Name: Utilizzo del saggio soft Agar Colony Formazione per identificare inibitori di tumorigenicità in cellule di carcinoma mammario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Impara il saggio di formazione colonie in soft agar per valutare l'inibizione della tumorigenicità nelle cellule di carcinoma mammario con BB-Cl-amidine. Questo metodo quantifica la proliferazione cellulare in matrici semi-solidi.

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Siamo grati al Dr. Richard Cerione, al Dr. Marc Antonyak, e a Kelly Sullivan, della Cornell University, per averci fornito consigli tecnici, e alla Dr. Gerlinde Van de Walle, della Cornell University, per aver condiviso il loro microscopio invertito Olympus CKX41.

1. Preparazione del 3% 2-idrossietile Agarose <ol><li> In un secco bottiglia di vetro pulito, 100 ml, aggiungere 0,9 g di 2-idrossietile agarosio (Agarose VII) seguiti da 30 ml di acqua distillata. </li><li> Forno a microonde la miscela per 15 secondi e delicatamente agitare. Ripetere questa operazione almeno altre tre volte fino a quando la polvere si dissolve completamente agarosio. </li><li> Autoclave la bottiglia soluzione contenente per 15 min. </li><li> Lasciare che la soluzione di agarosio raffreddare a RT prima di un ulteriore utilizzo. Conservare la soluzione a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparazione dello strato inferiore: 0,6% agarosio gel <ol><li> Pre-warm vari 5 ml e 10 ml pipette a 37 ° C incubatore per impedire l&#39;agarosio solidificazione nella pipetta durante la manipolazione. </li><li> Parzialmente allentare il coperchio della bottiglia e forno a microonde il 3% soluzione di agarosio 2-idrossietile pre-made per 15 sec. Quindi, agitare delicatamente la soluzione e forno a microonde per altri 15 secondi. ATTENZIONE: Fare attenzione quando roteando il agarosoluzione se perché la soluzione si alza quando esposto all&#39;aria e può traboccare. </li><li> Se c&#39;è gel solido residuo nella bottiglia, microonde per pochi secondi. </li><li> Mantenere il flacone contenente la soluzione di agarosio in un bagno d&#39;acqua a 45 ° durante le fasi successive per impedire la soluzione di agarosio solidificazione prematuramente. </li><li> Supporti MCF10DCIS caldo in un bagno di 37 ° C Acque. Nota: MCF10DCIS supporto costituito da DMEM / F12, siero di cavallo 5%, 5% di penicillina streptomicina. </li><li> Trasferimento 3 ml della soluzione di agarosio al 3% usando le pipette preriscaldate in un tubo da 50 ml sterile. </li><li> Immediatamente aggiungere 12 ml di media MCF10DCIS caldi e capovolgere delicatamente il tubo conico per mescolare il agarosio con i media. Cercate di non formare eventuali bolle come essa possa interferire con la colonia conta più tardi. </li><li> Aggiungere delicatamente 2 ml di questa miscela in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 6 senza formare bolle d&#39;aria. </li><li> Incubare il 6 pozzetti cultura horizontally su una superficie piana a 4 ° C per 1 ora per permettere la miscela a solidificare. </li><li> Dopo solidifica miscela, posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 30 min. Lo strato inferiore è ora pronto per l&#39;uso. </li></ol> 3. Preparazione del Layer-cellulare contenente: 0,3% agarosio Gel <ol><li> Cellule Trypsinize MCF10DCIS e diluire ad una concentrazione cellulare di 4 x 10 4 / ml. </li><li> Take 2 ml di agarosio 3% con pipette preriscaldata e trasferire in un tubo da 50 ml sterile. </li><li> Immediatamente aggiungere 8 ml di MCF10DCIS media per il tubo conico e capovolgere delicatamente per miscelare il agarosio con i media. Evitare la formazione di bolle. </li><li> Prendete 2 ml di cellule MCF10DCIS (4 x 10 4 / ml) e trattare con BB-CLA (0 micron (DMSO) o 1 micron). </li><li> In una diluizione 1: 1, mescolare le cellule con l&#39;agarosio 0,6%. </li><li> Prendere 1 ml di miscela di cellule-agarosio e aggiungere delicatamente sullo strato inferiore del 6 pozzetti cultura pin ritardo (2 x 10 4 cellule / ml). </li><li> Posizionare la piastra di coltura da 6 pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a 4 ° C per almeno 15 minuti per consentire lo strato superiore si solidifichi. </li><li> Dopo solidifica miscela, posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° per una settimana prima di aggiungere il livello di alimentazione. </li></ol> 4. Preparazione dello strato Feeder: 0,3% agarosio Gel <ol><li> Forno a microonde il 3% soluzione di agarosio pre-fatto 2-Hydroxyethyl per 15 sec. ruotare delicatamente la soluzione e forno a microonde per altri 15 secondi. </li><li> Equilibrare la bottiglia di soluzione di agarosio in un bagnomaria a 45 ° C. </li><li> Riscaldare i media MCF10DCIS in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Mescolare 1 ml di soluzione di agarosio al 3% con 9 ml di mezzi MCF10DCIS caldo in una provetta da 50 ml e capovolgere delicatamente per miscelare il agarosio con i media. Evitare la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Trattare il composto con BB-CLA (0 micron (DMSO) o 1 micron). </li><li> Aggiungere delicatamente 1 ml di questa miscela (senza perming bolle) in ciascun pozzetto della piastra di coltura a 6 pozzetti contenenti il ​​fondo e morbidi strati. </li><li> Posizionare la piastra di coltura da 6 pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a 4 ° C per almeno 15 minuti per permettere alla miscela di solidificare. </li><li> Dopo che lo strato alimentatore solidifica, posizionare la piastra in un incubatore a 37 °. </li><li> Ripetere questa procedura alimentazione settimanale sovrapponendo 1 ml di soluzione di agarosio / medio / trattamento 0,3% sullo strato alimentatore esistente per ricostituire le cellule con nuovi media fino a quando si osserva la formazione di colonie. Nota: Agar negli strati morbidi e alimentazione è molto morbido e, di conseguenza, i nutrienti aggiunti dallo strato alimentatore prontamente diffondere nello strato di cellule contenenti per raggiungere le cellule. </li></ol> 5. Data Collection <ol><li> Dopo 2,5 settimane di crescita cellulare in soft agar, contare il numero di colonie in ogni pozzetto usando un microscopio ottico. Per facilitare la quantificazione, stampare una griglia su un foglio trasparente e fissare la griglia alla6-pozzetti per aiutare a localizzare dove le cellule sono durante il conteggio. Poiché le dimensioni delle colonie (quantificata dal diametro di ogni colonia) varierà, predefinire una dimensione di riferimento colonia per determinare quale colonie saranno segnati. Per esempio, includere dimensioni colonia di 70 micron o maggiore nell&#39;analisi dei dati. </li><li> Conservare i campioni a 4 ° C per impedire ulteriore formazione di colonie e per future conteggio. Sigillare la piastra di coltura 6 pozzetti con Parafilm per evitare che il gel si secchi. </li></ol>

<ol><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197, 461-463 (1977).</li>
<li>Wang, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signaling+regulating+anchorage-independent+growth+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells.</a> Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).</li>
<li>Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+peptidylarginine+deiminase+enzymes+in+disease+and+female+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction.</a> J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).</li>
<li>Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+peptidylarginine+deiminase+enzymes+and+protein+citrullination+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis.</a> Biochem Res Int. , 895343(2012).</li>
<li>McElwee, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PADI2+as+a+potential+breast+cancer+biomarker+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target.</a> BMC Cancer. 12, 500(2012).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+disrupts+NET+formation+and+protects+against+kidney%2C+skin+and+vascular+disease+in+lupus-prone+MRL%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice.</a> Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).</li>
<li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).</li>
<li>Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+evaluation+of+human+tumor+chemosensitivity+in+the+soft-agar+assay+and+its+clinical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).</li>
<li>Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+tumor+colony+growth+in+soft+agar+by+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Cloning%22%5BJournal%5D)">Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum.</a> Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).</li>
<li>Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+soft+agar+assay+for+identification+of+anticancer+compound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound.</a> J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il tasso di formazione di colonie in agar morbido varia a seconda del tipo di cellula 9. Pertanto, il numero di cellule per cominciare dovrebbe essere ottimizzato e regolato di conseguenza. Un intervallo di partenza consigliato è tra i 5 x 02-01 OTTOBRE x 10 4 cellule per bene con un 6-pozzetti. Inoltre, le dimensioni delle colonie varia a seconda del tasso di crescita di ogni cella. Pertanto, è necessario un predefinito un cut-off per dimensioni delle colonie di annotare colonie individ...

Sia le cellule non trasformate (normali) che quelle trasformate possono facilmente proliferare in una coltura monostrato 2D. Questa forma di crescita cellulare aderente è molto dissimile da quella che avviene in vivo dove, in assenza di stimolazione mitogenica, le cellule spesso non si dividono rapidamente all'interno del loro microambiente. Il saggio di agar morbido, d'altra parte, si distingue dai sistemi di coltura 2D perché quantifica la tumorigenicità misurando la capacità di una cellula di proliferare e formare colonie in sospensione all'interno di un gel di agarosio semisolido1. In questo contesto, le cellule non trasformate non sono in grado di propagarsi rapidamente in assenza di ancoraggio alla matrice extracellulare (ECM) e vanno incontro ad apoptosi, un processo noto come anoikis. Al contrario, le cellule che hanno subito una trasformazione maligna perdono la loro dipendenza dall'ancoraggio a causa dell'attivazione di vie di segnalazione come la fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K)/Akt e Rac/Cdc42/PAK. Pertanto, queste cellule sono in grado di crescere e formare colonie all'interno della matrice di agar morbido semisolida2.
Un uso comune del test di agar morbido è quello di verificare se composti specifici, come gli inibitori PADI, sono in grado di sopprimere la crescita tumorale in vitro. In generale, la conta delle colonie o le dimensioni delle colonie sono letture quantitative del test che possono essere confrontate tra i gruppi di controllo e di trattamento per valutare le differenze nella tumorigenicità cellulare. Pertanto, se si scopre che la formazione di colonie è inversamente correlata all'aumento della concentrazione del farmaco, allora si potrebbe trarre la conclusione che il farmaco è un efficace inibitore della tumorigenicità in vitro. D'altra parte, se il farmaco non influisce sulla formazione di colonie, il farmaco non è al dosaggio appropriato o non è un inibitore tumorigenico efficace. Oltre a utilizzare un test di agar morbido per testare l'effetto antitumorale di un farmaco, questo test può essere utilizzato anche per sondare la relazione tra un gene specifico e la tumorigenesi. Ad esempio, l'effetto della soppressione dell'espressione di PADI2 sulla tumorigenicità può essere affrontato dal trattamento con siRNA PADI2-specifico.
PADI sono enzimi calcio-dipendenti che modificano post-traduzionalmente le proteine convertendo i residui di arginina caricati positivamente in citrullina caricata in modo neutro in un processo noto come citrullinazione o deiminazione3-5. Recentemente abbiamo scoperto che la peptidilarginina deiminasi 2 (PADI2) può funzionare come un nuovo biomarcatore del cancro al seno e che gli inibitori PADI rappresentano terapie candidate per i tumori al seno in stadio iniziale6. Ad esempio, abbiamo precedentemente dimostrato che un inibitore "pan-PADI", la Cl-ammidina, sopprime la proliferazione delle cellule del cancro al seno utilizzando monostrati 2D e che l'inibitore sopprime la crescita degli sferoidi tumorali 3D6. In questo rapporto, ampliamo questi studi e sottolineiamo l'utilità del test soft agar, testando l'efficacia di un nuovo inibitore PADI, BB-CLA, nel sopprimere la crescita di MCF10DCIS colonie di cancro al seno7. Notiamo che abbiamo utilizzato cellule MCF10DCIS per questo esperimento perché sono derivati oncogeni di cellule umane MCF10A non trasformate e perché contengono alti livelli di proteinaPADI2 8 allo stato stazionario. Ipotizziamo che l'attività enzimatica di PADI2 svolga un ruolo chiave nella tumorigenicità di questa linea cellulare e che l'inibizione dell'attività di PADI2 mediata da BB-CLA sopprima la progressione del cancro.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Axiopot</td><td>Carl Zeiss Microscopia</td><td>1021859251</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Invertito</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Donor Siero equino</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2-idrossietilagarosio: Tipo VII, bassa temperatura di gelificazione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346-81-1</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzo del saggio soft agar colony formazione per identificare inibitori di tumorigenicità in cellule di carcinoma mammario

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Date le difficoltà intrinseche nello studio dei meccanismi di progressione tumorale in vivo, i saggi basati su cellule come il saggio di formazione di colonie di agar soft (d'ora in poi chiamato saggio di agar morbido), che misura la capacità delle cellule di proliferare in matrici semisolide, rimangono un segno distintivo della ricerca sul cancro. Un vantaggio chiave di questa tecnica rispetto ai tradizionali saggi di coltura cellulare 2D monostrato o 3D di sferoidi è la stretta imitazione dell'ambiente cellulare 3D con quello osservato in vivo. È importante sottolineare che il saggio di soft agar fornisce anche uno strumento ideale per testare rigorosamente gli effetti di nuovi composti o condizioni di trattamento sulla proliferazione e la migrazione cellulare. Inoltre, questo test consente la valutazione quantitativa del potenziale di trasformazione cellulare nel contesto delle perturbazioni genetiche. Recentemente abbiamo identificato la peptidilarginina deiminasi 2 (PADI2) come potenziale biomarcatore del cancro al seno e bersaglio terapeutico. Qui evidenziamo l'utilità del test soft agar per gli studi preclinici antitumorali testando gli effetti dell'inibitore PADI, BB-Cl-amidina (BB-CLA), sulla tumorigenicità delle cellule di carcinoma duttale umano in situ (MCF10DCIS).

L&#39;agar morbido dosaggio formazione di colonie può essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni documentano la tumorigenicità delle cellule tumorali. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che la matrice semisolida favorisce selettivamente la crescita di cellule che possono proliferare in modo ancoraggio-indipendente. Questa caratteristica è esposto principalmente dalle cellule tumorali, ma non dalle cellule normali. Usiamo soprattutto questa tecnica per testare l&#39;efficacia di inibizione della c...

Qui, documentiamo l'uso del saggio di formazione di colonie di agar morbido per testare gli effetti di un inibitore dell'enzima peptidilarginina deiminasi (PADI), BB-Cl-ammidina, sulla tumorigenicità del cancro al seno in vitro.

Utilizzo del saggio soft Agar Colony Formazione per identificare inibitori di tumorigenicità in cellule di carcinoma mammario

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare quantitativamente l'effetto di un trattamento sulla capacità delle cellule di proliferare in matrici semisolide, poiché un aumento di questa capacità è un indicatore della genicità tumorale delle cellule. La genicità tumorale viene misurata mediante il saggio in agar morbido, valutando la capacità delle cellule di formare colonie all'interno di un gel semisolido di AROS. Poiché le cellule non trasformate non sono in grado di moltiplicarsi rapidamente in questo ambiente, il gel semisolido di AROS viene preparato creando innanzitutto uno strato inferiore di AROS allo 0,6%. Successivamente, viene aggiunto uno strato superiore contenente cellule in un gel di AROS allo 0,3%.In questo saggio, le cellule sperimentali vengono trattate con un inibitore della peptidil, arginina, dase o enzima pad sviluppato dal Dott. Subramanian. Ogni settimana viene aggiunto un ulteriore strato di alimentazione, costituito da un gel di aros allo 0,3% con o senza trattamento. L'ultimo passaggio consiste nel contare il numero di colonie di dimensioni superiori a 70 micrometri per l'analisi.Infine, la microscopia invertita viene utilizzata per mostrare la differenza nel numero di colonie tra il gruppo di controllo e il gruppo trattato. Salve, mi chiamo Achi Huta. Sono uno studente laureato nel laboratorio del Dott. Scott Kroos presso l'Istituto Baker per la Salute degli Animali.All'Università di Cornell, il saggio di formazione delle colonie di soft agar può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia del cancro, come la valutazione della tumorigenicità di un'ampia gamma di cellule tumorali in relazione alla loro sensibilità a farmaci, ormoni e molteplici altre condizioni di trattamento. Iniziare questa procedura preparando un agar al 3% in una bottiglia di vetro pulita e asciutta da 100 millilitri. Aggiungere 0,9 grammi di agar bialcolico, seguiti da 30 millilitri di acqua distillata.Riscaldare la miscela al microonde per 15 secondi e agitare delicatamente. Ripetere questo passaggio fino a quando la polvere di AROS si sarà completamente sciolta. Successivamente, sterilizzare in autoclave la bottiglia contenente la soluzione per 15 minuti.Lasciare raffreddare la soluzione di agros a temperatura ambiente. Prima di proseguire, preriscaldare diverse pipette da cinque millilitri e da 10 millilitri in un incubatore a 37 gradi Celsius per evitare che l'aros si solidifichi nella pipetta. Quando si manipola parzialmente, allentare il tappo della bottiglia e riscaldare nel microonde la soluzione preconfezionata al 3% di due HYDROXYETHYL aro per 15 secondi.Quindi agitare delicatamente la soluzione e riscaldare al microonde per altri 15 secondi. Fare attenzione durante l'agitazione della soluzione ARO, poiché la soluzione tende a salire quando esposta all'aria e può fuoriuscire se nel flacone sono presenti residui di gel solido dopo il riscaldamento al microonde. Mantenere il flacone contenente la soluzione ARO in un bagno d'acqua a 45 gradi Celsius per alcuni secondi aggiuntivi durante i passaggi successivi, per evitare che la soluzione agro si solidifichi prematuramente.Successivamente, trasferire 12 millilitri di mezzo riscaldato utilizzando le pipette preriscaldate in un tubo conico sterile da 50 millilitri. Aggiungere immediatamente tre millilitri della soluzione al 3% di aros e capovolgere delicatamente il tubo conico per mescolare l'aros con il mezzo. Quindi aggiungere delicatamente due millilitri di questa miscela in ciascun pozzetto di una piastra da coltura a sei pozzetti, evitando la formazione di bolle d'aria.Incubare orizzontalmente la piastra da sei pozzetti su una superficie piana a quattro gradi Celsius per un'ora per permettere al composto di solidificare. Dopo la solidificazione del composto, posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Lo strato inferiore è ora pronto per l'uso.Un aspetto difficile di questa procedura consiste nell'assicurarsi che tutte le cellule siano distribuite in modo uniforme e che il guscio di agar fuso non si solidifichi prima dell'aggiunta in ogni pozzetto, in modo da garantire che i seltz siano mescolati nel mezzo prima di aggiungere il gel di agar liquido. Inoltre, le pipette vengono preriscaldate in anticipo per evitare che le soluzioni si solidifichino durante la manipolazione. Per preparare lo strato contenente le cellule, trattare innanzitutto con tripsina le cellule MCF 10 DCIS e diluirle a una concentrazione cellulare di 40.000 cellule per millilitro; quindi prelevare otto millilitri di mezzo utilizzando pipette preriscaldate e trasferirli in un tubo conico sterile da 50 millilitri.Aggiungere immediatamente due millilitri di 3%aros al tubo conico e capovolgere delicatamente per mescolare gli aros con il mezzo. Evitare la formazione di bolle. Successivamente, prelevare due millilitri delle cellule e trattarle con due micromolar di BB cloramina in DMSO o con solo DMSO come controllo dopo il trattamento; mescolare le cellule con lo 0,6%aros in una diluizione uno a uno per ottenere una concentrazione finale di un micromolare di BB cloramina.Quindi prelevare un millilitro della miscela di cellule aros e aggiungerlo delicatamente sullo strato inferiore della piastra per colture a sei pozzetti. Posizionare la piastra a sei pozzetti in posizione orizzontale su una superficie piana a quattro gradi Celsius per almeno 15 minuti, in modo da permettere allo strato superiore di solidificare. Una volta che la miscela si è solidificata, inserire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per una settimana prima di aggiungere lo strato di alimentazione.Iniziare la preparazione dello strato di alimentazione riscaldando al microonde la soluzione preconfezionata di aro al 3% due idrossietile, come fatto in precedenza, ed equilibrando la bottiglia di soluzione di agro in un bagno d'acqua a 45 gradi Celsius. Mescolare un millilitro di soluzione di agro al 3% con nove millilitri di mezzo caldo in un tubo conico da 50 millilitri e capovolgere delicatamente per miscelare gli aro con il mezzo. Evitare la formazione di bolle d'aria. Dopo aver trattato la miscela con cloramina BB, aggiungere delicatamente un millilitro della miscela in ciascun pozzetto della piastra per colture a sei pozzetti contenente gli strati inferiore e morbido.Quindi posizionare orizzontalmente la piastra a sei pozzetti su una superficie piana a quattro gradi Celsius per almeno 15 minuti, in modo da permettere al composto di solidificare. Dopo che lo strato di cellule di supporto si è solidificato, inserire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius. Bader, ripetere questa procedura di alimentazione settimanalmente sovrapponendo un millilitro di soluzione di mezzo con trattamento di agarosio 0,3% sullo strato di supporto esistente per rifornire le cellule con nuovo mezzo fino a quando non si osserva la formazione di colonie.Dopo due settimane e mezzo di crescita cellulare nell'agarosio morbido, si conta il numero di colonie in ciascun pozzetto. Per facilitare la quantificazione, utilizzare un microscopio ottico, stampare una griglia su una trasparenza e fissare la griglia alla piastra a sei pozzetti per aiutare a individuare la posizione delle cellule durante il conteggio. La dimensione delle colonie viene quantificata in base al diametro di ciascuna colonia e varier&agrave;; &egrave; pertanto necessario predefinire una dimensione di riferimento delle colonie per determinare quali colonie dovranno essere considerate.Ad esempio, in questo caso, le dimensioni delle colonie di 70 micrometri o superiori vengono incluse nell'analisi dei dati. Dopo il conteggio, sigillare la piastra di coltura a sei pozzetti con parafilm per evitare che i gel si secchino. Conservare i campioni a quattro gradi Celsius per impedire la formazione di ulteriori colonie e per consentire un successivo conteggio.I risultati dimostrano che il clorammina BB inibisce significativamente la formazione di colonie derivate da cellule MC 10 DCIS in presenza di un inibitore di adesione. Si è osservata una riduzione sia nella formazione delle colonie sia nella dimensione delle colonie rispetto al controllo con DMSO. La dimensione delle colonie delle cellule MCF 10 DCIS trattate con clorammina BB era prevalentemente compresa tra 20 e 100 micrometri.Sebbene le dimensioni delle colonie nel controllo DMSO abbiano mostrato un intervallo più ampio, compreso tra 70 e 150 micrometri, dopo due settimane e mezza di crescita, sono state contate e analizzate solo le colonie di dimensioni superiori a 70 micrometri. Nel controllo DMSO era presente una media di circa 3.500 colonie, mentre nel gruppo trattato con cloramina BB ne sono state osservate solo circa 2.000. Dopo due settimane e mezza di coltura in agar morbido, ciò corrisponde a una riduzione del 44% nella formazione media di colonie in presenza di un micromolare di cloramina BB, indicando un'inibizione significativa della tumorigenicità delle cellule tumorali del seno da parte dell'inibitore PAD.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di preriscaldare tutti i reagenti e le attrezzature in anticipo per evitare che le soluzioni si solidifichino durante la manipolazione, e grazie per aver guardato.

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Un test per misurare quantitativamente fattore di crescita trasformante (TGF)-β-indotta invasione in 3-dimensionale gel collagene è descritto. Questo saggio si avvale della MCF10A serie di linee cellulari, che rappresentano diversi stadi di sviluppo del cancro al seno. Questo metodo può essere adottato per essere utilizzato con altre linee cellulari e può essere utilizzato per indagare altri potenziali attivatori o inibitori di invasione.

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

Questo video descrive un test di formazione di colonie di agar morbido per testare gli effetti di un inibitore dell'enzima PADI e della BB-Cl-ammidina sulla tumorigenicità del cancro al seno in vitro. Questo test consente anche la valutazione quantitativa del potenziale di trasformazione cellulare nel contesto delle perturbazioni genetiche.

Saggio di formazione di colonie di agar morbido: un metodo per testare gli effetti di nuovi composti sulla proliferazione delle cellule tumorali

Questo video descrive il test di formazione delle colonie, che aiuta a determinare la capacità delle cellule tumorali del polmone di proliferare indefinitamente e formare colonie individuali. Possiamo analizzare l'effetto di un agente antitumorale sulle cellule formanti colonie analizzando i cambiamenti nel numero e/o nelle dimensioni delle colonie risultanti.

Saggio di formazione di colonie: valutazione dell'efficacia degli agenti antitumorali sulle cellule tumorali del polmone formanti colonie

Questo video descrive il protocollo per l'unità di formazione di colonie a base di metilcellulosa o saggio UFC, che aiuta a identificare e contare il numero di colonie formate da cellule leucemiche in risposta al trattamento con composti antitumorali.

Saggio CFU a base di metilcellulosa: un metodo per determinare l'effetto dei composti antitumorali sulla formazione di colonie nelle cellule leucemiche

Il saggio di formazione di colonie di agar morbido è un metodo utilizzato per confermare la crescita in vitro indipendente dall'ancoraggio cellulare. L'obiettivo di questo protocollo è quello di illustrare un metodo rigoroso per la rilevazione del potenziale tumorigenico delle cellule trasformate e degli effetti soppressivi tumorali delle proteine sulle cellule trasformate.

Il saggio Formazione morbida Agar Colony

Questa procedura dimostrerà come abbiamo sintetizzato e caratterizzato l'attività delle cellule staminali anti-NFκB e anti-cancro di un profarmaco aspirina-fumarato.

Sintesi e caratterizzazione di un profarmaco Aspirina-fumarato che inibisce NFκB attività e della mammella cellule tumorali staminali

Spesso è necessario valutare la potenziale citotossicità di un insieme di composti sulle cellule coltivate. Qui, descriviamo una strategia per lo screening affidabile dei composti tossici in un formato di 96 pozze.

Una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare e la sopravvivenza nelle cellule di mammaliana coltivate a bassa-moderato throughput

Il saggio di invasione delle cellule in vitro viene utilizzato per misurare il potenziale della metastasi del cancro quantificando il potenziale cellulare per l'invasione e la migrazione utilizzando inserti di coltura cellulare contenenti matrice proteica. Si sfida nommossa alle cellule di migrare attraverso la matrice proteica e una membrana porosa, verso un chemioattraente, e poi quantificate mediante microscopia leggera.

L'uso di cellule tumorali mammarie del topo in un saggio di invasione in vitro come misura del comportamento cellulare oncogeno

Questo protocollo fornisce strumenti sperimentali in vitro per valutare la trasformazione delle cellule mammarie umane. Vengono descritti i passaggi dettagliati per seguire il tasso di proliferazione cellulare, la capacità di crescita indipendente dall'ancoraggio e la distribuzione di lignaggi cellulari in colture 3D con matrice di membrana basale.

Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane

Il presente protocollo descrive la generazione di modelli di coltura tumorale 3D da cellule tumorali primarie e la valutazione della loro sensibilità ai farmaci utilizzando saggi di vitalità cellulare ed esami microscopici.

Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Questo protocollo sperimentale fornisce un metodo stabile, economico ed efficiente che combina il knockdown dell'inncRNA con saggi formatori di colonie per quantificare l'effetto dell'inncRNA sulla proliferazione cellulare dell'osteosarcoma.

Test di formazione di colonie che rileva la capacità proliferativa delle cellule osteosarcoma knockdown di RNA LncRNA

Impara il saggio di formazione colonie in soft agar per valutare l'inibizione della tumorigenicità nelle cellule di carcinoma mammario con BB-Cl-amidine. Questo metodo quantifica la proliferazione cellulare in matrici semi-solidi.

Utilizzo del saggio soft Agar Colony Formazione per identificare inibitori di tumorigenicità in cellule di carcinoma mammario

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