Analisi quantitativa dei difetti arrampicata in un modello Drosophila di malattie neurodegenerative

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la capacità di arrampicata delle mosche di tipo selvatico e delle mosche mutanti per i geni coinvolti nella locomozione. Ciò si ottiene trasferendo prima le mosche in un cilindro graduato di vetro. Il secondo passo consiste nello spostare le mosche sul fondo del cilindro picchiettando leggermente il cilindro sull'imbottitura in schiuma.

Le mosche successive che attraversano la linea di destinazione vengono registrate utilizzando una videocamera per una durata di due minuti. Il passaggio finale consiste nell'analizzare i video e tracciare il numero di mosche al di sopra della linea di destinazione ogni 10 secondi. In definitiva, il saggio rampicante viene utilizzato per identificare i difetti nella capacità di arrampicata delle linee mutanti di moscerini della frutta.

Il vantaggio principale di questa tecnica, o di tecniche esistenti, come il metodo wild, è che ha la capacità di rilevare piccole differenze nella capacità di arrampicata. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie neurodegenerative, come il ruolo di geni specifici sulla paraplegia spastica ereditaria sulla compromissione progressiva dell'andatura. L'implicazione di questa tecnica tende allo sviluppo della terapia.

IP per disturbi neurologici perché fornisce un semplice test quantitativo per testare la risposta ai farmaci e i mutanti per i geni neurodegenerativi candidati Iniziare anestetizzando 20 mosche usando l'anidride carbonica e posizionare tutte le mosche in una fiala di raccolta di 25 millimetri per 95 millimetri che contiene cibo. Conservare quindi il flaconcino contenente le mosche orizzontalmente in un vassoio di cartone per evitare di intrappolarle in eventuali liquidi che potrebbero accumularsi sul fondo del flaconcino. Porre le mosche in un'incubatrice per almeno 21 ore sotto un ciclo di luce-buio di 12 ore la mattina seguente, impostare il saggio rampicante trasferendo le mosche dalla fiala in un cilindro graduato di vetro da 250 millilitri e sigillare la parte superiore con pellicola di cera per evitare la fuoriuscita di eventuali mosche.

Condurre l'esperimento in condizioni di luce ambientale a 22 gradi Celsius e 40% di umidità. Esegui sempre esperimenti alla stessa ora del giorno per evitare confusione con i cicli del sonno. Inoltre, segna la posizione del cilindro sul piano di lavoro per mantenerlo costante ogni giorno.

Conta il numero di mosche morte sul fondo del cilindro e nelle fiale di cibo, registra questo numero come mortalità. Quindi, posiziona la videocamera su un treppiede. Mettere a fuoco la fotocamera sulla linea da 190 millilitri del cilindro graduato da 250 millilitri molto leggermente.

Picchiettare il cilindro da cinque a 10 volte contro un cuscinetto di schiuma a cellule chiuse con una forza sufficiente a spostare le mosche sulla superficie inferiore interna. Quindi utilizzare l'altra mano per premere il pulsante di registrazione sulla fotocamera. Quindi tocca il cilindro sei volte in uno schema distinto e non ritmico mentre la telecamera sta registrando.

Condurre ogni prova per due minuti dall'ultimo momento in cui le mosche sono state toccate. Infine, smaltire le mosche in etanolo al 95%. Una volta completata la prova, ripetere questo test rampicante 10 volte utilizzando 20 mosche fresche ogni volta per rilevare piccole differenze di locomozione tra i gruppi.

Lavare i cilindri in lavastoviglie e asciugarli durante la notte per riutilizzarli una volta completato l'esperimento per analizzare le prestazioni della mosca, iniziare guardando i video di ogni record di prova di mosca. Il numero totale di mosche che passano la linea di destinazione ogni 10 secondi. Se una mosca scende o cade, registra quella mosca come meno uno e conta la mosca successiva che attraversa la linea del bersaglio come lo stesso numero della mosca che è scesa o è caduta.

Ad esempio, se la 15a mosca scende al di sotto della linea di destinazione, la mosca successiva che attraversa la linea è considerata la 15a mosca e non la 16a. Quindi sottrarre la mortalità dal numero totale di mosche per ottenere il numero di mosche che rimangono nella trama di prova. La percentuale di mosche al di sopra della linea di destinazione in ogni momento in cui si lavora con mutazioni gravi, diversi gradi di difetto rampicante possono essere visti utilizzando diversi saggi di arrampicata.

Qui, è stato registrato il numero di mosche di otto giorni che sono salite in cima a una fiala di cibo vuota dopo 18 secondi, non mostrando alcuna differenza significativa nel comportamento di arrampicata tra i due gruppi. D'altra parte, utilizzando il saggio rampicante di questo protocollo, le mosche mutanti Bastin 17 scattano sette su tre mosche mutanti TM mostrano un deficit di prestazioni rispetto ai controlli. Poiché molti disturbi locomotori sono progressivi, è importante osservare l'evoluzione delle mosche nel tempo.

A due giorni di vita, c'è una differenza significativa nel numero di mosche che superano la linea del bersaglio. Rispetto ai controlli. Queste prestazioni di arrampicata continuano a diminuire man mano che i moscerini mutanti invecchiano da due a giorni.

Una volta padroneggiato, questo esperimento e l'analisi possono essere completati in tre ore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare i difetti locomotori nei modelli mutanti dola per disturbi neurologici.