RPMI terreni di coltura (10mM glucosio) a 37 ° C, 5% / 95% di CO 2 / O 2 per 2 giorni prima dal vivo -cell 2-photon imaging. Modificare il terreno di coltura quotidiano. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Live Cell 2-Photon Imaging <ol><li> Preparazione dei reagenti <ol><li> Extracellulare Buffer <ol><li> Preparare il sodio ricco tampone extracellulare per il test 2-fotone con 140 mM NaCl, KCl 5 mM, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 5 NaHCO 3 e 10 mM HEPES mM. </li></ol></li><li> Extracellulare Dye <ol><li> Per il saggio 2 fotoni, preparare magazzino SRB 8 mm in tampone extracellulare, aliquota in piccoli tubi e conservare a -20 ° C. Diluire lo stock SRB 1:10 in tampone fresco extracellulare per ottenere una concentrazione di lavoro di 0,8 mm. </li></ol></li></ol></li><li> fotone Imaging <ol><li> Innanzitutto, pre-incubare 2 giorni isolotti coltivate in 3 mM glucosio tampone extracellulare per 30 min. NOTA BENE: Usiamo isolotti tra 2 e 5 giorni in coltura. </li><li> Quindi, inserire un vetrino sulla camera termo-controllo montato sul palco microscopio. Utilizzare del grasso per impedire la fuoriuscita di soluzione. </li><li> Coprire la camera con 500 ml di ExtracellBuffer colare contenente 0,8 SRB mm con differenti concentrazioni di glucosio (3 mm, 6 mm, 15 mm e 20 mm) di glucosio. </li><li> Quindi, posizionare l&#39;isolotto di pre-incubazione nel mezzo della camera e si concentrano a 3-4 strati di cellule nel isolotto dove, nelle isole di roditori, immunocolorazione per l&#39;insulina mostra che la maggior parte delle cellule sono cellule beta. NOTA: Il SRB illustrerà tutte le membrane delle cellule dell&#39;isolotto rapidamente e l&#39;isolotto è pronto per l&#39;immagine. </li><li> Utilizzare un microscopio 2 fotoni con un obiettivo 60X immersione in olio (NA 1.42) e software di imaging (ad es., Scanimage 11). La Figura 4 illustra una tipica disposizione microscopia. Immagine eventi esocitosi utilizzando SRB come una membrana impermeant marcatore extracellulare fluorescente eccitato da impulsi laser a femtosecondi a 880 nm, con la fluorescenza rilevati a 550-650 nm. Registrare le risposte isolotto alla stimolazione. </li><li> Identificare gli eventi esocitosi singoli dall&#39;improvvisa apparizione di una piccola macchia fluorescente (risoluzione 10 pixel /1; m) e confermare con la fase veloce di salita del segnale fluorescente sopra una regione di interesse (~ 0,78 micron 2). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li>
<li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell%3A+The+last+ten+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li>
<li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hyperglycemia%2C+independent+of+plasma+lipid+levels%2C+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db%2Fdb+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li>
<li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li>
<li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+a+new+mutation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+deficit+in+islets+from+db%2Fdb+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il fattore più critico nell&#39;isolamento isolotto è la perfusione iniziale del pancreas; un sotto perfuso pancreas risultati in una resa isolotto notevolmente inferiore. Altri fattori influenzano anche la qualità di isolamento, come il tempo di digestione e il livello di agitazione che potrebbe in parte compensare il livello di perfusione. Ad esempio, un pancreas pienamente perfuso dovrà essere incubate a 37 ° C per ~ 18 min 30 sec agitatore, al contrario un sotto digerito pancreas possono richiedere ~ 20 min digestio...

Il ruolo della disfunzione delle cellule beta nella malattia è stato ampiamente riconosciuto 3,4. Le linee cellulari, come il MIN6 e INS-1 sono strumenti utili per comprendere la biologia del comportamento delle cellule beta. Tuttavia, il controllo fisiologico della secrezione di insulina avviene all&#39;interno delle isole di Langerhans. Questi isolotti contengono migliaia di cellule beta fitte, così come i vasi sanguigni e di altri tipi di cellule endocrine. Questo ambiente all&#39;interno dell&#39;isolotto influenza la secrezione di insulina, ed è probabile che sia importante nel diabete. Pertanto, per comprendere il controllo fisiologico della secrezione di insulina, e la fisiopatologia della malattia, è essenziale studiare isolotti intatti. Isolamento Islet Isole umane vive e, in particolare, isolotti umani provenienti da pazienti affetti da diabete di tipo 2 sono difficili da ottenere. Inoltre, isole umane hanno limitate possibilità di manipolazione molecolare sperimentale. I ricercatori hanno quindi impiegato èlascia da animali e modelli animali di diabete di tipo 2. Un tale modello di malattia è il mouse db / db. Si tratta di una mutazione spontanea che i modelli di diabete di tipo 2 con una progressione fenotipo che ricorda molto da vicino la malattia umana 5,6. Il protocollo presentato qui per l&#39;isolamento delle isole da diabetici db / db topo ha molti punti in comune con gli altri gruppi con alcuni filtri per migliorare la resa, la purificazione e la sopravvivenza delle isole migliorata. Imaging 2 fotone Il live-cella 2 fotoni test qui descritta permette ai ricercatori di quantificare il numero e valutare le caratteristiche dei singoli granuli insulina contenente da molte cellule del diabetico 7 e wild type isolotti 8,9.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td>Roche-5401020001</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Collagenasi tipo IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>per preparare terreni di isolamento</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>per preparare terreni coltivati</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>per preparare terreni coltivati&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>per preparare terreni coltivati</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>per diluire il</td></tr><tr><td>programma Metamorph</td> liberato <td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>per analizzare le immagini a 2 fotoni</td></tr></tbody></table>

lepr<sup&gt; db</sup&gt; mouse modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento islet e live-cella 2-photon imaging di isolotti intact

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Il diabete di tipo 2 è una malattia cronica che colpisce 382 milioni di persone nel 2013, e si prevede un aumento di 592 milioni entro il 2035 1. Nel corso degli ultimi 2 decenni, il ruolo di una disfunzione delle cellule beta nel diabete di tipo 2 è stato chiaramente stabilito 2. Progresso della ricerca ha richiesto metodi per l&#39;isolamento di isole pancreatiche. Il protocollo di isolamento delle isole qui presentata condivide molte fasi comuni con protocolli di altri gruppi, con alcune modifiche per migliorare la resa e la qualità delle isole isolate sia dal tipo selvatico e diabetico db LEPR (db / db) topi. Un live-cell imaging metodo 2-fotone è quindi presentata che può essere utilizzato per studiare il controllo della secrezione insulinica entro isolotti.

Resa Islet e purificazione Per un normale topo wild-type, sono attesi circa 200 isolotti. Isolotti sani guardare luminoso, di forma circolare e un bordo liscio. Un lotto di isolamento su digerito di solito ha piccole e sfocate isolotti mentre un partita sotto-digerito ha meno isolette e isolotti di cellule attaccato acinar (Figura 3). Per diabetici db / db topo, la resa isolotto e l&#39;aspetto dipende dalla progressione della malattia con migliori topi glicemico sono più gr...

Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Leprdb e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere occhi viventi vitali dai topi diabetici LEP R DB e valutare la secrezione di insulina da parte delle cellule beta all'interno degli occhi mediante imaging da cellula vivente a fotoni. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando reagenti come la miscela enzimatica per la digestione del pancreas, il mezzo di coltura per la coltivazione degli occhi e il tampone extracellulare per il saggio a due fotoni. Successivamente, si apre l'addome di un topo eutanasizzato e si inietta la miscela enzimatica nel pancreas per digerire l'organo.Successivamente, gli isolotti vengono separati dal digest pancreatico e coltivati. Infine, la microscopia a due fotoni viene utilizzata per ottenere immagini delle fusioni di singoli granuli di insulina provenienti dalle cellule beta all'interno dell'isolotto. In definitiva, questo protocollo aiuterà i ricercatori a comprendere come la secrezione di insulina sia regolata in condizioni fisiologiche e patologiche.Il principale perfezionamento della tecnica di isolamento degli isolotti consiste nell'utilizzo di enzimi misti per migliorare il rendimento e la vitalità degli isolotti. La tecnica di imaging a due fotoni è attualmente l'unico metodo in grado di registrare la secrezione di insulina da più cellule all'interno di un isolotto integro. Per preparare gli enzimi necessari all'isolamento degli isolotti pancreatici, diluire un'ampolla contenente cinque milligrammi di liasi TL con 26 millilitri di DMEM, preparare la collagenasi di tipo quattro nel buffer di Hank a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro, quindi integrare con le seguenti soluzioni di liasi TL e collagenasi miste.In un rapporto di quattro a uno in volume, suddividere la miscela di enzimi in aliquote da 2,5 millilitri ciascuna e conservare a -20 gradi Celsius. Per preparare il mezzo di isolamento RPMI in un grande matraccio conico contenente un litro di acqua, sciogliere una fiala di polvere RPMI 1640 a temperatura ambiente e aggiungere 2 grammi di bicarbonato di sodio e 4,02 grammi di HEPES. Utilizzare l'idrossido di sodio per regolare il pH a 7,4, quindi filtrare, sterilizzare e conservare a 4 gradi Celsius.Preparare il mezzo di coltura RPMI aggiungendo il 10% di FBS e l'1% di antibiotici al mezzo di isolamento RPMI per l'immagine a due fotoni. Preparare il tampone extracellulare ricco di sodio con i seguenti reagenti. Per preparare il colorante extracellulare, preparare una soluzione madre da otto millimoli di SRB e suddividere il tampone extracellulare in aliquote in provette piccole, quindi conservare a meno 20 gradi Celsius.Per ottenere una concentrazione di lavoro, utilizzare il buffer extracellulare fresco per diluire la soluzione madre di SRB da uno a dieci. Dopo aver sacrificato un topo e aver spruzzato accuratamente il corpo del topo con etanolo al 70% secondo il protocollo descritto nel testo, posizionare l'animale con la testa rivolta verso e la coda lontana dal chirurgo. Effettuare due incisioni laterali lunghe attraverso la cute addominale e il peritoneo per creare una linguetta a forma di V.Sollevare la falda della pelle per esporre l'intera cavità addominale. Mettere da parte l'intestino e, utilizzando un lembo di tessuto piegato, mantenere il fegato in posizione per rivelare il dotto biliare comune. Successivamente, applicare una pinza vascolare sull'ambula nella parete del duodeno per impedire agli enzimi iniettati di entrare nel duodeno.Questo è un passaggio importante che determina se gli enzimi pancreatici entrano nel dotto pancreatico per reflusso, nel sito di iniezione o nel duodeno. Utilizzare un ago da 31 gauge per canulare il dotto biliare comune in prossimità della giunzione tra il dotto epatico comune e il dotto cistico, lasciando spazio per una seconda iniezione. Se il pancreas non viene perfuso correttamente al primo tentativo, iniettare lentamente circa due millilitri di miscela enzimatica fredda nel dotto biliare comune del topo.Se la pinza è nella posizione corretta, il pancreas verrà perfuso rapidamente. Una volta perfuso il pancreas, rimuovere velocemente l'organo, collocarlo in un vial di vetro e incubarlo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per circa 19 minuti. Al termine dell'incubazione, arrestare il processo di digestione aggiungendo circa 20 millilitri di mezzo di isolamento freddo.Agitare delicatamente il viallo per rompere il pancreas e versarlo attraverso un setaccio normale T con fori di un millimetro in un tubo sterile da 50 millilitri. Utilizzare il mezzo di isolamento per riempire il tubo e centrifugare a 400 G e 4 gradi Celsius per un minuto. Con l'interruzione, aggiungere il mezzo di isolamento al palato e scioglierlo.Quindi trasferire la sospensione in due provette da 15 millilitri e centrifugare una seconda volta. Dopo aver aspirato il soprannatante, aggiungere sei millilitri di mezzo di separazione cellulare a gradiente di densità in ciascuna provetta e risospendere mediante pipettaggio o vortex. Successivamente, lungo la parete delle provette, aggiungere delicatamente circa sei millilitri di mezzo di isolamento sopra il mezzo di separazione a gradiente di densità e centrifugare a 100 ×g e 4 gradi Celsius per 15 minuti.Con la separazione, raccogliere gli strati superiore, medio e inferiore in tre piatti separati. Quindi, sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare una pipetta per selezionare manualmente gli anelli oculari nei tre piatti. La maggior parte si troverà nello strato medio, il che aiuta gli anelli oculari a riprendersi dalla digestione enzimatica.Preparare gruppi di 40 isolotti in piastre di Petri da 25 centimetri con sei millilitri di mezzo di coltura RPMI contenente glucosio 10 millimolare e coltivare per due giorni. Cambiare il mezzo ogni giorno ed eseguire l'immagine a due fotoni come saggio indiretto per misurare la secrezione di insulina. Iniziare pre-incubando gli isolotti coltivati per due giorni con glucosio 3 millimolare in buffer extracellulare.Per 30 minuti, applicare grasso sulla piastra del microscopio per evitare che la soluzione fuoriesca e montare sulla piastra del microscopio una camera di controllo termico contenente un vetrino. Successivamente, coprire la camera con 500 microlitri di buffer extracellulare contenente 0,8 millimoli, SRB e varie concentrazioni di glucosio. Poi, posizionare l'occhiello pre-incubato al centro della camera e mettere a fuoco a una profondità di tre o quattro strati cellulari all'interno dell'occhiello.Negli occhi dei roditori, la colorazione immunoistochimica per l'insulina mostra che la maggior parte delle cellule sono cellule beta. Quindi, mediante microscopio a due fotoni e un obiettivo ad immersione in olio da 60x, identificare singoli eventi esocitotici acidi attraverso la comparsa improvvisa di una piccola macchia fluorescente. Infine, nel software di analisi dell'immagine, confermare un evento mediante la rapida fase di aumento del segnale fluorescente in una regione di interesse per un topo di tipo selvaggio.Si prevede di ottenere circa 200 occhiolini seguendo il protocollo dimostrato in questo video. Gli occhiolini sani appaiono luminosi, di forma rotonda e con un bordo regolare. Un lotto di isolamento sottoposto a digestione eccessiva presenta solitamente occhiolini piccoli e sfocati, nonché occhiolini con cellule asar attaccate.Mentre un lotto sovradigerito presenta un numero ridotto di pori nel saggio a due fotoni in risposta a stimoli come glucosio o granuli di insulina con potassio elevato fusi con la membrana plasmatica, un SRB entra nei granuli, determinando l'aspetto di un improvviso punto fluorescente, con un diametro di circa 400 nanometri. Nel periodo registrato, tutti gli eventi di esocitosi in risposta allo stimolo vengono identificati, insieme alla posizione degli eventi, al momento del loro insorgenza, alla durata e al tipo di fusione. Eventi come KISS e Run o fusione completa vengono caratterizzati ed è utile per valutare eventuali difetti nella fusione dei granuli in modelli di diabete di tipo due.Questo metodo è stato utilizzato per dimostrare che il difetto negli isolotti di topi diabetici DB DB è la perdita della fusione completa dei granuli e non un cambiamento nella cinetica della fusione individuale dei granuli. Inoltre, il fattore principale che influenza la ridotta secrezione di insulina nella malattia è una diminuzione del numero di cellule responsivi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione della perfusione pancreatica e dell'attuazione degli isolotti dal topo RDB, e si dovrebbe essere in grado di eseguire i due saggi sulla lingua per valutare le risposte secretorie all'interno degli isolotti integri.

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Un nuovo approccio che combina il trapianto intraoculare e la microscopia confocale permette longitudinale, non invasivo imaging in tempo reale con singola cella di risoluzione all'interno di tessuti...

Trapianto nella camera anteriore dell&#39;occhio per longitudinale, non invasiva<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging con Single-cella di risoluzione in tempo reale

Descriviamo un protocollo per la visualizzazione di esocitosi di insulina in isolotti intatti usando pHluorin, una proteina fluorescente verde sensibili al pH. Gli isolotti isolati sono infettati con l'adenovirus codifica pHluorin accoppiato per il vescicola carico neuropeptide Y. Questo consente il rilevamento degli eventi di fusione granello dell'insulina mediante microscopia confocale.

Confocale Imaging di Neuropeptide Y-pHluorin: una tecnica per visualizzare esocitosi di granuli di insulina in isolotti intatti Murine ed umani

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Ex vivo dell'isolotto pancreatico studi sono importanti per la ricerca sul diabete. Le tecniche esistenti per studiare isolotti coltivati nella loro architettura 3-dimensionale nativo sono che richiede tempo, inefficiente e utilizzati raramente. Questo lavoro descrive un metodo nuovo, semplice ed efficiente per la generazione di sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti tutta coltivati.

Isole pancreatiche incorporamento per sezioni di paraffina

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging e la quantificazione della dinamica del calcio in popolazioni cellulari eterogenee, come le cellule delle isolotiche pancreatiche. I reporter fluorescenti vengono consegnati nello strato periferico delle cellule all'interno dell'isolotto, che viene poi immobilizzato e immagine, e viene eseguita l'analisi per cellula della dinamica dell'intensità della fluorescenza.

Imaging calcio Dynamics in sottopopolazioni di cellule di islet pancreatica del topo

L'obiettivo di questo protocollo è quello di monitorare continuamente le dinamiche del processo di innesto dell'isolotto pancreatico umano e delle cellule che contribuiscono tra l'ospite e il donatore. Ciò si ottiene trapiantando isolotti umani nella camera anteriore dell'occhio (ACE) di un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-destinatario del mouse seguito da ripetute immagini a 2 fotoni.

Longitudinale in Vivo Imaging e quantificazione dell'isolotto pancreatico umano Innesto e contribuendo cellule ospitanti nella camera occhio anteriore

Questo studio presenta l'applicazione di fette di tessuto pancreatico vivo allo studio della fisiologia delle isole e delle interazioni isolotto-cellula immunitaria.

Osservare la funzione delle isole e le interazioni isolo-cellule immunitarie nelle fette di tessuto pancreatico vivo

L'imaging ad alta risoluzione in vivo del pancreas è stato facilitato con la finestra di imaging intravitale pancreatico.

Visualizzazione longitudinale stabilizzata a livello cellulare in vivo del pancreas in un modello murino con una finestra di imaging intravitale pancreatico

Forniamo un protocollo minimamente invasivo per il trapianto intramuscolare di isolotti di cellule staminali pancreatiche derivate da cellule staminali umane in topi immunodeficienti per l'impianto in vivo e l'analisi a valle.

Trapianto intramuscolare di cellule endocrine pancreatiche derivate da cellule staminali pluripotenti umane nei topi

Scopri l'isolamento degli isleti pancreatici dal modello murino Lepr db per il diabete di tipo 2 e l'imaging live-cell con microscopia a due fotoni. Questo metodo permette di studiare la secrezione insulinica in tempo reale.

LEPR

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