LEPR

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere occhi viventi vitali dai topi diabetici LEP R DB e valutare la secrezione di insulina da parte delle cellule beta all'interno degli occhi mediante imaging da cellula vivente a fotoni. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando reagenti come la miscela enzimatica per la digestione del pancreas, il mezzo di coltura per la coltivazione degli occhi e il tampone extracellulare per il saggio a due fotoni. Successivamente, si apre l'addome di un topo eutanasizzato e si inietta la miscela enzimatica nel pancreas per digerire l'organo.

Successivamente, gli isolotti vengono separati dal digest pancreatico e coltivati. Infine, la microscopia a due fotoni viene utilizzata per ottenere immagini delle fusioni di singoli granuli di insulina provenienti dalle cellule beta all'interno dell'isolotto. In definitiva, questo protocollo aiuterà i ricercatori a comprendere come la secrezione di insulina sia regolata in condizioni fisiologiche e patologiche.

Il principale perfezionamento della tecnica di isolamento degli isolotti consiste nell'utilizzo di enzimi misti per migliorare il rendimento e la vitalità degli isolotti. La tecnica di imaging a due fotoni è attualmente l'unico metodo in grado di registrare la secrezione di insulina da più cellule all'interno di un isolotto integro. Per preparare gli enzimi necessari all'isolamento degli isolotti pancreatici, diluire un'ampolla contenente cinque milligrammi di liasi TL con 26 millilitri di DMEM, preparare la collagenasi di tipo quattro nel buffer di Hank a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro, quindi integrare con le seguenti soluzioni di liasi TL e collagenasi miste.

In un rapporto di quattro a uno in volume, suddividere la miscela di enzimi in aliquote da 2,5 millilitri ciascuna e conservare a -20 gradi Celsius. Per preparare il mezzo di isolamento RPMI in un grande matraccio conico contenente un litro di acqua, sciogliere una fiala di polvere RPMI 1640 a temperatura ambiente e aggiungere 2 grammi di bicarbonato di sodio e 4,02 grammi di HEPES. Utilizzare l'idrossido di sodio per regolare il pH a 7,4, quindi filtrare, sterilizzare e conservare a 4 gradi Celsius.

Preparare il mezzo di coltura RPMI aggiungendo il 10% di FBS e l'1% di antibiotici al mezzo di isolamento RPMI per l'immagine a due fotoni. Preparare il tampone extracellulare ricco di sodio con i seguenti reagenti. Per preparare il colorante extracellulare, preparare una soluzione madre da otto millimoli di SRB e suddividere il tampone extracellulare in aliquote in provette piccole, quindi conservare a meno 20 gradi Celsius.

Per ottenere una concentrazione di lavoro, utilizzare il buffer extracellulare fresco per diluire la soluzione madre di SRB da uno a dieci. Dopo aver sacrificato un topo e aver spruzzato accuratamente il corpo del topo con etanolo al 70% secondo il protocollo descritto nel testo, posizionare l'animale con la testa rivolta verso e la coda lontana dal chirurgo. Effettuare due incisioni laterali lunghe attraverso la cute addominale e il peritoneo per creare una linguetta a forma di V.

Sollevare la falda della pelle per esporre l'intera cavità addominale. Mettere da parte l'intestino e, utilizzando un lembo di tessuto piegato, mantenere il fegato in posizione per rivelare il dotto biliare comune. Successivamente, applicare una pinza vascolare sull'ambula nella parete del duodeno per impedire agli enzimi iniettati di entrare nel duodeno.

Questo è un passaggio importante che determina se gli enzimi pancreatici entrano nel dotto pancreatico per reflusso, nel sito di iniezione o nel duodeno. Utilizzare un ago da 31 gauge per canulare il dotto biliare comune in prossimità della giunzione tra il dotto epatico comune e il dotto cistico, lasciando spazio per una seconda iniezione. Se il pancreas non viene perfuso correttamente al primo tentativo, iniettare lentamente circa due millilitri di miscela enzimatica fredda nel dotto biliare comune del topo.

Se la pinza è nella posizione corretta, il pancreas verrà perfuso rapidamente. Una volta perfuso il pancreas, rimuovere velocemente l'organo, collocarlo in un vial di vetro e incubarlo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per circa 19 minuti. Al termine dell'incubazione, arrestare il processo di digestione aggiungendo circa 20 millilitri di mezzo di isolamento freddo.

Agitare delicatamente il viallo per rompere il pancreas e versarlo attraverso un setaccio normale T con fori di un millimetro in un tubo sterile da 50 millilitri. Utilizzare il mezzo di isolamento per riempire il tubo e centrifugare a 400 G e 4 gradi Celsius per un minuto. Con l'interruzione, aggiungere il mezzo di isolamento al palato e scioglierlo.

Quindi trasferire la sospensione in due provette da 15 millilitri e centrifugare una seconda volta. Dopo aver aspirato il soprannatante, aggiungere sei millilitri di mezzo di separazione cellulare a gradiente di densità in ciascuna provetta e risospendere mediante pipettaggio o vortex. Successivamente, lungo la parete delle provette, aggiungere delicatamente circa sei millilitri di mezzo di isolamento sopra il mezzo di separazione a gradiente di densità e centrifugare a 100 ×g e 4 gradi Celsius per 15 minuti.

Con la separazione, raccogliere gli strati superiore, medio e inferiore in tre piatti separati. Quindi, sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare una pipetta per selezionare manualmente gli anelli oculari nei tre piatti. La maggior parte si troverà nello strato medio, il che aiuta gli anelli oculari a riprendersi dalla digestione enzimatica.

Preparare gruppi di 40 isolotti in piastre di Petri da 25 centimetri con sei millilitri di mezzo di coltura RPMI contenente glucosio 10 millimolare e coltivare per due giorni. Cambiare il mezzo ogni giorno ed eseguire l'immagine a due fotoni come saggio indiretto per misurare la secrezione di insulina. Iniziare pre-incubando gli isolotti coltivati per due giorni con glucosio 3 millimolare in buffer extracellulare.

Per 30 minuti, applicare grasso sulla piastra del microscopio per evitare che la soluzione fuoriesca e montare sulla piastra del microscopio una camera di controllo termico contenente un vetrino. Successivamente, coprire la camera con 500 microlitri di buffer extracellulare contenente 0,8 millimoli, SRB e varie concentrazioni di glucosio. Poi, posizionare l'occhiello pre-incubato al centro della camera e mettere a fuoco a una profondità di tre o quattro strati cellulari all'interno dell'occhiello.

Negli occhi dei roditori, la colorazione immunoistochimica per l'insulina mostra che la maggior parte delle cellule sono cellule beta. Quindi, mediante microscopio a due fotoni e un obiettivo ad immersione in olio da 60x, identificare singoli eventi esocitotici acidi attraverso la comparsa improvvisa di una piccola macchia fluorescente. Infine, nel software di analisi dell'immagine, confermare un evento mediante la rapida fase di aumento del segnale fluorescente in una regione di interesse per un topo di tipo selvaggio.

Si prevede di ottenere circa 200 occhiolini seguendo il protocollo dimostrato in questo video. Gli occhiolini sani appaiono luminosi, di forma rotonda e con un bordo regolare. Un lotto di isolamento sottoposto a digestione eccessiva presenta solitamente occhiolini piccoli e sfocati, nonché occhiolini con cellule asar attaccate.

Mentre un lotto sovradigerito presenta un numero ridotto di pori nel saggio a due fotoni in risposta a stimoli come glucosio o granuli di insulina con potassio elevato fusi con la membrana plasmatica, un SRB entra nei granuli, determinando l'aspetto di un improvviso punto fluorescente, con un diametro di circa 400 nanometri. Nel periodo registrato, tutti gli eventi di esocitosi in risposta allo stimolo vengono identificati, insieme alla posizione degli eventi, al momento del loro insorgenza, alla durata e al tipo di fusione. Eventi come KISS e Run o fusione completa vengono caratterizzati ed è utile per valutare eventuali difetti nella fusione dei granuli in modelli di diabete di tipo due.

Questo metodo è stato utilizzato per dimostrare che il difetto negli isolotti di topi diabetici DB DB è la perdita della fusione completa dei granuli e non un cambiamento nella cinetica della fusione individuale dei granuli. Inoltre, il fattore principale che influenza la ridotta secrezione di insulina nella malattia è una diminuzione del numero di cellule responsivi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione della perfusione pancreatica e dell'attuazione degli isolotti dal topo RDB, e si dovrebbe essere in grado di eseguire i due saggi sulla lingua per valutare le risposte secretorie all'interno degli isolotti integri.