Utilizzo del saggio soft Agar Colony Formazione per identificare inibitori di tumorigenicità in cellule di carcinoma mammario

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare quantitativamente l'effetto di un trattamento sulla capacità delle cellule di proliferare in matrici semisolide, poiché un aumento di questa capacità è un indicatore della genicità tumorale delle cellule. La genicità tumorale viene misurata mediante il saggio in agar morbido, valutando la capacità delle cellule di formare colonie all'interno di un gel semisolido di AROS. Poiché le cellule non trasformate non sono in grado di moltiplicarsi rapidamente in questo ambiente, il gel semisolido di AROS viene preparato creando innanzitutto uno strato inferiore di AROS allo 0,6%. Successivamente, viene aggiunto uno strato superiore contenente cellule in un gel di AROS allo 0,3%.

In questo saggio, le cellule sperimentali vengono trattate con un inibitore della peptidil, arginina, dase o enzima pad sviluppato dal Dott. Subramanian. Ogni settimana viene aggiunto un ulteriore strato di alimentazione, costituito da un gel di aros allo 0,3% con o senza trattamento. L'ultimo passaggio consiste nel contare il numero di colonie di dimensioni superiori a 70 micrometri per l'analisi.

Infine, la microscopia invertita viene utilizzata per mostrare la differenza nel numero di colonie tra il gruppo di controllo e il gruppo trattato. Salve, mi chiamo Achi Huta. Sono uno studente laureato nel laboratorio del Dott. Scott Kroos presso l'Istituto Baker per la Salute degli Animali.

All'Università di Cornell, il saggio di formazione delle colonie di soft agar può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia del cancro, come la valutazione della tumorigenicità di un'ampia gamma di cellule tumorali in relazione alla loro sensibilità a farmaci, ormoni e molteplici altre condizioni di trattamento. Iniziare questa procedura preparando un agar al 3% in una bottiglia di vetro pulita e asciutta da 100 millilitri. Aggiungere 0,9 grammi di agar bialcolico, seguiti da 30 millilitri di acqua distillata.

Riscaldare la miscela al microonde per 15 secondi e agitare delicatamente. Ripetere questo passaggio fino a quando la polvere di AROS si sarà completamente sciolta. Successivamente, sterilizzare in autoclave la bottiglia contenente la soluzione per 15 minuti.

Lasciare raffreddare la soluzione di agros a temperatura ambiente. Prima di proseguire, preriscaldare diverse pipette da cinque millilitri e da 10 millilitri in un incubatore a 37 gradi Celsius per evitare che l'aros si solidifichi nella pipetta. Quando si manipola parzialmente, allentare il tappo della bottiglia e riscaldare nel microonde la soluzione preconfezionata al 3% di due HYDROXYETHYL aro per 15 secondi.

Quindi agitare delicatamente la soluzione e riscaldare al microonde per altri 15 secondi. Fare attenzione durante l'agitazione della soluzione ARO, poiché la soluzione tende a salire quando esposta all'aria e può fuoriuscire se nel flacone sono presenti residui di gel solido dopo il riscaldamento al microonde. Mantenere il flacone contenente la soluzione ARO in un bagno d'acqua a 45 gradi Celsius per alcuni secondi aggiuntivi durante i passaggi successivi, per evitare che la soluzione agro si solidifichi prematuramente.

Successivamente, trasferire 12 millilitri di mezzo riscaldato utilizzando le pipette preriscaldate in un tubo conico sterile da 50 millilitri. Aggiungere immediatamente tre millilitri della soluzione al 3% di aros e capovolgere delicatamente il tubo conico per mescolare l'aros con il mezzo. Quindi aggiungere delicatamente due millilitri di questa miscela in ciascun pozzetto di una piastra da coltura a sei pozzetti, evitando la formazione di bolle d'aria.

Incubare orizzontalmente la piastra da sei pozzetti su una superficie piana a quattro gradi Celsius per un'ora per permettere al composto di solidificare. Dopo la solidificazione del composto, posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Lo strato inferiore è ora pronto per l'uso.

Un aspetto difficile di questa procedura consiste nell'assicurarsi che tutte le cellule siano distribuite in modo uniforme e che il guscio di agar fuso non si solidifichi prima dell'aggiunta in ogni pozzetto, in modo da garantire che i seltz siano mescolati nel mezzo prima di aggiungere il gel di agar liquido. Inoltre, le pipette vengono preriscaldate in anticipo per evitare che le soluzioni si solidifichino durante la manipolazione. Per preparare lo strato contenente le cellule, trattare innanzitutto con tripsina le cellule MCF 10 DCIS e diluirle a una concentrazione cellulare di 40.000 cellule per millilitro; quindi prelevare otto millilitri di mezzo utilizzando pipette preriscaldate e trasferirli in un tubo conico sterile da 50 millilitri.

Aggiungere immediatamente due millilitri di 3%aros al tubo conico e capovolgere delicatamente per mescolare gli aros con il mezzo. Evitare la formazione di bolle. Successivamente, prelevare due millilitri delle cellule e trattarle con due micromolar di BB cloramina in DMSO o con solo DMSO come controllo dopo il trattamento; mescolare le cellule con lo 0,6%aros in una diluizione uno a uno per ottenere una concentrazione finale di un micromolare di BB cloramina.

Quindi prelevare un millilitro della miscela di cellule aros e aggiungerlo delicatamente sullo strato inferiore della piastra per colture a sei pozzetti. Posizionare la piastra a sei pozzetti in posizione orizzontale su una superficie piana a quattro gradi Celsius per almeno 15 minuti, in modo da permettere allo strato superiore di solidificare. Una volta che la miscela si è solidificata, inserire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per una settimana prima di aggiungere lo strato di alimentazione.

Iniziare la preparazione dello strato di alimentazione riscaldando al microonde la soluzione preconfezionata di aro al 3% due idrossietile, come fatto in precedenza, ed equilibrando la bottiglia di soluzione di agro in un bagno d'acqua a 45 gradi Celsius. Mescolare un millilitro di soluzione di agro al 3% con nove millilitri di mezzo caldo in un tubo conico da 50 millilitri e capovolgere delicatamente per miscelare gli aro con il mezzo. Evitare la formazione di bolle d'aria. Dopo aver trattato la miscela con cloramina BB, aggiungere delicatamente un millilitro della miscela in ciascun pozzetto della piastra per colture a sei pozzetti contenente gli strati inferiore e morbido.

Quindi posizionare orizzontalmente la piastra a sei pozzetti su una superficie piana a quattro gradi Celsius per almeno 15 minuti, in modo da permettere al composto di solidificare. Dopo che lo strato di cellule di supporto si è solidificato, inserire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius. Bader, ripetere questa procedura di alimentazione settimanalmente sovrapponendo un millilitro di soluzione di mezzo con trattamento di agarosio 0,3% sullo strato di supporto esistente per rifornire le cellule con nuovo mezzo fino a quando non si osserva la formazione di colonie.

Dopo due settimane e mezzo di crescita cellulare nell'agarosio morbido, si conta il numero di colonie in ciascun pozzetto. Per facilitare la quantificazione, utilizzare un microscopio ottico, stampare una griglia su una trasparenza e fissare la griglia alla piastra a sei pozzetti per aiutare a individuare la posizione delle cellule durante il conteggio. La dimensione delle colonie viene quantificata in base al diametro di ciascuna colonia e varierà; è pertanto necessario predefinire una dimensione di riferimento delle colonie per determinare quali colonie dovranno essere considerate.

Ad esempio, in questo caso, le dimensioni delle colonie di 70 micrometri o superiori vengono incluse nell'analisi dei dati. Dopo il conteggio, sigillare la piastra di coltura a sei pozzetti con parafilm per evitare che i gel si secchino. Conservare i campioni a quattro gradi Celsius per impedire la formazione di ulteriori colonie e per consentire un successivo conteggio.

I risultati dimostrano che il clorammina BB inibisce significativamente la formazione di colonie derivate da cellule MC 10 DCIS in presenza di un inibitore di adesione. Si è osservata una riduzione sia nella formazione delle colonie sia nella dimensione delle colonie rispetto al controllo con DMSO. La dimensione delle colonie delle cellule MCF 10 DCIS trattate con clorammina BB era prevalentemente compresa tra 20 e 100 micrometri.

Sebbene le dimensioni delle colonie nel controllo DMSO abbiano mostrato un intervallo più ampio, compreso tra 70 e 150 micrometri, dopo due settimane e mezza di crescita, sono state contate e analizzate solo le colonie di dimensioni superiori a 70 micrometri. Nel controllo DMSO era presente una media di circa 3.500 colonie, mentre nel gruppo trattato con cloramina BB ne sono state osservate solo circa 2.000. Dopo due settimane e mezza di coltura in agar morbido, ciò corrisponde a una riduzione del 44% nella formazione media di colonie in presenza di un micromolare di cloramina BB, indicando un'inibizione significativa della tumorigenicità delle cellule tumorali del seno da parte dell'inibitore PAD.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di preriscaldare tutti i reagenti e le attrezzature in anticipo per evitare che le soluzioni si solidifichino durante la manipolazione, e grazie per aver guardato.