Analisi delle funzioni delle mastociti in vivo usando topi ' Mast Cell Knock-in'

L'obiettivo generale del seguente metodo è analizzare le funzioni dei mastociti in vivo utilizzando topi knockin dei mastociti. Ciò si ottiene generando prima mastociti in coltura derivati dal midollo osseo, o BMC MC o attecchimento in topi carenti di mastociti. Nella seconda fase, i BMC MC vengono trasferiti adottivamente in vari siti anatomici nei topi carenti di mastociti per generare topi knockin dei mastociti.

In definitiva, il numero e la distribuzione anatomica dei mastociti trasferiti in adozione vengono valutati mediante citometria a flusso e analisi immunoistochimica per valutare in che misura le popolazioni innestate assomigliano a quelle trovate nei topi wild type. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la valutazione diretta delle funzioni del tipo di parete innestata o delle popolazioni di cellule MA geneticamente modificate in vivo. Questo metodo può quindi aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule AIC, come ad esempio in che misura le cellule MA o i loro prodotti possono contribuire alle caratteristiche dei modelli murini di processi fisiologici, immunologici o patologici, compresi i modelli di malattia umana.

In generale, gli individui che imparano questo metodo possono avere difficoltà perché l'attecchimento e la carenza di mastociti possono variare a seconda del metodo utilizzato per generare le CMC del midollo osseo, della radice dell'iniezione, del numero di MC del BMC iniettati e del numero di settimane un peso dopo l'attecchimento prima di eseguire esperimenti in vivo. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto gli aspetti della procedura di attecchimento sono difficili da apprendere a meno che non si veda esattamente come vengono eseguiti. Per estrarre prima il midollo osseo, utilizzare strumenti di dissezione sterili per prelevare il femore, la tibia e il perone da topi di tipo selvatico senza imprecare alcuna epifisi ossea.

Man mano che ogni osso viene sezionato, fissarlo con una pinza e raschiare via tutto il tessuto estraneo. Quindi posizionare l'osso in PBS su ghiaccio quando tutte le ossa sono state raccolte, trasferirlo in una cappa di coltura tissutale sterile, quindi uno alla volta, fissare ogni osso con una pinza e tagliare entrambe le epifisi per esporre le cavità midollari. Successivamente, utilizzando siringhe da tre millilitri, dotate di aghi da 30 gauge e mezzo freddo di lavaggio, tutto il midollo rosso di ciascun osso in una nuova capsula di Petri Quando tutte le ossa sono state lavate, utilizzare la stessa siringa per dissociare i gruppi di cellule del midollo osseo mediante aspirazione ed espulsione delicata ripetute.

Quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Riempire la provetta con il mezzo di lavaggio freddo e centrifugare le cellule in eccesso. Sospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di terreno di coltura.

Quindi trasferire le cellule del midollo osseo in un pallone di coltura tissutale di dimensioni adeguate. Dopo uno o due giorni di coltura, trasferire le cellule non aderenti in un nuovo pallone insieme a 10 millilitri di coltura fresca, terreno per topo durante le settimane successive. Nutrire le cellule ogni tre o quattro giorni è appena dimostrato.

Trasferimento delle cellule di non aderenza in un nuovo pallone una volta alla settimana fino a quando non rimangono più cellule di aderenza per l'attecchimento intradermico nel pinner dell'orecchio Resus. Sospendi i BMC MC a quattro volte 10 per sette cellule per millilitro in DMEM freddo. Quindi aspirare le cellule in una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 30 e posizionare la siringa sul ghiaccio.

Successivamente, confermare la profondità appropriata dell'anestesia con un pizzico superiore di un topo ricevente carente di mastociti di quattro o sei settimane e applicare un unguento per gli occhi per iniettare le cellule. Usa il dito indice per esporre e allungare la faccia ventrale dell'aptina dell'orecchio, creando una pressione verticale sulla faccia dorsale dell'orecchio. Quindi somministrare 1 iniezione intradermica da 25 microlitri di una volta 10 ai sei BMC MC al centro dell'orecchio e una seconda iniezione da 25 microlitri dello stesso verso la punta del pinner.

Per l'intraperitoneale, l'attecchimento risospende i MC BMC a una volta da 10 a sette cellule per millilitro in DMEM freddo. Quindi utilizzare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 25 per iniettare due volte 10 alle sei CMC BM in 200 microlitri di terreno nella cavità peritoneale dei riceventi carenti di mastociti per attecchimento endovenoso. Risospendere le CMC del BM a 2,5 volte 10 per le sette cellule per millilitro nel DMEM freddo, quindi iniettare cinque volte 10 alle sei MC del BMC in 200 microlitri di terreno attraverso la vena caudale.

Da quattro a sei settimane dopo un attecchimento intraperitoneale, utilizzare una siringa da cinque millilitri dotata di un ago da 25 gauge per iniettare cinque millilitri di PBS freddo nella cavità peritoneale dell'animale ricevente. Massaggiare l'addome per 20 secondi per raccogliere le cellule peritoneali. Utilizzare quindi una siringa da cinque millilitri dotata di ago calibro 22 per aspirare lentamente il lavaggio peritoneale.

La percentuale di mastociti e il numero totale di cellule nel liquido di lavaggio peritoneale possono quindi essere valutati mediante citometria a flusso o istochimica. Per valutare i mastociti nelle finestre mesenteriche, aprire la membrana peritoneale per esporre il tratto intestinale. Disporre da quattro a cinque finestre mesenteriche per mouse su un vetrino seguito da una fissazione di un'ora in soluzione di rumore dell'auto.

Aggiungere la temperatura ambiente al termine dell'incubazione, asciugare i vetrini all'aria e rimuovere l'intestino. Le finestre mesenteriche fisse rimarranno attaccate ai vetrini. Infine, colorare le preparazioni per 20 minuti a temperatura ambiente con la soluzione di colorazione chaba rappresentano l'analisi citofluorimetrica e la colorazione blu odina delle CMC del midollo osseo dopo 15 e 45 giorni di coltura Nel DMEM, integrato con IL, vengono mostrate tre CMC del midollo coltivate per 45 giorni e pure al 95% e contengono un numero elevato di granuli citoplasmatici.

Pertanto, le cellule di queste colture sono adatte per esperimenti di attecchimento, mentre le cellule coltivate per 15 giorni non sono presenti in queste immagini. L'attecchimento riuscito del penny dell'orecchio quattro settimane dopo l'intradermico, le finestre mesenteriche dell'attecchimento, la cavità peritoneale sei settimane dopo l'attecchimento intraperitoneale e il polmone 12 settimane dopo l'attecchimento endovenoso sono mostrati come previsto. I mastociti sono presenti nei campioni di tessuto isolati da topi wild type, mentre nessun mastocito è stato rilevato negli animali carenti di mastociti nei topi knockin dei mastociti.

Tuttavia, i BMC MC trasferiti in adozione appaiono in luoghi simili a quelli osservati negli animali di tipo selvatico. Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere presente che l'intervallo tra l'attecchimento e lo studio dell'esperimento varierà a seconda del sito di iniezione dei mastociti. È molto importante rispettare tali intervalli per consentire alle cellule innestate di maturare e occupare la posizione finale in vivo.

Questo approccio ha fornito e continua a fornire importanti informazioni su ciò che la cellula di massa e il loro prodotto possono o non possono fare in vivo. Tieni sempre presente che lavorare con animali vivi richiede una formazione specifica, un'adeguata revisione e approvazione dei protocolli sperimentali e il rigoroso rispetto dei più alti standard di cura degli animali, inclusa la cura di ridurre il dolore e lo stress dell'animale quando si eseguono queste procedure.