Analisi quantitativa dei difetti arrampicata in un modello Drosophila di malattie neurodegenerative
June 13th, 2015
Presentiamo un test di geotassi negativa ottimizzato, economico e affidabile in Drosophila melanogaster come modello per i disturbi neurodegenerativi. Essendo più sensibile ai difetti locomotori lievi, questo test aiuterà a individuare potenziali interazioni genetiche e bersagli farmacologici.
L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la capacità di arrampicata delle mosche di tipo selvatico e delle mosche mutanti per i geni coinvolti nella locomozione. Ciò si ottiene trasferendo prima le mosche in un cilindro graduato di vetro. Il secondo passo consiste nello spostare le mosche sul fondo del cilindro picchiettando leggermente il cilindro sull'imbottitura in schiuma.
Le mosche successive che attraversano la linea di destinazione vengono registrate utilizzando una videocamera per una durata di due minuti. Il passaggio finale consiste nell'analizzare i video e tracciare il numero di mosche al di sopra della linea di destinazione ogni 10 secondi. In definitiva, il saggio rampicante viene utilizzato per identificare i difetti nella capacità di arrampicata delle linee mutanti di moscerini della frutta.
Il vantaggio principale di questa tecnica, o di tecniche esistenti, come il metodo wild, è che ha la capacità di rilevare piccole differenze nella capacità di arrampicata. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie neurodegenerative, come il ruolo di geni specifici sulla paraplegia spastica ereditaria sulla compromissione progressiva dell'andatura. L'implicazione di questa tecnica tende allo sviluppo della terapia.
IP per disturbi neurologici perché fornisce un semplice test quantitativo per testare la risposta ai farmaci e i mutanti per i geni neurodegenerativi candidati Iniziare anestetizzando 20 mosche usando l'anidride carbonica e posizionare tutte le mosche in una fiala di raccolta di 25 millimetri per 95 millimetri che contiene cibo. Conservare quindi il flaconcino contenente le mosche orizzontalmente in un vassoio di cartone per evitare di intrappolarle in eventuali liquidi che potrebbero accumularsi sul fondo del flaconcino. Porre le mosche in un'incubatrice per almeno 21 ore sotto un ciclo di luce-buio di 12 ore la mattina seguente, impostare il saggio rampicante trasferendo le mosche dalla fiala in un cilindro graduato di vetro da 250 millilitri e sigillare la parte superiore con pellicola di cera per evitare la fuoriuscita di eventuali mosche.
Condurre l'esperimento in condizioni di luce ambientale a 22 gradi Celsius e 40% di umidità. Esegui sempre esperimenti alla stessa ora del giorno per evitare confusione con i cicli del sonno. Inoltre, segna la posizione del cilindro sul piano di lavoro per mantenerlo costante ogni giorno.
Conta il numero di mosche morte sul fondo del cilindro e nelle fiale di cibo, registra questo numero come mortalità. Quindi, posiziona la videocamera su un treppiede. Mettere a fuoco la fotocamera sulla linea da 190 millilitri del cilindro graduato da 250 millilitri molto leggermente.
Picchiettare il cilindro da cinque a 10 volte contro un cuscinetto di schiuma a cellule chiuse con una forza sufficiente a spostare le mosche sulla superficie inferiore interna. Quindi utilizzare l'altra mano per premere il pulsante di registrazione sulla fotocamera. Quindi tocca il cilindro sei volte in uno schema distinto e non ritmico mentre la telecamera sta registrando.
Condurre ogni prova per due minuti dall'ultimo momento in cui le mosche sono state toccate. Infine, smaltire le mosche in etanolo al 95%. Una volta completata la prova, ripetere questo test rampicante 10 volte utilizzando 20 mosche fresche ogni volta per rilevare piccole differenze di locomozione tra i gruppi.
Lavare i cilindri in lavastoviglie e asciugarli durante la notte per riutilizzarli una volta completato l'esperimento per analizzare le prestazioni della mosca, iniziare guardando i video di ogni record di prova di mosca. Il numero totale di mosche che passano la linea di destinazione ogni 10 secondi. Se una mosca scende o cade, registra quella mosca come meno uno e conta la mosca successiva che attraversa la linea del bersaglio come lo stesso numero della mosca che è scesa o è caduta.
Ad esempio, se la 15a mosca scende al di sotto della linea di destinazione, la mosca successiva che attraversa la linea è considerata la 15a mosca e non la 16a. Quindi sottrarre la mortalità dal numero totale di mosche per ottenere il numero di mosche che rimangono nella trama di prova. La percentuale di mosche al di sopra della linea di destinazione in ogni momento in cui si lavora con mutazioni gravi, diversi gradi di difetto rampicante possono essere visti utilizzando diversi saggi di arrampicata.
Qui, è stato registrato il numero di mosche di otto giorni che sono salite in cima a una fiala di cibo vuota dopo 18 secondi, non mostrando alcuna differenza significativa nel comportamento di arrampicata tra i due gruppi. D'altra parte, utilizzando il saggio rampicante di questo protocollo, le mosche mutanti Bastin 17 scattano sette su tre mosche mutanti TM mostrano un deficit di prestazioni rispetto ai controlli. Poiché molti disturbi locomotori sono progressivi, è importante osservare l'evoluzione delle mosche nel tempo.
A due giorni di vita, c'è una differenza significativa nel numero di mosche che superano la linea del bersaglio. Rispetto ai controlli. Queste prestazioni di arrampicata continuano a diminuire man mano che i moscerini mutanti invecchiano da due a giorni.
Una volta padroneggiato, questo esperimento e l'analisi possono essere completati in tre ore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare i difetti locomotori nei modelli mutanti dola per disturbi neurologici.
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Panoramica
Questo articolo presenta un saggio di geotassi negativa ottimizzato, economico e affidabile in Drosophila melanogaster, che serve come modello per i disturbi neurodegenerativi. Il saggio è progettato per essere più sensibile ai lievi difetti locomotori, aiutando nello screening di potenziali interazioni genetiche e bersagli farmacologici.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Saggi comportamentali
- Genetica
Sfondo
- Drosophila melanogaster è un organismo modello ampiamente utilizzato in neurobiologia.
- I saggi di geotassi negativa misurano la capacità di arrampicarsi delle mosche.
- L'identificazione di difetti locomotori può fornire informazioni sui disturbi neurodegenerativi.
- Le mutazioni genetiche possono influenzare la locomozione, rendendo questo saggio prezioso per la ricerca.
Scopo dello studio
- Quantificare la capacità di arrampicarsi delle Drosophila di tipo selvatico e mutanti.
- Identificare difetti nella capacità di arrampicarsi associati a specifiche mutazioni genetiche.
- Screening di potenziali interazioni genetiche e bersagli farmacologici relativi alla locomozione.
Metodi utilizzati
- Trasferire le mosche in un cilindro graduato di vetro.
- Spostare le mosche verso il fondo battendo il cilindro.
- Registrare le mosche che attraversano una linea target utilizzando una videocamera per due minuti.
- Analizzare i video per tracciare il numero di mosche sopra la linea target ogni 10 secondi.
Risultati principali
- Il saggio quantifica con successo la capacità di arrampicarsi sia nelle mosche di tipo selvatico che in quelle mutanti.
- Dimostra sensibilità ai lievi difetti locomotori.
- I risultati possono fornire informazioni su potenziali interazioni genetiche e bersagli farmacologici.
- Il metodo è affidabile ed economico per scopi di screening.
Conclusioni
- Il saggio di geotassi negativa è uno strumento prezioso per studiare la locomozione in Drosophila.
- Può aiutare a identificare fattori genetici che influenzano i disturbi neurodegenerativi.
- Questo metodo migliora la capacità di screening per bersagli terapeutici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This assay provides a sensitive, cost-effective method for detecting early locomotor defects in Drosophila models of neurodegenerative disorders, enabling earlier identification of genetic modifiers and therapeutic candidates. By quantifying climbing performance over time, it supports mechanistic de-risking of target hypotheses in discovery pipelines. The method’s reproducibility and scalability make it suitable for screening campaigns aimed at validating disease-relevant mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in locomotion pathways relevant to neurodegenerative disease models.
- Operational Value: Provides quantitative, time-resolved phenotypic readouts for assessing mutant or drug-treated fly performance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Detects mild climbing defects that may be missed in standard assays, increasing sensitivity for early-stage screening.
- Operational Value: Uses inexpensive, reusable glass cylinders and minimal training, supporting high-throughput compatibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks age-dependent decline in climbing ability, modeling progressive locomotor dysfunction seen in human neurodegeneration.
- Operational Value: Generates longitudinal data to evaluate therapeutic intervention effects over time in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery workflows, supporting target validation and lead identification by linking genetic perturbations to quantifiable behavioral phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring locomotor output as a functional readout of neuronal integrity.
- Screening: Enables reproducible quantification of fly climbing to assess compound or genetic modifier effects.
- Analytics: Generates time-series data on fly position, allowing calculation of climbing velocity and endurance metrics.
- Translational Research: Models progressive decline in motor function, aligning with preclinical evaluation of disease-modifying candidates.
- Enterprise Reuse: Standardized protocol allows reuse across multiple mutant lines and screening campaigns with minimal revalidation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking genotype to quantifiable locomotor phenotype.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized tapping, video capture, and blind analysis protocols.
- Strategic Value: Reduces false negatives in early screening by detecting subtle defects, improving hit-to-lead efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic severity and progression.
Implementation Considerations
- Requires basic fly handling and anesthesia skills using CO2.
- Needs a 250 mL glass graduated cylinder, wax film seal, foam pad, tripod, and video recording device.
- Demands consistent environmental conditions (22°C, 40% humidity, same time of day) to minimize variability.
- Requires training in video analysis to score fly crossings and handle falls or reversals correctly.
- Limited to measuring negative geotaxis; does not assess other motor behaviors like flight or gait coordination.
