Name: Valutazione del tumore infiltrante leucociti sottoinsiemi in un tumore sottocutaneo modello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Scopri come analizzare i sottoinsiemi di leucociti infiltranti nel microambiente tumorale utilizzando un modello murino di melanoma B16 e la citometria a flusso. Questo metodo consente di caratterizzare le dinamiche delle cellule immunitarie in vivo.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni R01-CA169354 &#160; e R01-047822 &#160; dal National Institutes of Health e un Merit Award dal Department of Veterans Affairs (BCE). RKP è stato sostenuto da NIH T32 CA009287-30A1, un ASCO Young Investigator Award, California Breast Cancer Research Fellowship progetto, e un American Cancer Society Mentored Research Scholar di Grant; BAZ è stato sostenuto da NIH concedere AI079320. JM è stato sostenuto da borse di NIH T-32 borsa di formazione T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 e American Cancer Society borsa di studio post-dottorato PF-12-052-01-CSM.

NOTA: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità approvato Stanford, Palo Alto VA HCS, e National Institutes of Health istituzionale AnimalCare e uso Comitato le linee guida. 1. Preparazione per Prelievo e Processing (Tempo richiesto: ~ 10-15 min) <ol><li> Seminare murine cellule B16F0 melanoma (0,5-1 x 10 6) per via sottocutanea o vicino alla linea mediana dell&#39;addome in femminile C57BL / 6 topi come descritto in precedenza 6. In alternativa, inoculare le cellule tumorali in altri siti anatomici (es fianco, pad grasso mammario, etc). NOTA: Qualsiasi numero di tumori (impiantato o spontaneo) può essere utilizzato e valutato utilizzando questo protocollo. Ad esempio, altro comunemente usato tumori singenici in C57BL / 6 includono la linea colon MC38, Lewis carcinoma polmonare (LLC), e la linea prostata TRAMP-C2. Mentre xenotrapianti umani in topi immunodeficienti inoculate possono essere valutati in questo modo, va osservato che la profiles dei leucociti infiltranti il ​​tumore necessariamente essere modificati in conformità con lo stato immunodeficienti del mouse ospitante. <ol><li> Utilizzare supporti completo (ad esempio RPMI contenente 10% FBS e additivi) o un altro tampone contenente proteine ​​appropriata (ad es HBSS o PBS + 1% FBS o 1% BCS). Raffreddare i media o tampone a 4 ° C prima euthanization. </li></ol></li><li> Impostare tubi di raccolta e filtri per i tumori asportati; mettere questi su ghiaccio. <ol><li> Utilizzare un tubo da 50 ml conica per tumore sia asportato. Inserire un filtro sospensione di cellule 40-70 micron di ciascuno. In alternativa, utilizzare 15 ml provette coniche con filtro a rete metallica. Utilizzare 5 ml stantuffo della siringa o una penna di spessore per creare un filtro a tazza in cima al tubo 15 ml. </li></ol></li><li> Preparare strumenti per la resezione del tumore e di trasformazione; Utilizzare pinze chirurgiche e forbici sottili per resecare e tumori di processo. Utilizzare 70% di etanolo per pulire gli strumenti tra i campioni resezioni / tumorali. Per numero maggiore ocampioni F (ad esempio&gt; 10), si consiglia l&#39;elaborazione simultanea di campioni da parte di più ricercatori per evitare differenze significative nel tempo di elaborazione tra i campioni tumorali. </li></ol> 2. Tumore resezione (Tempo richiesto: ~ 5 min / tumorale) <ol><li> Euthanize B16 tumore topo, utilizzando singolarmente biossido di carbonio o altro metodo approvato. </li><li> Fissare il mouse su un palco chirurgica. Spruzzare la zona tumorale con il 70% di etanolo e pulire in eccesso; questo aiuta a prevenire la diffusione di tutti i capelli presenti. Per i topi non-nudo, radere l&#39;area pelle intorno al tumore prima della resezione, se necessario. </li><li> Utilizzando pinze e forbici, resecare il tumore sottocutaneo in blocco, compreso sovrastante e la pelle circostante. La quantità di &quot;margine&quot; pelle presa può variare, ma in genere resecare 2-3 mm della pelle intorno al tumore. <ol><li> Pesare tumori resezione (+/- cute circostante), a questo punto. Posizionare la sezione pelle / tumore asportato nel filtro fissato all&#39;interno del pltubo conico astic. </li></ol></li></ol> 3. Preparare una sospensione Tumor singola cella (Tempo richiesto: ~ 5-7 min / tumorale) <ol><li> Utilizzare pinze e forbici per tritare tumore e sovrastante / pelle circostante. Tritare il campione con le forbici fino a quando tutte le grandi sezioni di tessuto vengono trasformati in sezioni 1-2 mm. NOTA: in genere, i tumori interi vengono elaborati; In alternativa, per i tumori di maggiori dimensioni, sezioni rappresentative dei tumori possono essere tritati e trattati. </li><li> Utilizzando un pistone da una siringa monouso 5 o 10 ml, disaggregare meccanicamente il tessuto tumorale tritata contro il filtro garantito. </li><li> Utilizzando una pipetta, lavare il tessuto tumorale trattati con 5-10 ml di mezzi freddo o buffer. Questo filo singole cellule attraverso il filtro. </li><li> Ripetere i due passaggi precedenti più volte, assicurando che il numero totale e volumi di lavaggi sono circa gli stessi per i tumori di dimensioni simili. <ol><li> Dopo aver lavato il tessuto tumorale elaborato, osservarepiccoli frammenti di pelle e / o di altri tessuti connettivi devono essere lasciati nel filtro. </li><li> In alternativa, per i tumori in cui solo disaggregazione meccanica può non essere sufficiente, la digestione con collagenasi e / o altri enzimi può essere eseguita prima della procedura di macinazione. Ciò consentirà una sospensione più approfondita singola cellula. Tuttavia, va notato che tali protocolli di digestione possono influenzare l&#39;espressione dell&#39;antigene di superficie 20, quindi si deve usare cautela nell&#39;interpretazione di questi risultati. </li></ol></li><li> Lavare e agglomerare le cellule aggiungendo media / tampone e centrifugazione a 4 ° C 500 g per 5 min. </li></ol> 4. FACS colorazione di sospensione singola cella (Tempo richiesto: ~ 30-60 min) <ol><li> Risospendere le cellule in tampone FACS ghiaccio freddo (PBS + 1% FBS). </li><li> Contare cellule vitali con trypan blu e un emocitometro o contatore di cellule automatizzati. </li><li> Determinare la resa di cellule vitali totale per volume. Questi dati possono essere utilizzati per estrapolarenumero assoluto di tumore leucociti infiltranti in combinazione con dati FACS. </li><li> Determinare il numero di celle da colorare e analizzato mediante FACS. Questo sarà influenzato da diversi fattori (ad esempio tumore tipo istologico, età e dimensione del tumore, percentuale media di leucociti infiltranti, etc.). NOTA: In B16 melanoma, abbiamo trovato una bassa percentuale di tumori infiltranti leucociti (TIL, in genere &lt;5%) rispetto alle cellule tumorali. Così, almeno 1 x 10 6 tumore totale (tumori + leucociti infiltranti) le cellule sono state in genere raccolti via FACS per l&#39;analisi. <ol><li> Utilizzando i dati di conteggio Trypan-macchiato, volume calcolato di cellule da colorare per FACS. Ad esempio, se TIL tipicamente costituiscono 5% delle cellule tumorali totali (molte delle cellule tumorali sarà morto macchia trypan), fattore questo nel numero totale di tumore sospensione singola cella da colorare. </li><li> Per sottoinsiemi di leucociti meno comuni esempio CCR9 + pDC) utilizzare un numero maggiore di cellule tumorali totali (ad esempio 2-3 x 10 6) per FACS colorazione, data la bassa frequenza relativa di queste cellule in sospensione di cellule singole. </li></ol></li><li> Colorare la sospensione singola cellula tumorale per FACS. <ol><li> Per discriminazione live / morto, utilizzare una macchia risolvibile o macchia non risolvibile (ad esempio ioduro di propidio) può essere utilizzato. Se cellulare sono macchiati senza discriminazioni live / morti, cautela deve essere informato dato il potenziale di legame non specifico degli anticorpi. </li><li> Colorare la sospensione cellulare per specifici sottoinsiemi di leucociti utilizzando un protocollo di colorazione FACS standard. Cellule blocchi per ridurre vincolante con PBS / FBS contenente siero di ratto 1% e Fc block (anti-CD16 / 32) per 10 min prima della colorazione con anticorpi antigene-specifici anticorpi non specifico. Includere gli anticorpi giusti controllo isotipo per assicurare la colorazione è specifica. </li><li> A questo punto, dopo la colorazione FACS è completa, fissare campioni con 4% di formaldeide o altro agente fissativo simile. Conservare i campioni a 4 ° C in dark (da evitare quenching di fluorofori) fino al momento della raccolta e l&#39;analisi. NOTA: Memorizzazione campioni fissati per lunghi periodi di tempo può provocare l&#39;alterazione del segnale e l&#39;intensità dei fluorofori 21. </li><li> Raccogliere i campioni su un citometro di flusso. Flusso ottimale citometro impostazioni variano a seconda del tipo di strumento e impostazione laser / rivelatore. NOTA: Inoltre, ci può essere la variabilità tra esperimenti, anche se si utilizza la stessa macchina. Quindi, eseguire appropriata configurazione della macchina (ad esempio utilizzando perline di calibrazione) per garantire un&#39;adeguata impostazione della compensazione prima della raccolta e l&#39;analisi di ogni esperimento FACS. </li></ol></li><li> Analisi di sottoinsiemi leukoctye <ol><li> Utilizzando il software di analisi dei dati FACS, per analizzare i dati. Per un live macchia / morto, iniziare gating fuori le cellule morte. Usare anticorpi contro un marcatore specifico dei leucociti (ad esempio anti-CD45) per identificare leucociti all&#39;interno delle cellule vive. <ol><li> Dopo questa operazione, utilizzare vari Gatiregimi ng per identificare sottoinsiemi specifici, a seconda del protocollo di colorazione. Ad esempio, per identificare le cellule CD4 + T, selezionare la regione SSC lo dalla popolazione CD45 + e selezionare le cellule CD19 +-CD3; da queste cellule CD4 + T può essere identificato 22. </li></ol></li><li> Analizzare i dati e presentarli in un certo numero di modi diversi per garantire la coerenza e identificare i modelli o le tendenze (ad esempio utilizzare un totale di numeri, percentuali o rapporti di quantificare sottoinsiemi). NOTA: Per esempio, abbiamo guardato totale CD45 + cellule dal vivo come percentuale di cellule tumorali totali raccolti (Figura 1). Inoltre, abbiamo quindi calcolato la percentuale di ciascun sottogruppo di leucociti (ad esempio, le cellule CD4 + T) all&#39;interno del tumore e confrontato questi come i rapporti tra il controllo e gruppi di test (Figura 3). </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Esecuzione di analisi dettagliata del microambiente tumorale è fondamentale nel determinare i meccanismi e gli effetti di immunomodulazione. Con la crescente presenza di immunotherapeutics nel regno clinico umano, comprendere l&#39;impatto di questi agenti sui leucociti infiltranti il ​​tumore sta diventando necessaria per definire il loro meccanismo d&#39;azione. Negli esseri umani, esistono spesso difficoltà cliniche e / o logistiche nell&#39;ottenere e analizzando tessuto tumorale per l&#39;analisi dei leucociti sott...

L&#39;equilibrio tra la crescita del tumore e la promozione e la regressione è, in parte, dipende l&#39;equilibrio del tumore infiltrante leucociti pro- e anti presenti nel microambiente 1,2. Per studiare il microambiente tumorale (TME) e in particolare individuare le sottopopolazioni di leucociti infiltrante, abbiamo sviluppato un metodo per la valutazione dei tumori sottocutanei in un modello murino di tumore. L&#39;importanza di studiare il microambiente tumorale è ben noto e supportato in letteratura. Numerosi studi hanno dimostrato che l&#39;equilibrio delle cellule immunitarie pro e anti-tumorali infiltranti può influire i risultati di crescita del tumore, non solo nel topo, ma anche studi sull&#39;uomo (recensito in 3,4). Ad esempio, Curiel et al. Hanno dimostrato che hanno peggiorato i risultati clinici nei pazienti con tumore ovarico sono stati correlati con la presenza di percentuali crescenti di regolamentazione cellule T CD4 + infiltranti il tumore (Tregs) 5. Il nostro lavoro ha dimostrato l&#39;effetto di un novel leucociti chemiotattico sul rapporto di sottoinsiemi di leucociti in un modello murino di melanoma 6, che anche correlata con diminuita crescita tumorale. Pertanto, le analisi dettagliate dei sottoinsiemi dei leucociti in un tumore è ora più ampiamente riconosciuto e sempre più importante. Ci sono molti modi per valutare il microambiente tumorale per infiltrazione leucociti; per esempio gruppi hanno ingegnerizzato topi transgenici per esprimere diverse proteine ​​fluorescenti al fine di immagine TME 7, immunoistochimica classica e immunofluorescenza di sezioni conservate 8, comprese varie modalità di imaging quali MRI, PET, la microscopia confocale 9-11 - alcuni con la capacità di monitorare intravitally 10,12. Questi possono essere utilizzati con vari agenti di imaging molecolare, come nanoparticelle 13 o nuovi agenti di contrasto 14 che etichetta cellule immunitarie. Il nostro metodo è un approccio basato citometria di flusso e presenta diversi vantaggi.In primo luogo, l&#39;intero microambiente tumorale può essere campionato; al momento dell&#39;analisi, l&#39;intero tumore sottocutaneo e periferia circostante è chirurgicamente asportati per l&#39;elaborazione. Ciò elimina qualsiasi polarizzazione potenzialmente campionamento all&#39;interno di un singolo tumore e dà un&#39;analisi più &quot;globale&quot; del tumore nel suo complesso. In secondo luogo, noi utilizzando il flusso multicolor citometria di analizzare i sottoinsiemi di leucociti permette di valutare più specificamente il fenotipo dei leucociti infiltranti. A seconda del numero di colori usati, sottoinsiemi molto specifici possono essere identificati. Questo è importante in quanto vi sono diversi sottoinsiemi dei leucociti all&#39;interno di un particolare tipo di cellule - o anche in una classifica generale sottotipo - che hanno funzioni diverse che sono potenzialmente significativo nel determinare il destino del tumore. Ad esempio, le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) sono stati implicati in antitumorale immunità 15. Tuttavia, il sottoinsieme CCR9 + di pDC ha dimostrato di essere tollerogenico 16, e spostando il balance di tale sottoinsieme può avere un impatto sulla crescita tumorale. Il nostro metodo è appropriato per sottocutanea o altri tumori che possono essere asportate in blocco. Nelle nostre mani, tumori sono stati uniformemente resecati al momento della eutanasia. Tuttavia, è concepibile, come è stato fatto in alcuni studi, che un tumore sottocutaneo potrebbe essere completamente asportato con chiusura della pelle circostante in una chirurgia di sopravvivenza 17, consentendo così la valutazione ulteriore dell&#39;animale. L&#39;analisi viene quindi eseguita sul tumore resecato. Pertanto, i risultati rappresentano un unico tempo di valutazione nello sviluppo del tumore. Mentre questo permette uno sguardo dettagliato nel microambiente, è anche un&#39;immagine statica di ciò che è senza dubbio un processo dinamico. Tuttavia, leucociti isolati (ad esempio via magnetico separazione o gradiente di densità) possono poi essere analizzati separatamente dal epiteli tumore e stroma, o utilizzati in altri, saggi funzionali per definire ulteriormente la loro fenotipo, come è stato previdentemente descritto 18. Questo metodo, quindi, sarebbe utile per eventuali investigatori interessati a comprendere la composizione dei leucociti all&#39;interno del microambiente tumorale in un dato punto di tempo, sia nella cornice del corso malattia naturale, o dopo uno specifico perturbazione terapeutica. Sebbene non sia fatto da noi, variazioni di questo procedimento potrebbe anche potenzialmente essere utilizzati per analizzare porzioni specifiche di un tumore in isolamento. Ad esempio, date le dimensioni del tumore, la zona periferica (s) può essere scisso dalla centrale, eventualmente nucleo necrotico del tumore per dare il ricercatore una visione più spazialmente segregati del microambiente tumorale. Nel settore in rapida crescita del tumore immunologia, non ci sarà senza dubbio un numero esponenzialmente crescente di studi che valutano nuovi agenti immunomodulatori in modelli tumorali murini. Diversi studi hanno messo in evidenza le differenze in funzione dei leucociti specifica all&#39;interno del tumore rispetto al periferico enbiente. Ad esempio, Shafer-Weaver et al. Ha dimostrato in un modello murino che CD8 + cellule T antigene-specifica effettrici, mentre attiva in periferia, sono state trasformate in cellule soppressori CD8 + T, una volta vittime della tratta nel microambiente tumorale 19. Questo è stato in parte dovuto al TGFβ, ma altri fattori sono probabilmente coinvolti pure. Pertanto, la valutazione sottoinsiemi leucociti - numeri e rapporti, nonché lo stato funzionale - entro il tumore stesso darà una rappresentazione più accurata degli effetti di un particolare immunomodulazione sul destino tumore. La nostra tecnica permette un&#39;analisi dettagliata del tumore e fornisce il ricercatore la possibilità di individuare più da vicino i cambiamenti nelle popolazioni di leucociti che approcci precedenti.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro</td><td>10-040</td><td>http://cellgro.com; tenere sul ghiaccio</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td>http://cellgro.com</td></tr><tr><td>50 ml tubi conici</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>40 &#956; m filter</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>fischersci.com siringa da 5 ml</td><td>BD</td><td>14-823-35</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>forbici/pinze chirurgiche</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>roboz.com</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-030-CM</td><td>http://cellgro.com; tenere sul ghiaccio</td></tr><tr><td>tripano blu</td><td>Cellgro</td><td>MT-25-900-CI</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>ecitometro</td><td>Hausser Scientifice&nbsp;</td><td>02-671-54&nbsp;</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>Macchia viva/morta</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td>lieftechnologies.com</td></tr><tr><td>software FlowJo</td><td>TreeStar, Inc</td><td></td><td>flowjo.com</td></tr></tbody></table>

valutazione del tumore infiltrante leucociti sottoinsiemi in un tumore sottocutaneo modello

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Cellule immunitarie specializzate che infiltrano il microambiente tumorale regolano la crescita e la sopravvivenza di neoplasia. Le cellule maligne devono eludere o sovvertire antitumorali risposte immunitarie per sopravvivere e prosperare. Tumori approfittare di una serie di diversi meccanismi di immune &quot;fuga&quot;, tra cui l&#39;assunzione di tollerogenico DC, cellule T regolatorie immunosoppressori (Tregs), e le cellule mieloidi soppressori di derivazione (MDSC) che inibiscono le risposte antitumorali citotossici. Al contrario, le cellule immunitarie anti-tumorale effettrici possono rallentare la crescita e l&#39;espansione di tumori maligni: cellule dendritiche immunostimolante, cellule killer naturali che ospitano innata immunità anti-tumorale, e le cellule T citotossiche tutti possono partecipare alla soppressione del tumore. L&#39;equilibrio tra pro e anti-tumorali leucociti determina in ultima analisi, il comportamento e il destino delle cellule trasformate; una moltitudine di studi clinici umani hanno portato questo fuori. Pertanto, l&#39;analisi dettagliata di sottoinsiemi di leucociti all&#39;internomicroambiente tumorale è diventato sempre più importante. Qui, si descrive un metodo per analizzare sottoinsiemi di leucociti infiltranti presenti nel microambiente tumorale in un modello di tumore del mouse. Cellule tumorali di melanoma mouse B16 sono state inoculate sottocute in topi C57BL / 6. In un periodo di tempo specificato, i tumori e la pelle circostante sono stati asportati in blocco e trasformati in sospensioni di cellule singole, che sono stati poi macchiati per il multi-color citometria a flusso. Utilizzando una varietà di marcatori leucociti sottoinsieme, siamo stati in grado di confrontare le relative percentuali di infiltrazione sottoinsiemi di leucociti tra controllo e tumori chemerina esprimono. Gli investigatori possono utilizzare tale strumento per studiare la presenza immunitaria nel microambiente tumorale e quando combinato con le misure tradizionali di dimensioni pinza di crescita tumorale, potenzialmente permetterà loro per chiarire l&#39;impatto dei cambiamenti in composizione immune sulla crescita tumorale. Tale tecnica può essere applicata a qualsiasi modello di tumore in cui il tumore ed il suo microambiente cun essere asportato e trattati.

I nostri risultati hanno dimostrato che forzata over-espressione di chemerina nei tumori B16 murini augmented la percentuale di tumori infiltranti leucociti (TILS). Inoltre, sono stati identificati modifiche al rapporto relativo di sottoinsiemi di leucociti rappresentate nel microambiente tumorale associato con espressione chemerina. Re-stampa con il permesso di Pachynski et al. 6. La Figura 1 mostra che c&#39;è stato un significativo aumento totale CD45 + ...

Questo protocollo descrive un metodo per la valutazione dettagliata dei sottogruppi di leucociti all'interno del microambiente tumorale in un modello tumorale di topo. Le cellule di melanoma B16 che esprimono chemerina sono state impiantate per via sottocutanea in topi singenici. Le cellule del microambiente tumorale sono state quindi colorate e analizzate mediante citometria a flusso, consentendo analisi dettagliate dei sottogruppi di leucociti.

Valutazione del tumore infiltrante leucociti sottoinsiemi in un tumore sottocutaneo modello

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è effettuare un'analisi dettagliata dei leucociti infiltranti in un modello murino di tumore sottocutaneo. Questo viene ottenuto innanzitutto inoculando cellule di melanoma murino B16F0 da topi femmina C57BL/6 per indurre la crescita del tumore in vivo. Successivamente, i topi portatori del tumore B16 vengono soppressi e il tumore sottocutaneo viene resecato in blocco, insieme alla cute sovrastante e circostante.Quindi viene isolata una sospensione monocellulare composta da cellule tumorali e da leucociti infiltranti il tumore, che può successivamente essere analizzata mediante citometria a flusso. Infine, si determina il rendimento di cellule vitali per volume e si calcola il numero di cellule da colorare e analizzare mediante facts. In ultima analisi, la citometria a flusso viene utilizzata per mostrare la frequenza e il tipo di sottopopolazioni leucocitarie presenti nell'ambiente tumorale.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi del cancro, poiché è possibile valutare gli effetti di una terapia sui leucociti all'interno dell'ambiente microscopico del tumore. È questo equilibrio tra cellule effettrici e soppressorie a determinare se il tumore cresce o regredisce. Per indurre la crescita tumorale, inoculare sottocutaneamente cellule di melanoma murino B16F10 in un buffer fisiologico, come soluzione salina tamponata al fosfato, in prossimità della linea mediana dell'addome di topi femmina C57BL/6, secondo il protocollo descritto nel testo. Da sette a 14 giorni dopo, appena prima dell'escissione dei tumori, preparare un tubo conico da 50 millilitri per ogni tumore e porlo sul ghiaccio.Inserire un filtro per sospensione cellulare da 40 a 70 micron in ogni tubo. Preparare pinze chirurgiche e reperire forbici per la resezione e alcol al 70% per pulire gli strumenti tra un campione tumorale e l'altro dopo l'eutanasia di un topo portatore di tumore B16; secondo il protocollo descritto nel testo, fissare il topo su un supporto chirurgico, spruzzare l'area tumorale con alcol al 70% e rimuovere i peli in eccesso per evitare la dispersione. Assicurarsi che l'alcol topico sia completamente rimosso ed evaporato prima di resecare il tumore utilizzando pinze e forbici; resecare il tumore sottocutaneo in blocco, compresa la cute sovrastante e circa due o tre millimetri di cute circostante.Pesare i tumori resecati con e senza la pelle circostante e posizionare ciascun frammento in un filtro all'interno di un tubo conico. Per preparare una sospensione tumorale monocellulare, utilizzare pinze e forbici per tritare il tumore e la pelle sovrastante e circostante finché tutte le grandi porzioni di tessuto non vengono ridotte in frammenti di uno-due millimetri. Successivamente, utilizzando lo stantuffo di una siringa monouso da cinque o 10 millilitri, disgregare meccanicamente il tessuto tumorale tritato contro il filtro fissato.Quindi, con una pipetta, aggiungere da cinque a 10 millilitri di mezzo freddo, o tampone, per lavare il tessuto tumorale processato. Questo permetterà di far passare le cellule singole attraverso il filtro.Ripetere più volte i passaggi di disgregazione e lavaggio, assicurandosi che il numero totale e i volumi dei lavaggi siano approssimativamente gli stessi per tumori di dimensioni simili. Dopo aver lavato il tessuto, verificare che piccoli frammenti di pelle e/o altro tessuto connettivo siano rimasti nel filtro; per lavare e formare il pellet delle cellule, aggiungere mezzo e centrifugare a 500 G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Per eseguire l'analisi del fax, utilizzare tampone fax freddo di ghiaccio per risospendere le cellule.Quindi, mediante colorazione con trian blu e conteggio con citometro ematico, le cellule vitali determinano il numero totale di cellule vitali per volume, da utilizzare per estrapolare i valori assoluti dei leucociti infiltranti il tumore o TIL in combinazione con FACS. I dati ottenuti dal conteggio con colorazione trian permettono di calcolare il volume di cellule da sottoporre a marcatura per FACS. Ad esempio, se i TIL costituiscono tipicamente il 5% delle cellule tumorali totali, considerare questo valore nel calcolo del numero totale di cellule tumorali in sospensione da marcare.Per colorare le cellule al fine di discriminare tra cellule vive e morte, utilizzare un colorante fissabile o non fissabile, come l'ioduro di propidio. Successivamente, utilizzare FBS in PBS con siero di ratto all'1% e blocco FC per bloccare le cellule per 10 minuti, prima di applicare un protocollo standard di colorazione per superficie per colorare la sospensione cellulare per sottopopolazioni specifiche di leucociti.Dopo la colorazione, fissare i campioni con paraformaldeide al 4% e conservarli a quattro gradi Celsius al buio fino al momento della raccolta e dell'analisi. Utilizzare un citometro a flusso per raccogliere i campioni con facts. Il software di analisi dei dati inizia escludendo le cellule morte, quindi, mediante un anticorpo contro un marcatore specifico dei leucociti come l'anti CD 45, identifica i leucociti all'interno delle cellule vitali.Successivamente, utilizzare diversi schemi di gating per identificare sottoinsiemi specifici in base al protocollo descritto. Analizzare i dati e presentarli in diversi modi per garantire coerenza e identificare modelli o tendenze, come mostrato qui. L'overespressione forzata di kein in tumori murini B16 resecati al giorno 17 ha determinato un aumento significativo delle cellule totali positive per CD45 rispetto ai controlli in questa figura, mediante immunofluorescenza su sezioni criostatiche di tumori B16.È stato confermato un aumento delle cellule CD45 positive infiltranti provenienti dai tumori. Un'ulteriore analisi dei dati fax mostra un aumento relativo medio di cellule NK, cellule T e cellule dendritiche convenzionali CD11c positive. Nei tumori in cui kein era sovraespresso rispetto ai tumori di controllo, si è osservata anche una diminuzione relativa della percentuale di leucociti immunosoppressori, inclusi le cellule soppressorie di origine mieloide e le cellule dendritiche plasmacitoidi.Studi hanno dimostrato che il rapporto tra i sottoinsiemi di leucociti all'interno del tumore può rappresentare un fattore importante in termini di crescita tumorale e risultati clinici; a sostegno di ciò, il numero di cellule T positive per CD three e cellule NK per tumore risultava progressivamente maggiore nei tumori esprimenti kein rispetto ai controlli. Questa figura mostra che, in un confronto diretto tra popolazioni di cellule effettrici e soppressive all'interno del microambiente tumorale, aumenti significativi nei rapporti tra cellule effettrici e popolazioni soppressive erano evidenti nei tumori esprimenti kein. Rispetto ai controlli, seguire questa procedura.Altri metodi come il sorting cellulare o l'isolamento cellulare possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardanti la funzionalità dei leucociti infiltranti il tumore.

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In questo rapporto, descriviamo un protocollo per isolare popolazioni altamente purificate di leucociti che infiltrano i tumori. Questo protocollo è stato adattato dal Miltenyi Biotech protocollo per migliorare la resa e la purezza per isolare cellule dal tessuto tumorale complessa.

Isolamento di cellule immunitarie di tumori primari

Questo protocollo descrive la rapida dissociazione non enzimatica di frammenti di tessuto umano fresco per la valutazione qualitativa e quantitativa delle cellule CD45+ (linfociti/leucociti) presenti in vari tessuti umani normali e maligni. Inoltre, il surnatante ottenuto dall'omogenato del tessuto primario può essere raccolto e conservato per ulteriori analisi o sperimentazioni.

Un semplice e rapido protocollo non-enzimaticamente dissociare freschi tessuti umani per l&#39;analisi di linfociti infiltranti

Qui descriviamo un metodo per separare e arricchire i componenti del microambiente tumorale immuni e non immuni in tumori sottocutanei stabiliti. Questa tecnica permette l'analisi separata di tumore immuni si infiltra in e frazioni non immune tumore che possono consentire la caratterizzazione completa del microambiente tumorale immuni.

Arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e Non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti

Qui, noi dimostrare i metodi per la quantificazione in vivo d'uscita del leucocita da ingenuo, infiammato e maligni della pelle murino. Eseguiamo un confronto testa a testa tra due modelli: transdermico FITC applicazione ed in situ fotoconversione. Inoltre, dimostriamo l'utilità di fotoconversione per servizi esterni del leucocita di rilevamento da tumori cutanei.

Quantificazione del leucocita Egress tramite vasi linfatici dalla pelle murina e tumori

Qui presentiamo un metodo riproducibile per lo sviluppo di un modello murino ortotopico di carcinoma di cellule squamous testa e del collo. I tumori dimostrano clinicamente rilevanti caratteristiche istopatologiche della malattia, compreso necrosi, differenziazione difficile, le metastasi nodali e infiltrazione immune. Topi del tumore-cuscinetto sviluppano sintomi clinicamente rilevanti tra cui disfagia, spostamento mascella e la perdita di peso.

Intramucosa inoculazione delle cellule di Carcinoma di cellule Squamous nei topi per profilatura Immune tumore e valutazione della risposta di trattamento

Qui, presentiamo un protocollo di trapianto tumorale per la caratterizzazione di linfociti infiltrati tumorali intrinseci e periferici derivati dal tumore in un modello di tumore murino. Il tracciamento specifico dell'afflusso di cellule immunitarie derivate dal ricevente con citometria a flusso rivela la dinamica dei cambiamenti fenotipici e funzionali di queste cellule durante le risposte immunitarie antitumorali.

Trapianto di tumore per valutare la dinamica delle cellule T CD8+ infiltranti il tumore nei topi

Viene descritto un protocollo standard per studiare l'attività antitumorale e la tossicità associata di IL-1α in un modello murino singeneico di HNSCC.

Valutazione dell'attività antitumorale in vivo di nanoparticelle di polianidride IL-1α

Il protocollo presenta un modello di immunoterapia del cancro che utilizza la vaccinazione tumorale basata su cellule con melanoma B16-F10 che esprime Flt3L. Questo protocollo dimostra le procedure, compresa la preparazione di cellule tumorali in coltura, l'impianto del tumore, l'irradiazione cellulare, la misurazione della crescita tumorale, l'isolamento delle cellule immunitarie intratumorali e l'analisi della citometria a flusso.

Modello sperimentale di immunoterapia del melanoma utilizzando la vaccinazione tumorale con una citochina ematopoietica

Il disegno sperimentale qui presentato fornisce un utile modello riproduttivo per gli studi delle cellule T CD8+ antigene-specifiche durante le metastasi linfonodali (LN), che esclude la perturbazione delle cellule T CD8+ astanti.

Modello di metastasi linfonodali drenanti per la valutazione della dinamica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche durante la tumorigenesi

Con il crescente interesse per l'immunoterapia intratumorale, è essenziale selezionare modelli tumorali accessibili e pratici. I tumori sottocutanei sono facili da stabilire ma difficili da visualizzare e manipolare. In questo protocollo, descriviamo metodi per generare tumori intradermici che offrono una migliore visibilità e accessibilità.

Impianto di tumori intradermici come modello robusto per studi di immunoterapia intratumorale sul cancro delle murine

Scopri come analizzare i sottoinsiemi di leucociti infiltranti nel microambiente tumorale utilizzando un modello murino di melanoma B16 e la citometria a flusso. Questo metodo consente di caratterizzare le dinamiche delle cellule immunitarie in vivo.

Valutazione del tumore infiltrante leucociti sottoinsiemi in un tumore sottocutaneo modello

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