Utilizzo del saggio soft Agar Colony Formazione per identificare inibitori di tumorigenicità in cellule di carcinoma mammario

Qui, documentiamo l'uso del saggio di formazione di colonie di agar morbido per testare gli effetti di un inibitore dell'enzima peptidilarginina deiminasi (PADI), BB-Cl-ammidina, sulla tumorigenicità del cancro al seno in vitro.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di determinare quantitativamente l'effetto del trattamento sulla capacità delle cellule di proliferare in matrici semisolide, poiché l'aumento della capacità è un segno distintivo della genialità del tumore cellulare utilizzando il saggio soft agar, la genialità tumorale viene misurata attraverso la capacità di una cellula di formare colonie all'interno di un gel AROS semisolido. Poiché le cellule non trasformate non sono in grado di propagarsi rapidamente in questo ambiente, il gel semi-solido AROS è costruito creando prima uno strato inferiore AROS allo 0,6%. Successivamente, viene aggiunta una cella contenente lo 0,3% di strato di gel AROS sopra lo strato inferiore.

In questo test, le cellule sperimentali sono trattate con un inibitore del peptidil, dell'arginina, della dasi o dell'enzima pad sviluppato dal Dr.Subramanian. Ogni settimana viene aggiunto un ulteriore strato di alimentazione, che è un gel aros allo 0,3% con o senza trattamento. Il passaggio finale consiste nel contare il numero di colonie più grandi di 70 micrometri per l'analisi.

In definitiva, la microscopia invertita viene utilizzata per mostrare la differenza nel numero di colonie tra il gruppo di controllo e il gruppo di trattamento. Ciao, mi chiamo Achi Huta. Sono uno studente laureato nel laboratorio del Dr.Scott Kros presso il Baker Institute for Animal Health.

Alla Cornell University, il saggio di formazione di colonie di tigri molli può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia del cancro, come la valutazione della genicità tumorale di un'ampia gamma di cellule tumorali per quanto riguarda la loro sensibilità a farmaci, ormoni e una moltitudine di altre condizioni di trattamento. Inizia questa procedura preparando il 3% di due idrossietilaros in una bottiglia di vetro da 100 millilitri pulita e asciutta. Aggiungere 0,9 grammi di due aros idrossietilici, seguiti da 30 millilitri di acqua distillata.

Cuocere il composto nel microonde per 15 secondi e agitare delicatamente. Ripeti questo passaggio fino a quando la polvere di AROS non si dissolve completamente. Successivamente, sterilizzare in autoclave la soluzione contenente il flacone per 15 minuti.

Lasciare raffreddare la soluzione agros a temperatura ambiente. Prima di proseguire, utilizzare Preriscaldare diverse pipette da cinque millilitri e 10 millilitri in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per evitare che gli aro si solidifichino nella pipetta. Quando si maneggia parzialmente, allentare il coperchio del flacone e cuocere nel microonde la soluzione preconfezionata di HYDROXYETHYL aro al 3% per 15 secondi.

Quindi agitare delicatamente la soluzione e cuocere nel microonde per altri 15 secondi. Prestare attenzione quando si agita la soluzione ARO perché la soluzione sale quando esposta all'aria e può fuoriuscire se c'è del gel solido residuo nel microonde della bottiglia. Per qualche secondo in più, tenere il flacone contenente la soluzione ARO in un bagno d'acqua a 45 gradi Celsius durante i passaggi successivi per evitare che la soluzione agro si solidifichi prematuramente.

Quindi, trasferire 12 millilitri di terreno riscaldato utilizzando le pipette Prewarm in una provetta conica sterile da 50 millilitri. Aggiungere immediatamente tre millilitri della soluzione al 3% di aros e capovolgere delicatamente il tubo conico per mescolare l'aros con il terreno. Quindi aggiungere delicatamente due millilitri di questa miscela in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a sei pozzetti senza formare bolle d'aria.

Incubare la piastra di coltura a sei pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a quattro gradi Celsius per un'ora per consentire alla miscela di solidificarsi. Dopo che il composto si è solidificato, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Lo strato inferiore è ora pronto per l'uso.

Un aspetto difficile di questa procedura è assicurarsi che tutte le cellule siano distribuite equamente e che il guscio di agra fuso non si solidifichi prima dell'aggiunta a ciascun pozzetto per garantire che i seltz siano mescolati nel terreno prima di aggiungere l'agri gel liquido. Inoltre, i tubi vengono preriscaldati in anticipo per evitare che le soluzioni si solidifichino durante la manipolazione. Per preparare la cellula contenente strato prima di tripsina occhi MCF 10 cellule DCIS e diluirle a una concentrazione cellulare di 40.000 cellule per millilitro, quindi prelevare otto millilitri di terreno utilizzando pipette preriscaldate e trasferirle in una provetta conica sterile da 50 millilitri.

Aggiungere immediatamente due millilitri di aros al 3% al tubo conico e capovolgere delicatamente per mescolare gli aros con il terreno. Evitare la formazione di bolle. Successivamente, prelevare due millilitri di cellule e trattarle con due micromolari di cloramina BB in DMSO o DMSO da solo come controllo dopo il trattamento, mescolare le cellule con lo 0,6% di aros in una diluizione uno a uno per ottenere una concentrazione finale di un micromolare di BB clorammina.

Quindi prelevare un millilitro della miscela di cellule e aggiungerla delicatamente allo strato inferiore della piastra di coltura a sei pozzetti. Posizionare la piastra di coltura a sei pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a quattro gradi Celsius per almeno 15 minuti per consentire allo strato superiore di solidificarsi. Dopo che la miscela si è solidificata, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per una settimana prima di aggiungere lo strato di alimentazione.

Iniziare la preparazione delle galline ovaiole alimentando nel microonde la soluzione preconfezionata di 3% di idrossietilaro come prima ed equilibrando il flacone della soluzione agro in un bagno d'acqua a 45 gradi Celsius, mescolare un millilitro di soluzione agro al 3% con nove millilitri di terreno caldo in un tubo conico da 50 millilitri e capovolgere delicatamente per mescolare l'aros con il terreno. Evitare la formazione di bolle d'aria. Dopo aver trattato la miscela con cloramina BB, aggiungere delicatamente un millilitro di miscela in ciascun pozzetto della piastra di coltura a sei pozzetti contenente gli strati inferiore e morbido.

Quindi posizionare la piastra di coltura a sei pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a quattro gradi Celsius per almeno 15 minuti per consentire alla miscela di solidificarsi. Dopo che lo strato di alimentazione si è solidificato, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Bader, ripetere questa procedura di alimentazione settimanalmente sovrapponendo un millilitro di soluzione di trattamento agros medium allo 0,3% sullo strato di alimentazione esistente per rifornire le cellule con nuovi terreni fino a quando non si osserva la formazione di colonie.

Dopo due settimane e mezzo di crescita cellulare nell'agar morbido, viene contato il numero di colonie in ogni pozzetto. Utilizzando un microscopio ottico per facilitare la quantificazione, stampare una griglia su una trasparenza e fissare la griglia alla piastra a sei pozzetti per individuare la posizione delle cellule durante il conteggio. La dimensione della colonia è quantificata in base al diametro di ciascuna colonia e varierà predefinire una dimensione della colonia di riferimento per determinare quali colonie verranno valutate.

Ad esempio, qui, nell'analisi dei dati sono incluse colonie di dimensioni pari o superiori a 70 micrometri. Dopo il conteggio, sigillare la piastra di coltura a sei pozzetti con paraforma per evitare che i gel si secchino. Conservare i campioni a quattro gradi Celsius per prevenire l'ulteriore formazione di colonie e per il conteggio futuro.

I risultati dimostrano che la cloramina BB inibisce significativamente la formazione di colonie derivate da cellule MC 10 DCIS in presenza di un inibitore della pad. C'è stata una riduzione sia della formazione che delle dimensioni della colonia rispetto al controllo DMSO. La dimensione delle colonie per le cellule DCIS MCF 10 trattate con BB cloramina era prevalentemente compresa tra 20 e 100 micrometri.

Mentre la dimensione delle colonie per il controllo DMSO ha mostrato un intervallo maggiore da 70 a 150 micrometri dopo due settimane e mezzo di crescita, sono state contate e analizzate colonie più grandi di 70 micrometri. C'era una media di circa 3.500 colonie nel controllo DMSO, mentre solo circa 2000 colonie sono state osservate nel gruppo trattato con cloramina BB. Dopo due settimane e mezzo di agricoltura soffice, ciò rappresenta una diminuzione del 44% della formazione media di colonie in presenza di un micromolare BB Chloramine che indica una significativa inibizione tumoralegenica delle cellule del cancro al seno da parte dell'inibitore del pad.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere presente di preriscaldare in anticipo tutti i reagenti e le apparecchiature per evitare che le soluzioni si solidifichino durante la manipolazione, e grazie per l'osservazione.