Name: Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Impara a isolare macrofagi peritoneali murini per analisi dell'espressione genica dopo stimolazione dei recettori Toll-like. Questo metodo ottimizza la resa cellulare e supporta studi immunologici avanzati.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC, concedere senza 298515-2011). AL è il destinatario di un dottorato di ricerca borsa di studio le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC), e MS è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del Canadian Institutes of Health Research (CIHR, concessione n. MOP123246).

Tutte le procedure sono state eseguite in accordo con il Consiglio canadese sugli orientamenti per la cura degli animali, dopo l&#39;approvazione da parte del Comitato istituzionale cura degli animali del Centro de recherche du Centre Hospitalier de l&#39;Université de Montréal (CRCHUM). 1. Isolamento, identificazione, e Cultura Murine Peritoneale macrofagi <ol><li> Preparare medio tioglicollato 3,8% di birra. Per fare ciò, sospendere 38 g di tioglicollato medie 1.000 ml di acqua distillata. Portare la soluzione ad ebollizione per sciogliere completamente il mezzo. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 min. Memorizza fino a 3 mesi al buio, a temperatura ambiente 18. NOTA: Eliminare se si sviluppa torbidità che indica una contaminazione batterica. La soluzione può essere conservato fino ad un anno al buio se mantenuto sterile. </li><li> Uso 1 ml siringhe allegate a 23 aghi G, iniettare 1 ml di 3,8% Brewer tioglicolato medio nella cavità peritoneale di ogni mouse e attendere per 3 giorni. Utilizzare nuova siringa e l&#39;ago per ogni mouse. </li><li> Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (100 mg / kg) e eutanasia topi mediante dislocazione cervicale. Verificare il corretto anestesia controllando la frequenza respiratoria. Di solito respirazione rapida indicano che il mouse non è profondamente anestetizzato. </li><li> Lavare l&#39;addome di ciascun topo con il 70% di etanolo. Usando una forbice, effettuare un&#39;incisione laterale lungo la linea mediana inferiore del peritoneo. </li><li> Usando una pinza, tirare indietro la pelle addominale per esporre la pelle peritoneale trasparente. Utilizzando 5 ml siringhe attaccate a 20 aghi G, iniettare 5 ml di DPBS freddi nella cavità peritoneale di ciascun topo. </li><li> Eseguire un leggero massaggio sulla cavità peritoneale e quindi aspirare accuratamente il liquido, senza pungere qualsiasi organo. Rimuovere l&#39;ago e dispensare il liquido peritoneale in 50 ml provette da centrifuga coniche. </li><li> Centrifugare per 10 min a 400 xg in una centrifuga refrigerata.Le cellule devono restare freddo durante l&#39;intera procedura. Gettare il surnatante e pellet cellulare risospendere in mezzo RPMI 1640. </li><li> Utilizzando un emocitometro, contare le cellule e regolare a densità cellulare di 1 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Caratterizzare il fenotipo di cellule isolate mediante citometria di flusso con 1 x 10 6 cellule per mouse e antibodie contro F4 / 80 (un antigene di superficie espresso sui macrofagi). </li></ol> 2. trattamenti con le cellule <ol><li> Direttamente, dopo l&#39;isolamento, aggiungere 1 x 10 6 cellule in ciascun pozzetto. Lasciare i macrofagi peritoneali murini aderire nelle piastre da 6 pozzetti da loro coltura per 1 a 2 ore a 37 ° C. Rimuovere le cellule non aderenti lavando delicatamente per 3 volte con caldo PBS. </li><li> Successivamente, cellule di coltura in 900 microlitri DMEM privo di siero per 24 ore in presenza dei seguenti ligandi TLR: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 mg / ml); poli (I: C) -TLR3 (10 mg / ml) ; LPS-TLR4 (100 ng / ml), flagellina-TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 mg / ml); ODN1826-TLR9 (1 micron). NOTA: Preparare per ogni legante una soluzione 10x. Aggiungere 100 ml di quest&#39;ultima in ogni pozzetto, eseguendo così una diluizione di 10 volte. </li></ol> 3. RNA Isolation <ol><li> Rimuovere tutte le cellule medie e Lisare direttamente nelle piastre a sei pozzetti aggiungendo 1 ml TRIzol a ciascun pozzetto e passando il lisato cellulare più volte attraverso una pipetta. Incubare i campioni omogeneizzati per 5 a 10 min a temperatura ambiente, per consentire la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici. </li><li> Trasferire il lisato in 1,5 ml RNasi e microprovette senza DNasi. Aggiungere 0,2 ml di cloroformio per 1 ml TRIzol. Agitare tubi vigorosamente a mano per 15 secondi e incubare a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Centrifugare a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. Osservare la miscela separa in una fase rossa (fenolo-cloroformio) inferiore, un interfase e una fase acquosa superiore incolore. RNA rimane esclusivamente nella fase acquosa. </li><li> TranSFER accuratamente la fase acquosa superiore in una nuova provetta senza disturbare l&#39;interfase. Precipitare il RNA da esso mescolando con 0,5 ml di alcool isopropilico. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min e centrifugare a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C. L&#39;RNA precipitati formare una pallina bianca sul lato e fondo del tubo. </li><li> Rimuovere il surnatante. Lavare il RNA pellet una volta con 1 ml di etanolo al 75%. Miscelare i campioni di vortex e centrifugare a 7.500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Brevemente asciugare l&#39;RNA (aria secca per 10 min). Sciogliere RNA in 0.1 ml di DEPC (RNAse acqua gratuita) e incubare per 10 minuti a 55 ° C. </li><li> Quantificare RNA utilizzando uno spettrofotometro. Per fare ciò, diluire i campioni di 100 volte in acqua DEPC e leggere a lunghezze d&#39;onda di 260 nm. La concentrazione di RNA sarà quindi: OD 260 x 40 ng / ul x fattore di diluizione. </li><li> Equalizza concentrazioni di RNA e sintetizzare cDNA secondo le istruzioni del fabbricante, con RT-PCR per First-Strand cDNA Synthesis Kit. Comele istruzioni del produttore, misurare i livelli di gene mRNA di real-time PCR (45 cicli) in un sistema di rilevazione del DNA in tempo reale. Normalizzare i livelli di espressione genica con due gene housekeeping ad esempio β-actina e GAPDH. NOTA: Normalizzare concentrazione di RNA a 500 mg / ml e 0,5 mg utilizzare per la sintesi del DNA. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

I macrofagi sono cruciali per la sopravvivenza e fornire un bersaglio allettante per manipolare l&#39;host per obiettivi immunologici. La scoperta di TLR e di altre molecole di riconoscimento hanno condotto i macrofagi al centro del dibattito immunologica. Macrofagi rispondono ad una varietà di stimoli, compresi citochine, molecole danni associati molecolari modello (smorza) 20 e molecole associate a gruppi di patogeni (PAMP) 21. Queste diverse risposte stimoli rappresentano corso dell&#39;attivazi...

Il sistema reticoloendoteliale fagocitica è composto di cellule in vari tessuti ed organi come il midollo osseo, sangue, fegato e milza. I macrofagi sono ampiamente distribuiti in tutto il corpo, dove in particolare partecipano innata e risposte immunitarie per il controllo e le infezioni chiare. Oltre al loro ruolo nella difesa dell&#39;ospite, macrofagi giocano un ruolo importante nella guarigione delle ferite e nel mantenimento dell&#39;omeostasi tissutale 1,2. Inoltre, i macrofagi non sono importanti solo per la funzione immunitaria, ma anche partecipare attivamente nell&#39;omeostasi del ferro 3. Nel corpo, circa il 80% di ferro è presente in emoglobina entro eritrociti, che quando sono senescente fagocitato dai macrofagi 4. Ogni giorno, i macrofagi riciclare 25 mg di ferro eritrociti di derivazione e di fornire il suo trasporto nel plasma 5. Inoltre, durante l&#39;infezione e l&#39;infiammazione, macrofagi pro-infiammatori sequestrano sideremia per ridurre DISPONIBIL ferroty agli agenti patogeni, sia a livello sistemico e locale 6-8. Inoltre, studi hanno dimostrato che i macrofagi e soprattutto epatociti producono un peptide antimicrobico denominato hepcidin che è considerato il principale regolatore del metabolismo del ferro 9, 10. Hepcidin è aumentato principalmente da stimoli infiammatori ed è parzialmente responsabile per il sequestro di ferro in macrofagi su infiammazione cronica 11-13. Come espressione di epcidina in macrofagi non è molto ben compreso, abbiamo studiato il possibile ruolo dei recettori Toll-like (TLR) nel presente regolamento. I TLR si trovano principalmente sui macrofagi e svolgono un ruolo centrale nella loro attivazione. Inoltre, LPS espressione hepcidin indotta nel fegato è dipendente TLR4 13. Pertanto, per eseguire il nostro studio, abbiamo usato un metodo basato sull&#39;isolamento dei macrofagi peritoneali murini. Linee di cellule macrofagi sono ampiamente utilizzati in stallone macrofagiies; tuttavia la cultura estesa può provocare la perdita di geni e diminuzione delle funzioni immunitarie in queste linee cellulari. Pertanto, l&#39;isolamento dei macrofagi dalla cavità peritoneale è cruciale. La cavità peritoneale del mouse presenta un luogo ideale per raccogliere i macrofagi 13-15. Isolati macrofagi peritoneali murini sono convenienti per diversi studi riguardanti la loro funzione immunologica. Tuttavia, il numero di macrofagi nel peritoneo è insufficiente per studi approfonditi ed è stimata intorno a 1 x 10 6 macrofagi per topo. Pertanto, per aumentare la produzione di macrofagi, un agente suscitando sterile come tioglicolato stato iniettato nella cavità peritoneale precedente il raccolto cella. Dopo l&#39;iniezione tioglicolato, la resa dei macrofagi per mouse è stato aumentato di 10 volte. Nonostante l&#39;aumento dei macrofagi rendimento, Thioglycollate atti medio di birra come irritante che induce una risposta infiammatoria, con conseguente reclutamento di macrofagi, che may ma non necessario influenzano l&#39;espressione genica. Quindi, un gruppo di controllo costituito da macrofagi non trattata deve essere incluso in ogni esperimento. Nelle nostre mani, espressione di epcidina che è altamente stimolata da infiammazione non è stato rilevato in Thioglycollate non trattato suscitato macrofagi peritoneali. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che il tioglicollato di birra recluta numerosi macrofagi, ma non attiva le 16. D&#39;altra parte, tioglicolato di Brewer suscitato macrofagi hanno mostrato un aumento enzima lisosomiale ma una diminuzione uccidendo i microrganismi ingeriti 17. Tuttavia, la capacità dei fagociti non è stata influenzata se confrontato con i macrofagi non suscitato 16. Una volta coltivate in piatti, i macrofagi peritoneali diventano aderenti, consentendo quindi la loro separazione da altri tipi di cellule isolate dalla cavità peritoneale. Successivamente, i macrofagi isolati si sono sfidati con diversi agonisti TLR.Infine, mRNA è stato estratto dalle cellule in coltura e l&#39;espressione genica è stato analizzato utilizzando reazione inversa quantitativa a catena transcriptasi-polimerasi (qRT-PCR).

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 topi</td><td>Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA)</td><td>475</td><td></td></tr><tr><td>Tioglicolato</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td><td>19032-500G</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% pentobarbital di sodio (utilizzato per l'anestesia dei topi (80 mg/kg, i.p.))</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS), posta su ghiaccio e servirà per raccogliere i macrofagi</td><td>WISENT INC Canada (QC)</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 (Integratore con penicillina, streptomicina, L-glutammina e siero fetale di vitello al 10</td>%).<td>WISENT INC Canada (QC)</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe da 1 e 5 ml</td><td>BD USA (NJ)</td><td></td><td></td></tr>309659 <tr><td>piastre a 6 pozzetti</td><td>Corning Incorporated (NY, USA)</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Lipoproteina batterica Pam3CSK4 (0,5 mg/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, USA)</td><td>TLRL-pm25</td><td></td></tr><tr><td>Poliionosina... acido policitidilico (Poly(I:C)) (10 mg/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, USA)</td><td>TLRL-PIC</td><td></td></tr><tr><td>LPS da Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, USA)</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Flagellina purificata da Salmonella typhimurium (100 ng/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, USA)</td><td>TLR-FLIC-10</td><td></td></tr><tr><td>Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, USA)</td><td>TLR-FSL</td><td></td></tr><tr><td>ssRNA derivato dalla lunga ripetizione terminale dell'HIV-1 ssRNA40 (1 &mu; g/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, USA)</td><td>TLR-LRNA-40</td><td></td></tr><tr><td>Tipo B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 &mu; M)</td><td>InvivoGen (San Diego, USA)</td><td>11B16-MM</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen, (Burlington, ON, Canada)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Aghi da 20 G e 23 G</td><td>BD USA (NJ)</td><td></td><td></td></tr>305175 <tr><td>Forbice Pinza</td><td></td><td></td><td></td></tr> Tubi <tr><td>conici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>da 50 ml posizionati su ghiaccio</td><td>Sarstedt (Newton, MA, USA)</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per lisi dei globuli rossi</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td><td>R7757-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>per centrifuga</td><td></td><td></td><td></td>refrigerata</tr><tr><td>Anticorpo F4/80</td><td>BIO-RAD (CA, USA)</td><td></td><td></td></tr>MCA497APC <tr><td>Anticorpi CD16/CD32</td><td>Pharmingen, {Mississauga, ON, CA)</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Citometro</td> <td>a flussoCoulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette Eppendorf da 1,5 ml</td><td>Axygen Scietific (CA,USA)</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher Scientific (ON, Canada)</td><td>UN1888</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>JT Baker (PA, USA)</td><td>70566</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo al 75% (in acqua trattata con DEPC)</td><td>Commercial Alchohols (QC, Canada)</td><td>17394</td><td></td></tr><tr><td>Acqua trattata con pirocarbonato di dietil (DEPC) allo 0,01% (lasciare riposare durante la notte e in autoclave)</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td><td>216.542.8</td><td></td></tr><tr><td>Sistema RT-PCR Omniscript</td><td>Qiagen, (Mississauga, ON, Canada)</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>Rotor Gene 3000</td><td>Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit PCR QuantiTect SYBR Green I</td><td>Qiagen, (Mississauga, ON, Canada)</td><td>204141</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica al toll-like recettori stimolazione

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Durante l&#39;infezione e l&#39;infiammazione, monociti circolanti lasciano il flusso sanguigno e migrare nei tessuti, dove si differenziano in macrofagi. I macrofagi esprimono i recettori di superficie Toll-like (TLR), che riconoscono pattern molecolari conservate attraverso l&#39;evoluzione in una vasta gamma di microrganismi. TLR svolgono un ruolo centrale nella attivazione dei macrofagi, che è di solito associata con l&#39;espressione genica alterazione. I macrofagi sono fondamentali per molte malattie e sono emersi come bersagli attraenti per la terapia. Nel seguente protocollo, si descrive una procedura per isolare i macrofagi peritoneali murini utilizzando medio Thioglycollate di birra. Quest&#39;ultimo incrementare la migrazione dei monociti nel peritoneo, di conseguenza tale da far salire il rendimento dei macrofagi per 10 volte. Diversi studi sono stati condotti utilizzando midollo osseo, milza o peritoneali derivati ​​da macrofagi. Tuttavia, i macrofagi peritoneali hanno dimostrato di essere più maturo sull&#39;isolamento e sono più stabili nella loro funzionalitàlità e fenotipo. Così, macrofagi isolati da murino cavità peritoneale presentano una popolazione importante cella che può servire in diversi studi immunologici e metabolici. Una volta isolato, i macrofagi sono state stimolate con differenti ligandi TLR e di conseguenza l&#39;espressione del gene è stata valutata.

Per prima cosa caratterizzati isolate macrofagi peritoneali murini mediante citometria a flusso. Per farlo, abbiamo utilizzato (F4 / 80) anticorpi che riconoscono specificamente i marcatori espressi solo da parte dei macrofagi. Questa caratterizzazione è necessaria per determinare la percentuale di isolati macrofagi e distinguerli tra cellule ottenute durante il processo di isolamento. Come mostrato in (figura 1), la percentuale di cellule che esprimono l&#39;antigene F4 / 80 è stata costantemente risul...

Descriviamo qui un semplice protocollo per isolare i macrofagi peritoneali murini. Questa procedura è seguita dall'estrazione dell'RNA per effettuare l'analisi dell'espressione genica dopo la stimolazione dei recettori Toll-like.

Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i macrofagi peritoneali murini ed eseguire un'analisi dell'espressione genica dopo la stimolazione dei recettori tipo toll. Questo viene ottenuto innanzitutto iniettando il 3,8% di mezzo thioglicolato di Brewer nella cavità peritoneale del topo per aumentare la migrazione dei monociti nel peritoneo e, di conseguenza, incrementare il rendimento di macrofagi dopo tre giorni; successivamente si procede all'eutanasia del topo e si inietta nel cavo peritoneale soluzione salina tamponata al fosfato fredda (ECCOs PBS) per raccogliere le cellule.Dopo un delicato massaggio della cavità peritoneale, il liquido peritoneale viene accuratamente aspirato. Successivamente, le cellule ottenute vengono coltivate e i macrofagi peritoneali indotti vengono caratterizzati mediante citometria a flusso. L'ultimo passaggio consiste nello stimolare questi macrofagi con diversi ligandi dei recettori di tipo toll o TLR ed isolare l'RNA dai campioni.Infine, la reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa quantitativa viene utilizzata per misurare l'espressione del gene di interesse. L'obiettivo della seguente procedura è isolare, imitando il processo in vivo, i macrofagi peritoneali utilizzando il mezzo di Brewer al tioglicolato. Questo mezzo aumenterà la migrazione dei monociti nel peritoneo e, di conseguenza, incrementerà il rendimento di macrofagi.Dopo l'isolamento, i macrofagi verranno stimolati con diversi ligandi dei recettori di tipo toll per studiare la regolazione molecolare dell'epcidina, considerata il nostro gene di interesse. Per iniziare, preparare il mezzo di Brewer's bio glyco otto al 3,8% come descritto nel protocollo testuale, utilizzando siringhe da un millilitro munite di aghi da 23 gauge. Iniettare un millilitro di mezzo di Brewer's bio glyco otto al 3,8% nella cavità peritoneale di ciascun topo e attendere tre giorni.Utilizzare una nuova siringa e un nuovo ago per ogni topo dopo l'anestesia e l'eutanasia, come descritto nel protocollo testuale; inumidire l'addome di ogni topo con etanolo al 70%. Eseguire un'incisione laterale lungo la linea mediana inferiore del peritoneo con le forbici. Usare pinze per tirare indietro la pelle addominale ed esporre la sottile pelle peritoneale trasparente.Quindi iniettare cinque millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato ECCOs fredda nella cavità peritoneale di ogni topo, utilizzando siringhe da cinque millilitri munite di aghi da 20 gauge. Effettuare un delicato massaggio della cavità peritoneale, quindi aspirare con attenzione il liquido senza perforare alcun organo. Rimuovere l'ago ed espellere il liquido peritoneale in provette coniche da 50 millilitri.Centrifugare successivamente il liquido peritoneale raccolto per 10 minuti a 400 ×g o a 1500 giri al minuto in una centrifuga refrigerata; le cellule devono essere mantenute fredde per tutta la durata della procedura. Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo RPMI 1640. Utilizzando un emocitometro, contare le cellule ed aggiustare i campioni a una densità cellulare di 1 milione di cellule per millilitro.Caratterizzare il fenotipo delle cellule isolate mediante citometria a flusso per confermare l'arricchimento di macrofagi. Utilizzare 1 milione di cellule per topo e anticorpi contro F four 80, un antigene di superficie espresso sui macrofagi in modo diretto. Dopo l'isolamento, aggiungere 1 milione di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a sei.Piastra a pozzetti. Lasciare che i macrofagi peritoneali murini aderiscano ai pozzetti coltivandoli per uno o due ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, rimuovere le cellule non aderenti lavando delicatamente tre volte con soluzione salina tamponata al fosfato tiepida.Quindi aggiungere 900 microlitri di DMEM privo di siero alle cellule. Preparare soluzioni concentrate 10 x di ciascun ligando del recettore di tipo toll o TLR come indicato nel protocollo testuale. Quindi aggiungere 100 microlitri delle soluzioni concentrate in ciascun pozzetto, eseguendo così una diluizione di dieci volte nella coltura.Le cellule per 24 ore in presenza dei ligandi del TLR. Per eseguire l'isolamento dell'RNA, in primo luogo rimuovere tutto il mezzo e lisare le cellule direttamente nelle piastre a sei pozzetti, aggiungendo un millilitro di reagente triol in ogni pozzetto e aspirando e dispensando più volte il lisato cellulare attraverso una pipetta.Quindi incubare i campioni omogeneizzati per cinque-dieci minuti a temperatura ambiente per permettere la completa dissociazione dei complessi proteici nucleari. Dopo l'incubazione, trasferire il lisato in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri per RNAs e DNA spree, e aggiungere 0,2 millilitri di cloroformio per ogni millilitro di reagente triolo. Agitare vigorosamente le provette a mano per 15 secondi prima di incubarle a temperatura ambiente per cinque-dieci minuti.Quindi centrifugare a 12.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Osservare la separazione della miscela in una fase inferiore rossa di fenolo-cloroformio, una fase intermedia e una fase acquosa superiore incolore. L'RNA rimane esclusivamente nella fase acquosa.Trasferire con attenzione la fase acquosa superiore in una provetta pulita senza disturbare la fase intermedia. Precipitare l'RNA aggiungendo 0,5 millilitri di alcol isopropilico dopo aver incubato i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Centrifugare a 12.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.I precipitati di RNA formano un pellet bianco lungo i lati e sul fondo del tubo. Rimuovere il soprannatante e lavare il pellet di RNA una volta con un millilitro di etanolo al 75%. Mescolare i campioni mediante vortex e quindi centrifugare a 7.500 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo aver rimosso il surnatante, lasciare asciugare brevemente l'RNA all'aria per 10 minuti. Successivamente, sciogliere l'RNA in 100 microlitri di acqua priva di RNA e incubare per 10 minuti a 55 gradi Celsius. Quindi, quantificare l'RNA utilizzando uno spettrofotometro per farlo.Diluire i campioni 100 volte in acqua priva di RNA e leggere alle lunghezze d'onda di 260 nanometri, equalizzare le concentrazioni di RNA e sintetizzare il cDNA secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare il sistema R-T-P-C-R per il kit di sintesi del primo filamento di cDNA. Successivamente, misurare i livelli di mRNA genico mediante PCR in tempo reale in un sistema di rilevamento di DNA in tempo reale, normalizzando i livelli di espressione genica con due geni di controllo.I macrofagi peritoneali isolati sono stati caratterizzati mediante citometria a flusso per determinare la percentuale di macrofagi isolati e per distinguerli tra le cellule ottenute durante il processo di isolamento. La percentuale di cellule che esprimevano l'antigene F4/80 è risultata costantemente superiore al 95%. Le cellule isolate sono state quindi trattate con diversi ligandi del recettore simile a TLR e con mRNA. I livelli di epcidina sono stati misurati mediante RT-PCR per il recettore simile a TLR1 e TLR2, e per il recettore simile a TLR4.Un recettore olico sei e due ligandi sono stati in grado di stimolare l'mRNA della epcidina in macrofagi peritoneali. Nel complesso, questi risultati dimostrano l'utilità di questo protocollo per isolare con successo macrofagi peritoneali e per studiare con precisione la regolazione molecolare dell'espressione genica. Dopo aver visto questo video, avrete una buona comprensione di come isolare, identificare e coltivare macrofagi peritoneali.

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Immunologia e Infezioni

La cavità peritoneale nei mammiferi contiene diverse popolazioni di cellule immunitarie cruciali per risposte immunitarie innate. Un metodo efficiente isolamento è necessario per le analisi biochimiche e funzionali di queste cellule. Qui forniamo un metodo completo per l'isolamento di cellule cavità peritoneale nel topo.

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Questo video mostra una procedura per analizzare l'efferocitosi mediata da macrofagi peritoneali di timociti di topo apoptotico mediante microscopia a fluorescenza.

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In questo protocollo, descriviamo metodi per trasfettare in modo efficiente linee cellulari di macrofagi murini con siRNA utilizzando il sistema navetta a 96 pozzetti Amaxa Nucleofector, stimolare i macrofagi con lipopolisaccaride e monitorare gli effetti sulla produzione di citochine infiammatorie.

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Presentiamo un protocollo semplice ed efficiente per la generazione di macrofagi umani. Buffy coats sono trattati con doppia centrifugazione in gradiente di densità e monociti isolati sono poi differenziate a macrofagi in sacchi di coltura cellulare teflonato. Questo massimizza i rendimenti macrofagi e facilita la raccolta di cellule per esperimenti successivi.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

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Caratterizzazione funzionale dei macrofagi regolatori che inibiscono l&#39;immunità reattiva dell&#39;inferta

Farmaci a base di anticorpi hanno rivoluzionato il trattamento per le malattie infiammatorie. Oltre ad avere effetti diretti su target specifici, gli anticorpi possono attivare i macrofagi per diventare anti-infiammatori. Questo protocollo descrive come antinfiammatorio del macrofago attivazione può essere valutato in vitro utilizzando macrofagi del midollo osseo del topo e in vivo, utilizzando i macrofagi peritoneali.

Valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e l'attivazione dei macrofagi peritoneali

Qui, vi presentiamo un protocollo per preparare i timociti apoptotici e i macrofagi peritoneali e analizzare l'efficienza dell'efferocitosi e il blocco specifico inibitore-mediato di timociti apoptotici engulfment. Questo protocollo ha un'ampia applicazione nella clearance mediata da cellule di altre particelle, tra cui perle artificiali e batteri.

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Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo dai topi.

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Dimostriamo un protocollo passo-passo per lo studio della funzione genica nei macrofagi residenti nel tessuto peritoneale in vivo, utilizzando vettori lentivirali.

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Impara a isolare macrofagi peritoneali murini per analisi dell'espressione genica dopo stimolazione dei recettori Toll-like. Questo metodo ottimizza la resa cellulare e supporta studi immunologici avanzati.

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