Name: Analisi quantitativa dei difetti arrampicata in un modello Drosophila di malattie neurodegenerative (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Scopri l'analisi quantitativa dei difetti di arrampicata in Drosophila melanogaster per studiare malattie neurodegenerative. Questo metodo ottimizzato rileva difetti locomotori lievi e supporta la ricerca di target farmacologici.

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Questo lavoro è supportato da una sovvenzione del team del Canadian Health Research Institute (CIHR) al Dr. Bolduc (co-PI) e al Dr. Guy Rouleau (PI). Vorremmo ringraziare la dottoressa Oksana Suchowersky, la dottoressa Kathryn Todd, i membri del club di mosca dell'Università di Alberta e il dottor Clayton Dickson per l'aiuto nello sviluppo del metodo e dell'analisi statistica.

La ricerca sulle Drosophila melanogaster era conforme con l&#39;Università di linee di ricerca di Alberta. 1. Fly Collection <ol><li> Raccogliere 20 mosche con CO 2 (g), anestesia e posto in una fiala di raccolta 25 millimetri x 95 millimetri contenente cibo. </li><li> Fiale magazzini contenenti mosche orizzontalmente per evitare di intrappolare le mosche in liquidi che possono accumularsi sul fondo della fiala. </li><li> Incubare mosche per almeno 21 ore a 22 ° C a 45% di umidità in un incubatore per circa per 15 h. Impostare l&#39;incubatore con una luce 12 ore: ciclo scuro. </li></ol> 2. Arrampicata Assay <ol><li> La mattina seguente, il trasferimento di 20 mosche da una singola fiala in un bicchiere da 250 ml cilindro graduato. Segnare la posizione del cilindro per mantenere costante quotidiana. Utilizzare un cilindro di vetro per il genotipo per evitare la contaminazione incrociata tra i genotipi. Lavarsi alla fine di ogni esperimento e roli tate tra genotipi. <ol><li> Condurre gli esperimenti in luce ambiente (o la luce rossa se esiste un potenziale difetto visivo) rispettivamente a temperatura e umidità di 22 ° C e 40%. Per evitare di confondere circadiano ritmo, sempre esperimenti alla stessa ora del giorno. </li></ol></li><li> Chiudere la parte superiore del cilindro con un film barriera (strato di cera) per evitare fuoriuscite di linea (Figura 2). </li><li> Impostare la videocamera su un treppiede. Fotocamera Focus sulla linea di 190 ml dei 250 ml cilindro graduato (17.5 cm). </li><li> Contare il numero di mosche morte sul fondo del cilindro e nelle fiale alimentari. Registrare questo numero come la mortalità. </li><li> Molto battere leggermente il cilindro contro un tappetino in gomma a cellule chiuse ripetutamente con forza sufficiente a spostare le mosche per la superficie inferiore interna. Toccare 5-10 volte, mentre con l&#39;altra mano per premere registrare sulla fotocamera. </li><li> Premere il pulsante &quot;Record&quot; sulla fotocamera. </li><li> Avviare il video registrazione della videocamera e toccare il cilindro sei volte in un modello non ritmico distinti. </li><li> Condurre ogni prova per 2 minuti dal momento in cui le mosche sono ultimo sfruttato e registrare il numero di mosche che attraversano l&#39;altezza di 17,5 cm (190 ml) per ogni punto temporale prescelto (quantificare ogni 10 sec). Nota: La marcatura sul cilindro ml varierà da un cilindro modello all&#39;altro a seconda del diametro. Per evitare errori, misurare l&#39;altezza di ogni cilindro utilizzato. </li><li> Una volta che il processo è terminato, disporre di mosche in etanolo al 95%. </li><li> Ripetere i passaggi 2,1-2,9 fino a quando tutte le repliche sono stati testati con mosche freschi ogni volta. Nota: Anche se 5 repliche possono essere sufficiente con una mutazione che ha un forte effetto sulla locomozione, 10 replicati biologici di 20 mosche (200 mosche) si consiglia di rilevare le differenze più piccole. </li><li> Al termine dell&#39;esperimento, lavare i cilindri in lavastoviglie laboratorio e O secco / N per essere riutilizzato. </li></ol> 3. Analisi <ol><li> Analyvideo ze di ogni volano prova. Ogni 10 secondi, registrare il numero totale di mosche che passano la linea di tiro. <ol><li> Se una mosca si arrampica indietro o scende, record che volano come -1 e contare il prossimo volo per attraversare la linea di destinazione come lo stesso numero del volo che è risalito verso il basso o è caduto. Ad esempio, se il 15 fly scende al di sotto della linea di tiro, il prossimo volo per attraversare la linea (16 th volano) è considerato il 15 ° volo e non 16 °. </li></ol></li><li> Sottrarre mortalità dal numero totale di linea (20) per ottenere il numero di mosche che rimangono nel processo. Ad ogni punto di tempo, ottenere la frazione di mosche sopra la linea di destinazione. </li><li> Tracciare ogni percentuale in ogni momento (vedi figura 3). </li><li> Analizzare le prestazioni al punto dati 120 secondi ed eseguire studente t-test quando sono presenti 2 gruppi o ANOVA e post-test per confronti multipli (con modifica Bonferroni per pianificati e non pianificati Tukey per comparisons). Il Kolmogorov-Smirnov test 17 ​​viene eseguita per l&#39;accertamento normalità e varianza uguale ma anche per confrontare le distribuzioni del gruppo mutante al controllo. </li><li> Per presentare i dati su invecchiamento, tracciare la percentuale di mosche arrampicata a 120 secondi con le mosche di età diverse (2 giorni, 1 settimana, 2 settimane) per vedere se c&#39;è un deficit progressivo (Figura 4). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Drosophila ha già dimostrato di essere un ottimo modello di malattia 14 e altre malattie neurodegenerative 1,2 di Parkinson. Oltre agli strumenti genetici disponibili in Drosophila, suo genoma è altamente conservata per geni coinvolti nei disordini neurologici 19. L&#39;avvento di ampi metodi di screening genetico genoma (compresi sequenziamento dell&#39;intero esoma) è probabile che continuerà a fornire una più grande lista di geni candidati associati con disturbi del ...

Malattie neurodegenerative devastanti come il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica, e paraplegia spastica ereditaria sono sempre più riconosciuti. Sfortunatamente, la maggior parte di questi disturbi neurodegenerativi sono ancora senza trattamenti. L&#39;uso clinico diffuso di test genetici, imparziali genoma come il sequenziamento dell&#39;esoma ha portato ad un numero sempre maggiore di geni di essere coinvolto in disturbi locomotiva umani. Nonostante questi progressi, la progressione patologica dalla mattina presto alla fase avanzata, rimane inafferrabile in questi disturbi. Drosophila fornisce uno con gli strumenti genetici per lo studio requisito gene in modo spaziale e temporale controllato. Inoltre, Drosophila è dimostrato utile nello screening farmaci per malattie neurologiche come il Parkinson 1, il morbo di Alzheimer 2, ritardo mentale ed epilessia 3,4 5,6 tra gli altri. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un costo effettivoe il dosaggio affidabile che permetta di alta analisi rendimento che sarebbe ancora abbastanza sensibile per rilevare piccole variazioni nelle prestazioni del motore. Ci sono diversi test utilizzati per quantificare gli effetti di mutazione genetica e / o le condizioni ambientali sul comportamento arrampicata Drosophila. La maggior parte dei saggi capitalizzare la naturale tendenza di mosche da scalare, noti come geotassi negativi, o il saggio arrampicata. Benzer 7 suggerito nel 1967 che l&#39;apparato controcorrente utilizzato per lo studio di fototassi potrebbe anche essere usato per studiare gravitaxis. Da allora, Ganetsky 8 e molti altri 9 -12 hanno costruito sul dosaggio iniziale. Il principio è quello di mettere un numero noto di mosche in una fiala e toccare la fiala fortemente contro una superficie dura, causando linea a cadere sul fondo della fiala. Dato che è un comportamento innato, linea tenteranno di salire fino alla cima del flaconcino, al contrario di gravità. Questo test è quantitativa e measures quanti mosche sono saliti oltre un marcatore sul flacone nel corso di un periodo di tempo assegnato. Misurazione della velocità invece del numero totale di mosche arrampicata è diventata un parametro affidabile e mostrato difetti nei casi in cui il numero dei criteri mosche non era significativo 13. Il dosaggio arrampicata è dimostrata utile nello studio di molte malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson 14. Tuttavia, abbiamo notato che i difetti locomotiva non deve essere rilevabile al momento in cui la neurodegenerazione è già visto in studi patologici 14. Pertanto, l&#39;uso del test tradizionale può limitare la capacità di studiare le prime fasi della patogenesi della malattia. La comparsa di difetti locomotiva durante le fasi successive di patologia può riflettere una malattia la cui progressione è troppo avanzato per la completa salvataggio. Ciò solleva un potenziale problema con la sensibilità del tradizionale test arrampicata. Il potenziale incapacità del tradizionale arrampicata test di rilevare difetti locomotiva lievi può essere attribuito alla quota alla quale linea devono salire. Le tradizionali misure assay 15,16 il numero di mosche a salire con successo su un&#39;altezza di 2 a 5 cm di 10 a 20 sec.

<table><tbody><tr>Scorte <td></td><td></td> di <td>Drosophila</td><td>Le scorte vengono selezionate in base agli esperimenti. La temperatura e l'umidità nella stanza e nell'incubatrice devono essere controllate e costanti per evitare che le mosche siano troppo statiche o troppo bagnate.</td></tr><tr><td>Videocamera</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi videocamera digitale andrà bene. Assicurati che possano mettere a fuoco l'oggetto vicino.</td></tr><tr><td>Cilindro graduato</td><td>Kimble</td><td>20028W</td><td>Diversi modelli di cilindro graduato possono avere diametri diversi. È quindi importante misurare l'altezza.</td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi modello andrà bene. Abbiamo usato il computer per monitorare l'arrampicata delle mosche e registrare il numero di mosche in ogni momento.</td></tr></tbody></table>

analisi quantitativa dei difetti arrampicata in un modello drosophila di malattie neurodegenerative

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Difetti Locomotive derivanti da malattie neurodegenerative possono essere un sintomo di esordio tardivo della malattia, dopo anni di degenerazione subclinica, e quindi attuali strategie di trattamento terapeutico non sono curativi. Attraverso l&#39;uso di sequenziamento exome, un numero crescente di geni sono stati identificati per giocare un ruolo nella locomozione umana. Nonostante l&#39;identificazione di questi geni, non è noto come questi geni sono essenziali al funzionamento normale locomotiva. Pertanto, un test affidabile, che utilizza organismi modello per chiarire il ruolo di questi geni per identificare nuovi bersagli di interesse terapeutico, è necessaria più che mai. Abbiamo progettato una versione sensibilizzata del test geotassi negativi che consente il rilevamento di difetti lievi anteriore e ha la capacità di valutare questi difetti nel tempo. Il saggio viene eseguito in un cilindro graduato in vetro, che è sigillato con un film barriera di cera. Aumentando la distanza limite ad essere scalata a 17,5 cm ed aumentando la durata dell&#39;esperimento per 2 min abbiamo osservato una maggiore sensibilità nella rilevazione disfunzioni mobilità lievi. Il test è conveniente e non richiede una formazione completa per ottenere risultati altamente riproducibili. Questo lo rende una tecnica eccellente per lo screening candidati farmaci in mutanti di Drosophila con difetti di locomozione.

L&#39;arrampicata è un comportamento forte e riproducibile. Infatti, un giorno di vita in linea wild-type di raggiungere le prestazioni arrampicata distanza del bersaglio in rapido (25 - 30 sec). Mosche mutanti presentano una serie di prestazioni da lieve (o ritardato) per completare l&#39;incapacità di salire al bersaglio. Illustriamo questo qui con due diversi alleli mutanti. Il primo è una grave allele del gene spastin causata da una delezione completa del gene spastin (terme 5,75) 18. In questa linea (ter...

Presentiamo un test di geotassi negativa ottimizzato, economico e affidabile in Drosophila melanogaster come modello per i disturbi neurodegenerativi. Essendo più sensibile ai difetti locomotori lievi, questo test aiuterà a individuare potenziali interazioni genetiche e bersagli farmacologici.

Analisi quantitativa dei difetti arrampicata in un modello Drosophila di malattie neurodegenerative

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare l'abilità di arrampicata di moscerini di tipo selvatico e di moscerini mutanti per i geni coinvolti nella locomozione. Questo viene ottenuto trasferendo innanzitutto i moscerini in un cilindro graduato di vetro. Il secondo passaggio consiste nel far scendere i moscerini in fondo al cilindro, dandogli dei leggeri colpetti su un materassino di gomma piuma.Successivamente, le mosche che attraversano la linea bersaglio vengono registrate mediante una videocamera per una durata di due minuti. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare i video e tracciare il numero di mosche al di sopra della linea bersaglio ogni 10 secondi. In definitiva, il test di arrampicata viene utilizzato per identificare difetti nella capacità di arrampicata di linee mutanti di moscerini della frutta.Il principale vantaggio di questa tecnica, o delle tecniche esistenti, come il metodo wild, è la capacità di rilevare lievi differenze nell'abilità di arrampicata. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei disturbi neurodegenerativi, ad esempio al ruolo di geni specifici nella paraplegia spastica ereditaria riguardo al deterioramento progressivo della deambulazione. L'implicazione di questa tecnica tende verso lo sviluppo di terapie.IP per i disturbi neurologici perché fornisce un semplice test quantitativo per valutare la risposta ai farmaci e i mutanti di geni candidati per le malattie neurodegenerative. Iniziare anestetizzando 20 moscerini con anidride carbonica e posizionare tutti i moscerini in un vial di raccolta da 25 millimetri per 95 millimetri contenente cibo. Successivamente, conservare il vial contenente i moscerini in posizione orizzontale su un vassoio di cartone per evitare che rimangano intrappolati in qualsiasi liquido possa accumularsi sul fondo del vial. Collocare i moscerini in un incubatore per almeno 21 ore in un ciclo luce/buio di 12 ore. La mattina seguente, impostare il test di arrampicata trasferendo i moscerini dal vial in un cilindro graduato di vetro da 250 millilitri e sigillare l'apertura superiore con pellicola di cera per impedire la fuoriuscita dei moscerini.Eseguire l'esperimento alla luce ambiente a 22 gradi Celsius e 40% di umidità. Eseguire sempre gli esperimenti allo stesso orario della giornata per evitare interferenze con i cicli del sonno. Inoltre, segnare la posizione del cilindro sul piano del banco per mantenerla costante ogni giorno.Contare il numero di moscerini morti sul fondo del cilindro e nei vial di alimento, e registrare questo valore come mortalità. Successivamente, posizionare la videocamera su un treppiede. Mettere a fuoco la videocamera sulla linea da 190 millilitri del cilindro graduato da 250 millilitri con molta delicatezza.Battere il cilindro da cinque a dieci volte contro un tampone di schiuma a celle chiuse con una forza sufficiente a spostare i moscerini sulla superficie interna inferiore. Quindi, utilizzare l’altra mano per premere il tasto di registrazione sulla videocamera. Successivamente, battere il cilindro sei volte secondo un modello non ritmico ben definito mentre la videocamera sta registrando.Eseguire ogni prova per due minuti a partire dal momento in cui i moscerini vengono battuti per l'ultima volta. Infine, smaltire i moscerini in etanolo al 95%. Al termine della prova, ripetere questo saggio di arrampicata 10 volte utilizzando ogni volta 20 moscerini freschi, al fine di rilevare piccole differenze nella locomozione tra i gruppi.Lavare i cilindri in una lavastoviglie e farli asciugare per tutta la notte per poterli riutilizzare una volta completato l'esperimento. Per analizzare il rendimento delle mosche, iniziare osservando i video di ciascun registro di prova delle mosche. Registrare il numero totale di mosche che superano la linea bersaglio ogni 10 secondi. Se una mosca torna indietro o cade, segnarla come meno uno e conteggiare la successiva mosca che attraversa la linea bersaglio con lo stesso numero della mosca che è tornata indietro o è caduta.Ad esempio, se la 15ª mosca cade al di sotto della linea bersaglio, la mosca successiva che attraversa la linea viene considerata la 15ª mosca e non la 16ª. Successivamente sottrarre la mortalità dal numero totale di mosche per ottenere il numero di mosche rimaste nell'area sottoposta al test. La percentuale di mosche al di sopra della linea bersaglio in ciascun punto temporale, quando si lavora con mutazioni gravi, può evidenziare diversi gradi di difetto di arrampicata utilizzando diversi saggi di arrampicata.Qui, è stato registrato il numero di moscerini di otto giorni che hanno raggiunto la sommità di una provetta vuota dopo 18 secondi, mostrando alcuna differenza significativa nel comportamento di arrampicata tra i due gruppi. D'altra parte, utilizzando il test di arrampicata di questo protocollo, le mosche mutanti Bastin 17 dash seven su TM three mostrano un deficit prestazionale rispetto ai controlli. Poiché molte alterazioni della locomozione sono progressive, è importante osservare l'evoluzione delle mosche nel tempo.A due giorni di vita, si osserva una differenza significativa nel numero di moscerini che riescono a salire al di sopra della linea bersaglio, rispetto ai controlli. Questa capacità di arrampicata continua a diminuire con l'invecchiamento delle mosche mutanti da due a giorni.Una volta padroneggiato, questo esperimento e l'analisi possono essere completati in tre ore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come quantificare i difetti locomotori nei modelli mutanti dola per i disturbi neurologici.

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Questo video descrive un metodo semplice per quantificare la locomozione delle mosche e mostra il saggio di arrampicata eseguito. Il test di arrampicata sulle mosche è un test generale della funzione motoria che si basa su una risposta negativa della geotassi.

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Questo protocollo dettagliato analizza il comportamento di geotassi negativa di Drosophila utilizzando un sistema automatico di multi-cilindro che ospita centinaia di mosche e sincronizza la loro azione da un motore elettrico. Al momento della sincronizzazione, volare geotassi negativo comportamento viene analizzato, registrata digitalmente ed analizzati utilizzando il software di RflyDetection auto-progettato.

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L'obiettivo di questa procedura è quello di sezionare il tessuto del muscolo longitudinale dorsale (DLM) per valutare l'integrità strutturale delle giunzioni neuromuscolari DLM (NMJ) nei modelli di malattia neurodegenerativa utilizzando Drosophila melanogaster.

Visualizzazione della degenerazione sinaptica nella Drosophila adulta in associazione con la neurodegenerazione

Il presente protocollo valuta l'attività locomotoria di Drosophila tracciando e analizzando il movimento delle mosche in un'arena fatta a mano utilizzando il software open source Fiji, compatibile con plugin per segmentare i pixel di ogni fotogramma in base alla registrazione video ad alta definizione per calcolare i parametri di velocità, distanza, ecc.

Una semplice tecnica per analizzare l'attività locomotoria nella Drosophila

Questo protocollo presenta un test per la modellazione della stitichezza in un modello di Drosophila basato sull'alfa-sinucleina del morbo di Parkinson.

Misurazione della stitichezza in un modello di Drosophila del morbo di Parkinson

Il protocollo presenta un metodo ad alto rendimento ed economico per valutare la neurotossicità nel moscerino della frutta attraverso la quantificazione della disfunzione locomotoria come alternativa ai modelli tradizionali di mammifero. Mira a valutare gli effetti neurotossici di composti farmaceutici, agenti ambientali o modificazioni genetiche utilizzando un modello sensibile, riproducibile ed eticamente favorevole.

Analisi comportamentale della disfunzione locomotoria in Drosophila melanogaster come lettura della neurotossicità

Scopri l'analisi quantitativa dei difetti di arrampicata in Drosophila melanogaster per studiare malattie neurodegenerative. Questo metodo ottimizzato rileva difetti locomotori lievi e supporta la ricerca di target farmacologici.

Analisi quantitativa dei difetti arrampicata in un modello Drosophila di malattie neurodegenerative

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