Name: Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Impara a stimare la proporzione di cellule staminali nel cancro al seno e valutarne la capacità di auto-rinnovo. Questo metodo utilizza saggi di mammosfera in sospensione per studiare la tumorigenesi in vitro.

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Questo lavoro è supportato dal BRC Imperiale, l&#39;Istituto Nazionale per la Ricerca Sanitaria, e lotta contro il cancro, con menzione speciale per Craft Hilary e Sir Douglas Myers.

Le procedure di seguito sono stati eticamente approvati dal Imperial College di Londra. 1. Generazione di mammospheres primarie di Human Breast Cancer Cell Lines NOTA: eseguire le seguenti operazioni sotto una cappa cultura sterile. <ol><li> Preparare Mammosphere media contenente DMEM / F12 integrato con 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 U / ml di streptomicina. Preparare completo supporto al momento dell&#39;uso con l&#39;aggiunta di 20 ng ml ricombinante fattore / di crescita epidermico umano (EGF, Sigma), 10 ng / ml ricombinante di base del fattore di crescita dei fibroblasti umani (bFGF; Sistemi di R &amp; S) e 1x B27 supplemento. </li><li> Aspirare mezzi di pallone contenente aderenti MCF-7 o MDA-MB-231 cellule (o una linea cellulare di cancro al seno di tua scelta; 70-80% confluenza), lavare due volte in 1x PBS, e trypsinize cellule. </li><li> Cellule centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min. Surnatante e risospendere le cellule decantare in 1-5 ml di mezzi mammosphere. Pipettasu e giù e se necessario utilizzare un filtro tappo filtro cella 40 micron per ottenere cella singola sospensione. Utilizzare un emocitometro per garantire una sospensione singola cella è formata (se non, utilizzare un ago G 25 alla siringa sospensione cellulare fino a 3 volte). </li><li> Se necessario isolare CD44 + CD24- sottoinsieme cellulare tramite FACS con anti-CD24-ficoeritrina (PE) e isotiocianato (FITC) anticorpi monoclonali anti-CD44 9-fluoresceina. In alternativa, isolare tale popolazione utilizzando una cella magnetica attivato l&#39;ordinamento del sistema (MACS) con anti-CD44 e anti-CD24-biotina microsfere combinati come da istruzioni del produttore. Eseguire selezione positiva utilizzando LS colonne, e selezione negativa utilizzando colonne LD e confermare i fenotipi di tutte le cellule isolate mediante citometria di flusso 17. </li><li> Calcolare il numero di cellule vitali per ml utilizzando trypan blue. NOTA: La vitalità cellulare è calcolato come il numero di cellule vitali diviso per il numero totale di celle all&#39;interno delle griglie sul hemocyTometer. Le cellule che occupano blu trypan sono considerate non vitali. La seguente procedura viene utilizzata per determinare con precisione percentuale di cellule vitali. <ol><li> Preparare una soluzione allo 0,4% di blu trypan in PBS. Aggiungere 0,1 ml di trypan blu stock soluzione a 1 ml di cellule. Caricare un emocitometro ed esaminare immediatamente al microscopio a basso ingrandimento. Contare il numero di cellule totali e il numero di cellule colorazione blu. Cellule vitali = [1.00 - (Numero di celle blu ÷ Numero di cellule totali)] × 100. </li><li> Per calcolare il numero di cellule vitali per ml di cultura, utilizzare la formula seguente. Ricordare di correggere il fattore di diluizione. Numero di cellule vitali × 10 4 × 1,1 = cellule / ml cultura </li></ol></li><li> Risospendere una quantità predeterminata di cellule in 2 ml di mezzi completi mammosphere in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti aderente ultra-bassa. La densità di semina è normalmente 500-4,000 cellule / cm 2 cellule per pozzetto. Uso Opzionalmente loattacco w piastre da 24 pozzetti, mentre la semina di cellule alla stessa densità in 0,5 ml di media. NOTA: si consiglia l&#39;ottimizzazione di densità di semina e il tempo della cultura per ogni linee cellulari di interesse. </li><li> Incubare bassa fissaggio 6 pozzetti ultra a 37 ° C e 5% CO 2 per 5-10 giorni (a seconda della linea cellulare e le dimensioni mammospheres) senza disturbare le piastre, in particolare durante la fase di crescita dei primi 5 giorni . </li></ol> 2. Generazione di mammospheres primarie di cancro al seno umano campioni clinici NOTA: tessuto del cancro del seno umano può essere ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia per la rimozione di tumori al seno. Tessuto Store sul ghiaccio per un massimo di 24 ore in 50 ml provette sterili in coltura contenente 100 U / ml di penicillina e 100 U / ml di streptomicina. Eseguire i seguenti passaggi sotto una cappa cultura sterile. <ol><li> Trasferire il campione in un piatto Petri tessuto 100 mm con un piccolo volume di media. Remove il tessuto adiposo con le forbici sterili, scapel e pinzette. </li><li> Aggiungere 2-3 ml di DMEM / F12 e tritare il campione in 1 mm 3 pezzi con scapel sterile o lama di rasoio fino a quando rimangono senza grandi pezzi. </li><li> Risospendere le parti di tessuto a pre-riscaldato a 10 ml di DMEM contenente enzimi proteolitici (3.000 U / ml di collagenasi e 1000 U / ml ialuronidasi) e incubare a 37 ° C in un agitatore rotativo fino a che tutti i frammenti di tessuto vengono digeriti. Di solito la digestione completa richiede 1-3 ore. Regolare il tempo di digestione secondo caratteri patologici di tumori. (Per esempio adenocarcinoma mammario è generalmente difficile da digerire rispetto al carcinoma mucinoso che è più fragile e richiede tempi più rapidi). Valutare il grado di digestione ogni ora ½ osservando 20 microlitri di sospensione sotto emocitometro. </li><li> Lasciare i frammenti a sedimentare per 5 minuti, poi trasferire il surnatante in una provetta di polipropilene da 15 ml conica e centrifugare a 200 xg per 10 min a temtemperatura. Decantare con cautela le cellule surnatante e risospendere in 1 - 5 ml di media mammosphere. </li><li> Seguire i passaggi 1,1-1,4 sopra descritte per linee cellulari per ottenere e piastra di sospensioni di cellule singole. Passano cellule attraverso il 25 G siringa un massimo di 2 volte, se necessario, per limitare le cellule dannose. </li></ol> 3. Mammosphere Forming Efficiency (%) Calcolo <ol><li> Dopo il periodo di coltura, contare le mammospheres (maggiori di 40 micron di diametro) con un microscopio a 40X di ingrandimento. Immagine 5 campi aleatori utilizzando una fotocamera digitale su un microscopio ottico e determinano la dimensione mammospheres utilizzando il software di acquisizione. Utilizzare qualsiasi immagine software di analisi. </li><li> Calcola Mammosphere Efficienza Forming (MFE%) mediante la seguente equazione: MFE (%) = (° mammospheres per pozzetto) / (° cellule seminate per pozzetto) x 100 </li></ol> 4. Passaging serie di mammospheres per la valutazione di Self-rinnovamento <ol><li&gt; Pipetta i supporti contenenti il ​​mammospheres di ogni bene in un tubo da 15 ml. Lavare i pozzetti con PBS e aggiungere ai media raccolti. Centrifugare a 115 xg per 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Gettare il surnatante e risospendere il pellet in 500 ml di pre-riscaldato 0,5% tripsina / 0,2% EDTA. Incubare per 2-3 min. </li><li> Aggiungere 500 ml di FCS per neutralizzare tripsina. Centrifugare a 500 g per 5 min. Gettare il surnatante e risospendere pellet in 100 ml di mammospheres media, pipettando su e giù per disaggregare sfere. </li><li> Contare le cellule con emocitometro e determinare se le cellule sono in sospensione di cellule singole. Se non passare attraverso un 25 G siringa fino a 3 volte per ottenere cellule singole. Seme le cellule in un nuovo minimo attaccamento 6 pozzetti ultra alla stessa densità utilizzata nella generazione primaria. </li><li> Dopo 5-10 giorni, contare sfere&gt; 40 micron e calcolare l&#39;efficienza sfera che forma con la formula riportata prima. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi che possa essere percepito come pregiudizievole per l'imparzialità di questo articolo.

La valutazione di successo di mammospheres primarie e secondarie si basa su cellule in fase placcato in sufficientemente basse densità che mammospheres forma da singoli cloni, con un minimo di aggregazione sfera. Tuttavia a densità che sono troppo bassi, troppo pochi mammospheres possono formare per distinguere gli effetti dei trattamenti statisticamente. Densità di semina deve essere ottimizzata per ciascuna linea cellulare utilizzata dal momento che possono variare notevolmente in loro efficienza sfera formando (color...

L&#39;esistenza di linee cellulari tumorali guidati da cellule staminali tumorali staminali come ha notevolmente aggiunto alla nostra comprensione del tumore eterogeneità. Mentre alcuni diversità fenotipica nei tumori si pone dalla conseguenza clonale di cloni geneticamente distinte, una componente importante sembra essere il risultato di differenze epigenetiche: le cellule tumorali possono passare (a volte in modo reversibile) tra stelo, progenitore, e gli stati differenziati attraverso l&#39;attivazione o la repressione di specifici geni programmi di espressione 1 - 3. Questo può riflettere cellulari fattori intrinseci o estrinseci, riflettendo il programma genica attualmente espressa in una cella con la sua conseguente Autocrino in combinazione con segnalazione paracrina dalla vicina cancro stromale o cellule immunitarie consegna fattori modulatori e condizioni microambientali quali il grado di ipossia 2,4,5. Anche se gli approcci innovativi lineage tracingstanno avanzando la nostra capacità di studiare le cellule staminali del cancro putativi in loro in vivo nicchia 6-8, saggi-sfera formando rimangono un approccio popolare e conveniente per stimare il potenziale delle cellule del cancro al seno &#39;a comportarsi come cellule staminali, almeno nelle condizioni di analisi utilizzati. E &#39;spesso usato insieme a metodi retrospettivi per le cellule staminali del cancro purificante, per la loro espressione di marcatori di membrana CD44 e CD24 9, e livelli di attività dell&#39;enzima ALDH (aldeide deidrogenasi) 10, marcatori che sono state proposte per corrispondere a più mesenchymal- e epiteliale cellule staminali del cancro -come rispettivamente 11. L&#39;approccio di formazione sfera è stato sviluppato come il saggio neurosfere, permettendo la crescita delle cellule staminali putative da singoli cloni non aderenti, condizioni privo di siero con l&#39;aggiunta di fattore di crescita epiteliale (EGF) 12, dopo essere utilmente applicato alla normalità e cancerose tessuti del seno. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; L&#39;identità della cellula fondatore sfera formatura, ei tipi di cellule miste che compongono la massa sfera, sono rilevanti per le inferenze che possono essere fatte da mammo- o altra sfera formando saggi. Osso quiescente cellule staminali in buona lungo termine, pensato per riposare in fase G0, non sperimenteranno la precisa combinazione di fattori che potrebbero favorire l&#39;attivazione in vivo. Il saggio mammosphere consente invece la crescita delle cellule sia pronta per divisione mitotica o già divisione 13. Questi progenitori, pur non essendo un cellulare veramente riposo, possono essere il palcoscenico delle cellule che prolifera con i mitogeni FEG e il fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) utilizzati nel test. Tuttavia, contengono una serie di segnalazione cellulare associata staminali attivato Percorsi di 14. Inoltre, il tasso della loro formazione riguarda la tumorigenicità del tessuto sono stati prelevati da, misurata dalla loro potenza in saggi di diluizione limitate eterotrapianti topo 2,15,16 &lt;/ Sup&gt;. Qui forniamo protocolli dettagliati per isolare singole cellule e generare mammospheres primari da entrambe le linee di cellule di cancro al seno umano e campioni clinici di tumori al seno. Abbiamo anche descrivono come eseguire passaggi seriali di mammospheres primari per valutare auto-rinnovamento, e come calcolare sfera formando efficienza che consente il confronto tra diverse densità di semina (vedi schema in figura 1).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-glutammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>100 U/ml Penicillina & Streptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Fattore di crescita dei fibroblasti basici umani ricombinanti (bFGF)</td><td>R& D systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>1x integratore di B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12399902</td><td></td></tr><tr><td>0,5% tripsina/0,2% EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>First Link UK</td><td>02-00-850</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti a basso attacco</td><td>Corning</td><td>CLS3814</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo 1A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Lamette da barba sterili</td><td>Fisher Scientific</td><td>12443170</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi sterile</td><td>Fisher Scientific</td><td>11758353</td><td></td></tr><tr><td>Microdissezione sterile forbici</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146</td><td></td></tr></tbody></table>

mammosphere saggio formazione di human breast cancer tessuti e linee cellulari

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Simile ai tessuti sani, molti di sangue e tumori solidi sono ora pensato di essere organizzati gerarchicamente, con un sottoinsieme di cellule tumorali staminali, come quello auto-rinnovarsi dando origine a una progenie più differenziato. La comprensione e il targeting queste cellule staminali tumorali nel cancro al seno, che può possedere una maggiore chemio e radio-resistenza rispetto alla massa tumorale non-staminali, è diventato un importante settore di ricerca. Marcatori compreso CD44, CD24, e l&#39;attività ALDH possono essere valutati utilizzando la fluorescenza delle cellule attivate (FACS) per isolare in modo prospettico le cellule che mostrano una maggiore tumorigenicità quando impiantati in topi immunocompromessi: il saggio mammosphere è diventato anche ampiamente utilizzato per la sua capacità di identificare in modo retrospettivo Sfera d&#39; formando cellule che si sviluppano da cloni di cellule simil-staminali singolo. Qui descriviamo approcci per la coltura appropriato di mammospheres da linee cellulari o campioni elementari di pazienti, la loro passaging, e calcoli per stimare sfera fefficienza orming (SFE). Prima discutiamo considerazioni chiave e le insidie ​​della pianificazione e l&#39;interpretazione degli esperimenti mammosphere appropriata.

Diversi campioni o quelli sottoposti a trattamenti diversi possono variare nel numero di mammospheres&gt; 40 micron che formano dopo normalizzazione per celle iniziali seminate. Calcola mammosphere formando efficienza (MFE) per ogni trattamento cresciuto in triplice copia. Ciò consente esperimenti con diverse densità di semina da confrontare. I dati sono migliori visualizzata su un grafico a barre, idealmente con controlli positivi e negativi, e la visualizzazione della deviazione standard di tutti i pozzetti in triplic...

I test di mammosfera fluttuante possono studiare il sottogruppo di cellule di cancro al seno staminali che sopravvivono in condizioni di sospensione e mostrano una tumorigenesi migliorata quando impiantate nei topi. Questo protocollo fornisce una comoda misura in vitro della capacità di formare sfere, un proxy per la tumorigenesi in vivo, facilitando al contempo l'analisi del panorama trascrizionale associato allo stelo.

Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è stimare la proporzione di cellule con caratteristiche di cellule staminali all'interno di una linea cellulare tumorale o di un campione di tessuto tumorale, e valutarne la capacità di autorinnovamento attraverso passaggi successivi. A tale scopo, una linea cellulare tumorale o un tessuto tumorale viene processato per generare una sospensione monocellulare, che successivamente viene sottoposta a sorting per isolare sottoinsiemi cellulari positivi per CD 44 e negativi per CD 24. Le cellule vengono seminate in piastre a bassa adesività, lasciate crescere per un periodo di tempo appropriato e quindi analizzate al microscopio ottico per la formazione di sfere.L'efficienza di formazione delle sfere è quantificata determinando il numero di sfere formate rispetto al numero di cellule inizialmente seminate. Il processo di generazione di una sospensione monocellulare, di consentire un periodo di crescita e di determinare l'efficienza di formazione delle sfere viene ripetuto attraverso passaggi successivi, fornendo infine una misura della capacità delle cellule di autorinnovarsi nel tempo. Questo metodo fornisce un saggio semplice per identificare le cellule che mostrano proprietà funzionali delle cellule staminali, come l'auto-rinnovamento, nonché una stima quantitativa del numero di cellule staminali provenienti da tumori in vivo.Un principio fondamentale dei saggi di formazione di sfere è che ogni sfera deriva da una singola cellula ed è quindi clonale. Per questi motivi, la densità cellulare è il parametro più importante in questo saggio, poiché ha un impatto critico sulla vitalità. Lavorare in un'area sterile sotto cappa a flusso laminare. Iniziare questa procedura con cellule MCF seven o MDA MB 2 3 1 che sono confluenti al 70-80%.Aspirare il mezzo dal matraccio, lavare le cellule due volte con PBS. Quindi aggiungere tripsina EDTA e incubare da due a sei minuti; dopo il distacco, aggiungere il mezzo per mammosfere contenente il 10% di FBS. Una volta che le cellule si sono staccate, trasferirle in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 200 × g a temperatura ambiente per cinque minuti.Dopo la centrifugazione, versare con cautela il surnatante. Quindi risospendere le cellule in uno a cinque millilitri di mezzo manosfera, aspirando e dispensando 10 volte con una pipetta per rompere il pellet cellulare. Successivamente, filtrare ulteriormente la sospensione cellulare attraverso un filtro a maglia da 40 micron e raccogliere il flusso in uscita nel tubo collegato.Per ottenere una sospensione di singole cellule, pipetto un'aliquote di 20 microlitri delle cellule risospese su un emocitometro e le esamino al microscopio. Se vengono osservati aggregati cellulari come mostrato qui, utilizzare una siringa per passare la sospensione avanti e indietro attraverso un ago da 25 gauge una o due volte. Una volta che le cellule sono state disperse in una sospensione di singole cellule come mostrato qui, procedere all'isolamento di sottoinsiemi cellulari positivi per CD44 e negativi per CD24 mediante separazione cellulare attivata da fluorescenza o separazione cellulare attivata da campo magnetico.Utilizzare una colonna LS per selezionare positivamente le cellule positive per CD44. Poiché le cellule desiderate si attaccano alle pareti della colonna LS, scartare il flusso in eccesso, quindi rimuovere le cellule dalla colonna. Applicare cinque millilitri di tampone ed esercitare pressione con lo stantuffo fornito insieme alla colonna per espellere le cellule desiderate.Successivamente, utilizzare una colonna LD per ulteriormente purificare la popolazione mediante selezione negativa. In questo caso, le cellule positive per CD24 si legano alle colonne LD. Raccogliere il flusso in uscita che contiene le cellule negative per CD24.Successivamente, mediante citometria a flusso, confermare i fenotipi di tutte le cellule isolate. Utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano, calcolare la densità delle cellule vitali dopo aver diluito opportunamente la sospensione cellulare. Seminare ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti con superficie ultralow aderente con 500-4.000 cellule per centimetro quadrato in due millilitri di mezzo completo per mammosfere.Incubare le piastre avendo cura di non disturbarle per cinque-dieci giorni, fino a quando non si osservano sferoidi. Continuare la coltura fino a quando i sferoidi raggiungono un diametro di almeno 40 micron, ma non hanno ancora iniziato a diventare apoptotici. Ottenere tessuto di carcinoma mammario da pazienti sottoposti a intervento chirurgico per l'asportazione di tumori al seno.Conservare il tessuto sul ghiaccio fino a 24 ore in 50 millilitri. Tubi sterili in DMEM contenente 100 unità per millilitro di penicillina e 100 unità per millilitro di streptomicina, operando sotto una cappa sterile per colture cellulari.Trasferire il campione in una piastra per colture cellulari da 100 millimetri contenente un piccolo volume di mezzo, utilizzando forbici sterili, un bisturi e pinzette. Rimuovere il tessuto adiposo. Aggiungere da due a tre millilitri di D-M-E-M-F 12 e, utilizzando un bisturi sterile o una lametta, tritare il campione fino a quando non rimangono pezzi di grandi dimensioni.Reese piega i pezzi di tessuto e 10 millilitri di DMEM preriscaldato contenente enzimi proteolitici e incuba a 37 gradi Celsius in uno shaker rotatorio per uno a tre ore. Quando si separano cellule tumorali vitali di primate utilizzando enzimi digestivi, esiste un compromesso critico tra morte cellulare ed estrazione sufficiente dalla matrice cellulare. Per garantire il successo, è essenziale monitorare regolarmente questa digestione. Ogni mezz'ora, pipettare 20 microlitri di sospensione su un emocitometro e utilizzare un microscopio per valutare il grado di digestione.Una volta completata la digestione, lasciare sedimentare i frammenti per cinque minuti. Quindi trasferire il soprannatante in un tubo conico in polipropilene da 15 millilitri.Centrifugare a 200 ×g per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, eliminare con attenzione il sopranatante e risospendere le cellule in uno a cinque millilitri di mezzo per sferoidi mammari. Quindi preparare e seminare sospensioni cellulari singole come descritto nella sezione precedente.In questo video, se necessario, aspirare e rilasciare le cellule attraverso una siringa da 25 gauge al massimo due volte per disperdere le cellule. Al termine del periodo di coltura, osservare le cellule con un ingrandimento di 40 volte al microscopio equipaggiato con una fotocamera digitale. Acquisire immagini di cinque campi scelti casualmente.Dopo aver acquisito tutte le immagini, utilizzare il software di acquisizione per determinare il numero di microsfera di diametro superiore a 40 micron. Infine, calcolare l'efficienza di formazione delle metasfere dividendo il numero di sfere mammarie in ciascun pozzetto per il numero di cellule seminate in ciascun pozzetto moltiplicato per 100. Raccogliere il mezzo contenente le sfere mammarie da ciascun pozzetto in un tubo da 15 millilitri. Lavare ogni pozzetto con PBS e aggiungerlo al mezzo raccolto.Quindi centrifugare le cellule a 115 ×g per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, scartare il sopranatante. Sospendere il pellet in 500 microlitri di tripsina-EDTA preriscaldata e incubare per due o tre minuti.Dopo l'incubazione, aggiungere 500 microlitri di FBS per neutralizzare la tripsina, quindi centrifugare a 500 × g per cinque minuti. Al termine della centrifugazione, eliminare il sopernatante e risospendere il pellet in 100 microlitri di mezzo per sferoidi mammari; pipettare su e giù per disgregare eventuali sferoidi. Nuovamente, utilizzando un emocitometro, contare le cellule e determinare se si sono disperse in una sospensione monocellulare.Se necessario, passarli attraverso una siringa da 25 gauge fino a due volte per ottenere cellule singole, quindi seminare le cellule in una nuova piastra a sei pozzetti con superficie ultrabassa alla stessa densità utilizzata nella generazione primaria. Dopo cinque-dieci giorni, contare le sferoidi di diametro superiore a 40 micron e calcolare l'efficienza di formazione delle sferoidi come in precedenza. Le atmosfere sono state coltivate a partire da una linea cellulare epiteliale positiva per estrogeni CF7 e da una linea cellulare mesenchimale tripla negativa MDA-MB-231, come descritto in questo video; il conteggio delle mammosfere di diametro superiore a 40 micron fornisce una stima dell'efficienza di formazione delle sferoidi per ciascuna linea cellulare.Si noti che l'aggregazione minima di fusione cellulare osservata qui è stata ottenuta seminando le cellule a bassa densità, pari a 500 cellule per centimetro quadrato per MCF seven e 1000 cellule per centimetro quadrato per MDA 2 3 1. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare e contare le mammosfere derivate da diverse linee cellulari o da campioni tumorali chirurgici. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di seminare le cellule a basse densità per garantire la clonalità e assicurare una elevata proporzione di cellule vitali durante l'estrazione dalle campioni chirurgici.Oltre a questa procedura, dovrebbero essere eseguiti altri metodi, come il trapianto di popolazioni cellulari in topi immunocompromessi, al fine di determinare la genicità tumorale in vivo dei tessuti di interesse.

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HC11 differenziazione lattogenica può essere caratterizzata dalla formazione di strutture a cupola denominata mammospheres. Le strutture possono essere elencati mediante microscopia a contrasto di fase per aiutare a quantificare la differenziazione lattogenica.

Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica

Questo video descrive l'isolamento delle cellule staminali tumorali dalle linee cellulari del cancro al seno. Coltiviamo queste cellule staminali tumorali per generare mammosfere primarie per valutare l'auto-rinnovamento e calcolare l'efficienza di formazione delle sfere, consentendo il confronto tra diverse densità di semina.

Generazione di mammosfere primarie: una tecnica per determinare la potenza cellulare

Time-lapse imaging viene utilizzato per valutare il comportamento di primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da modelli murini geneticamente modificati di rischio di cancro al seno per determinare se ci sono correlazioni tra i parametri specifici di comportamento e distinte lesioni genetiche.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

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Non enzimatica, siero-libero Tissue Culture delle lesioni mammarie pre-invasive per la generazione spontanea di mammospheres

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Quantificazione dell'autorinnovamento nelle colture di Mammosfera Murine

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Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari

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