Name: Comet Assay come una misura indiretta della sistemica Stress ossidativo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Impara l'assay COMET per misurare indirettamente lo stress ossidativo sistemico usando leucociti isolati da sangue umano. Questo metodo semplice e affidabile quantifica i danni al DNA mediante microscopia a fluorescenza.

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Vorremmo ringraziare il ERP Stiftung, in Triesen Liechtenstein, per sostenere finanziariamente la nostra ricerca sullo stress ossidativo.

Studi sul test della cometa eseguite presso l&#39;Università di Basilea, Dipartimento di Oftalmologia sono stati approvati dal Comitato Etico Locale di Basilea 1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparare Dulbecco tampone fosfato (PBS) (Ca ++, Mg ++ libero) soluzione aggiungendo PBS (1 L confezione) e 990 ml di dH 2 O ai media. Regolare il pH a 7,4. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare la soluzione di lisi: Per preparare 1.000 ml aggiungono 2,5 M NaCl (146,1 g), EDTA 100 mm (37,2 g) e 10 Trizma mm base (1,2 g) in dH 2 O. </li><li> Preparare buffer per elettroforesi (NaOH 300 mm / 1 mM EDTA) con l&#39;aggiunta di 30 ml di NaOH 10 M e 7,5 ml di 0,2 M EDTA, qb a 1500 ml dH 2 O e mescolare bene. Il volume totale dipende dalla capacità di dialogo gel. Prima dell&#39;uso, misurare il pH del tampone per assicurare un pH&gt; 13. </li><li> Preparare tampone neutralizzazione contenente 0,4 M Tris (48.5 gm aggiunto a ~ 800 ml dH 2 O, aggiustare il pH a 7,5), concentrato (&amp; #62; 10 M HCl) a 1000 ml con dH 2 O. Conservare la soluzione a temperatura ambiente. </li><li> Preparare soluzione colorante. Per etidio bromuro (EtBr, 10x Archivio, 20 mg / ml) aggiungere 10 mg di EtBr in 50 ml di dH 2 O e conservare a temperatura ambiente. Per 1x Archivio - mescolare 1 ml con 9 ml dH 2 O. PRUDENTE! Maneggiare EtBr con adeguata cautela in quanto è un noto cancerogeno. </li></ol> 2. Isolamento dei leucociti <ol><li> Ottenere campioni umani di sangue (20 ml) con anticoagulante come l&#39;eparina mediante puntura venosa. </li><li> Separare i linfociti utilizzando un separatore cellulare gradiente di densità come Histopaque. <ol><li> Brevemente, diluire il sangue in rapporto 1: 1 con PBS o RPMI (senza FBS) e lo strato di oltre 600 microlitri separatore cellulare liquido. </li><li> Centrifugare 1.800 xg per 20 min a 4 ° C. Aspirare il coat &#39;buffy&#39; in 3-5 ml di PBS / RPMI e centrifugato a 300 xg per 10 minuti per ottenere il pellet linfociti. </li><li> Recuperare i linfociti da appena sopra confine tra PBS (RPMI) E separatore cellulare liquido, con una pipetta. Rimuovere le bande leucociti dall&#39;interfaccia tra il plasma e il separatore di cella strati liquidi di ciascun tubo e raccogliere in una provetta da 50 ml. </li></ol></li><li> Portare il volume totale di 50 ml con il freddo di Dulbecco modificato (DMEM). Lavare la sospensione cellulare tre volte con DMEM a 300 xg per 10 min. </li><li> Contare il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro. Sospendere le cellule in PBS e aliquote in provette da microcentrifuga a 10 7 cellule / tubo. </li><li> Pipettare 0,4 ml di cellule in 5 ml di plastica tubo usa e getta. Aggiungere 1,2 ml di 1% a bassa temperatura di gelificazione agarosio a 40 ° C. Mescolare e rapidamente e pipettare 1,2 ml di sospensione cellulare sulla superficie agarosio-coperto di un vetrino pre-rivestite. Evitare la produzione di bollicine. </li><li> Lasciare che il agarosio di gel per circa 2 minuti. Essere coerenti con il tempo e la temperatura utilizzata per la gelificazione, e garantire che agarosio sia completamente impostata prima di immergere in soluzione di lisi. Dopo completamente set, immergere in soluzione lisante a ~ 4 ° C. </li></ol> 3. Lysis e elettroforesi NOTA: La procedura descritta è per elettroforesi in condizioni di pH&gt; 13 alcaline. <ol><li> Dopo almeno 2 ore a ~ 4 ° C, rimuovere delicatamente i vetrini dalla soluzione di lisi. Collocare i vetrini affiancati sulla scatola gel orizzontale vicino ad una estremità, scorrevole come vicino possibile. </li><li> Riempire i serbatoi tampone con appena fatto tampone pH&gt; 13 elettroforesi fino a quando il livello del liquido copra completamente le diapositive (evitare bolle sul agarosio). </li><li> Lasciare diapositive sedersi in tampone alcalino per 20 min per consentire lo svolgimento del DNA e l&#39;espressione di danni alcali-labili. </li><li> Attivare alimentazione a 25 volt (~ 0,75 V / cm) e regolare la corrente a 300 milliampere alzando o abbassando il livello del buffer. Elettroforesi i vetrini per 30 min. </li><li> Spegnere l&#39;alimentazione. Sollevare delicatamente le diapositive dal buffer e ppizzo su un vassoio di scarico. Eliminare cappotto saggio i vetrini con la neutralizzazione Buffer. Lasciare i vetrini a sedere per almeno 5 minuti. Scolare diapositive e ripetere altre due volte. </li><li> Colorare i vetrini con 80 microlitri 1x etidio bromuro (EtBr) e lasciar riposare per 5 minuti e poi immergere in acqua distillata fredda per eliminare l&#39;eccesso macchia. Poi posto un vetrino sul vetrino e archiviare immediatamente. Conservare i vetrini per un mese a temperatura ambiente in condizioni di asciutto. NOTA: Altri macchie DNA (ad esempio, SYBR-verde) può essere utilizzato anche. Attenzione! indossare guanti di protezione, come la maggior parte delle tinture sono mutageni. </li></ol> 4. Quantificazione delle rotture del DNA <ol><li> Per visualizzare il danno al DNA, di osservare il vetrino DNA EtBr macchiato con un microscopio a fluorescenza obiettivo 40X. </li><li> Valutare danni DNA quantitativamente nelle cellule misurando la lunghezza di migrazione del DNA e la percentuale di DNA migrato (Figura 1A). Quantificare il danno al DNA (Figura 1B) dal momento in cui parti apribili e Olive-Moment. Definizioni di Tail-Moment e Olive -Moment sono stati precedentemente data 8-10. NOTA: Nella nostra esperienza è abbastanza per attaccare da uno dei parametri. Le cellule sono fotografati impostando lo strumento automatico che analizza sulle celle vetrino da microscopio e fotografie. Quantificazione delle rotture del DNA può essere effettuata da pacchetti software di analisi delle immagini. Ci sono diversi pacchetti software differenti che sono realizzati su misura per catturare l&#39;immagine delle cellule e quantificare il danno al DNA. Si consiglia di utilizzare lo stesso pacchetto software tutto l&#39;esperimento. Il tecnico di laboratorio identifica la cellula intatta o una cometa da valutare sul computer e fa clic con il mouse su di esso. La cella cometa o intatto viene segnato automaticamente. </li></ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
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</ol>

Scienziati svedesi Ostling e Johanson sono stati i primi nel loro campo di utilizzare test della cometa per quantificare i danni del DNA nelle cellule 1. Le condizioni neutre che i due scienziati hanno usato, tuttavia, solo permesso la rilevazione di doppio filamento rotture del DNA. Singh et al. In seguito adattato il test per l&#39;uso in ambiente alcalino, che ha prodotto una versione sensibile che potrebbe valutare doppie e singole filamento rotture del DNA e di rilevare i siti alcali-labili 12. Dal suo sviluppo iniziale, il test è stato modificato in varie fasi per renderlo adatto per valutare i tipi di danno al DNA in diversi tipi cellulari 13-15. Come per tutte le tecniche, prestando una rigorosa attenzione ai dettagli tecnici è importante per ottenere risultati accurati 16. Sulla base della nostra esperienza, i migliori risultati si ottengono se ogni passo da metodologico preparazione soluzione cometa quantificazione-viene eseguita da esperti tecn laboratorioicians. L&#39;utilizzo di mezzi freschi e correttamente preparato, adeguate tecniche di pipettatura, esatta tempistica e (come precedentemente menzionato nella sezione risultati) l&#39;uso di leucociti preparati al momento sono essenziali per lisi e elettroforesi su gel di ottenere risultati accurati 17. Tutte le singole fasi di questo saggio sono ugualmente importanti per ottenere risultati affidabili. 16 In generale i migliori risultati si ottengono se ogni singolo passo metodologico dalla preparazione soluzione fino quantificazione cometa viene eseguita da esperti del laboratorio technicians.Important sembrano l&#39;uso di mezzi freschi e correttamente preparati , adeguate tecniche di pipettatura, i tempi esatti e, come già di cui nella sezione dei risultati l&#39;uso di leucociti preparati al momento per lisi e gel elettroforesi per ottenere risultati adeguati dal saggio 17. Come fare altre metodologie, la tecnica comet assay ha il suo advanTages e svantaggi. Essendo un metodo sensibile, il saggio è vulnerabile a fattori (ad esempio, raggi UV) che possono aumentare la rotture del DNA e quindi influenzare i risultati. Qualsiasi fattore che può aumentare lo stress ossidativo, ad eccezione di ciò che è oggetto di ricerca, dovrebbe essere evitato. Stress possono aumentare il livello di stress ossidativo non solo nei leucociti, ma anche in tutti gli altri mezzi di sangue e linfociti. Come detto in precedenza ci sono molti modi diversi e più dirette di misurare lo stress ossidativo 18,19. Il saggio comet è uno dei molti metodi che ha alcuni vantaggi. Questi includono il suo costo relativamente basso, il piccolo numero di celle richieste (&lt;10.000 cellule) e quindi i piccoli campioni di sangue necessaria per paziente, il periodo relativamente breve di tempo necessario per quantificare il danno del DNA in cellule (circa 3 giorni), la sua sensibilità e la sua diffusa applicabilità ai danni asini DNA in diversi tipi di cellule. In passato abbiamo scegliere di lavorare con leucociti da quando abbiamo avuto esperienza con questotipo cellulare ed era applicabile per un particolare studio previsto. Un altro vantaggio del comet assay è che può essere utilizzato per rilevare diversi tipi e livelli di danno al DNA e quindi può essere applicata in vari altri settori di studi oltre stress ossidativo quali studi di riparazione del DNA, trattamenti per il supporto o genotossicità. Lo stress ossidativo è ora riconosciuto come giocare un ruolo fondamentale nella patogenesi di diverse malattie. Il metodo comet assay, mentre uno dei molti modi per misurare lo stress ossidativo 18,19, è relativamente semplice, versatile e poco costoso. Quando masterizzato, questo metodo può essere utilizzato in tutti i settori della medicina in cui lo stress ossidativo svolge un ruolo significativo 8-10,20,21.

Comet assay è stato sviluppato da scienziati svedesi Ostling e Johanson 1. DNA è una molecola carica negativa. Durante l&#39;elettroforesi, più piccole, i frammenti di DNA danneggiato viaggiano più velocemente verso un anodo caricato positivamente 2. Più i frammenti di DNA, più veloce la loro migrazione verso l&#39;anodo a formare un tipico &quot;comet&quot; con una &quot;testa&quot; composta intatta, DNA integro e una &quot;coda&quot; composto di frammenti di DNA danneggiati 3. DNA danneggiato può essere riparato da diversi meccanismi nel corpo 4, che mantengono la generazione di rotture del DNA abbastanza equilibrati 5. Se, tuttavia, il saldo è a favore di rotture del DNA, le interruzioni possono accumularsi e finiranno contribuire allo sviluppo di una malattia. Il nostro DNA subisce circa 0.000165% di danni in un determinato momento 6. Singole rotture del DNA bloccati si riferiscono ad un difetto su uno dei due filamenti del DNA a doppia elicaconsiderando double-stranded rotture del DNA sono causati quando entrambi i filamenti della doppia elica del DNA sono danneggiati. Ci sono vari fattori che possono aumentare la quantità di rotture del DNA in un dato momento, quali l&#39;età della cellula, fumo di sigaretta, vari farmaci o stress ossidativo 7-9. Se tutti i fattori che portano a rotture del DNA avanzati sono mantenute costanti, quindi la quantificazione di rotture del DNA per mezzo di test della cometa è un buon parametro indiretto dello stress ossidativo. Il metodo di test della cometa è utilizzata sempre più oggi in medicina tra cui oftalmologia. Una ragione di ciò è che lo stress ossidativo è sempre più riconosciuto come un meccanismo patogenetico per varie malattie 8-11 e comet assay è un metodo con cui lo stress ossidativo può indirettamente essere quantificato.

<table><tbody><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Qualigeni</td> <td>(CPW59)</td><td></td></tr><tr><td>Disodio EDTA</td><td>HiMedia</td> <td>(RM1370)</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma</td> <td>(E-8751)</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td> <td>(1077-1)</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td><td>HiMedia</td> <td>(TS1006)</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Ranbaxy Rankem</td><td>(S0160)</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>BDH-Merck</td><td>(89021)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>(RM 845)</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Spectrochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiali necessari per l'elettroforesi su gel</td></tr><tr><td>Agarosio a fusione normale (NMA)</td><td>HiMedia</td><td>(RM273)</td><td></td></tr><tr><td>Basso punto di fusione Agarosio (LMPA)</td><td>Sigma</td><td>(A9414)</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo - Qualigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti (n. 1, 24 x 60 mm)</td><td>Blue Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubi</td><td>Tarsons</td><td>(500010)</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor e punte</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio, Vetrini</td><td></td><td></td> convenzionali / Micro gel per elettroforesi (MGE)<td></td></tr></tbody></table>

comet assay come una misura indiretta della sistemica stress ossidativo

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Organismi eucarioti superiori non possono vivere senza ossigeno; tuttavia, paradossalmente, l&#39;ossigeno può essere dannoso per loro. La molecola di ossigeno è chimicamente inerte, relativamente perché ha due elettroni spaiati situati in diverse pi * orbitali anti-incollaggio. Questi due elettroni hanno spin paralleli, nel senso che ruotano nello stesso verso attorno al proprio asse. Per questo motivo la molecola di ossigeno non è molto reattivo. Attivazione di ossigeno può avvenire per due meccanismi differenti; sia attraverso la riduzione con un elettrone alla volta (riduzione monovalente), oppure attraverso l&#39;assorbimento di energia sufficiente per invertire la rotazione di uno degli elettroni spaiati. Il risultato è la produzione di specie reattive ossidative (ROS). Ci sono un certo numero di modi in cui il corpo umano elimina ROS nel suo stato fisiologico. Se la produzione di ROS supera la capacità di riparazione, i risultati dello stress ossidativo e danni molecole diverse. Ci sono molti metodi diversi con cui lo stress ossidativo può essere measured. Questo manoscritto concentra su uno dei metodi denominati gel elettroforesi cellulare, noto anche come &quot;comet assay&quot;, che consente la misurazione di rotture del DNA. Se tutti i fattori che causano danni al DNA, diverso da stress ossidativo sono mantenute costanti, la quantità di danno al DNA determinato tramite test cometa è un buon parametro di stress ossidativo. Il principio è semplice e si basa sul fatto che le molecole di DNA sono caricate negativamente. Una molecola di DNA intatto ha una grande dimensione tale da non migra durante l&#39;elettroforesi. Rotture del DNA, tuttavia, se presente risultato in frammenti più piccoli che si muovono nel campo elettrico verso l&#39;anodo. Frammenti più piccoli migrano più velocemente. Poiché i frammenti hanno dimensioni diverse il risultato finale della elettroforesi non è una linea distinta ma piuttosto un continuum con la forma di una cometa. Il sistema consente di quantificare il &quot;comet&quot; risultante e quindi delle rotture del DNA nella cellula.

Sebbene il metodo di test della cometa rende risultati riproducibili, può essere influenzata da una varietà di fattori. Uno di questi fattori è o meno i leucociti vengono crioconservati prima lisi e gel-elettroforesi o se questa operazione viene eseguita su leucociti appena preparati. La Figura 2 mostra che nel gruppo 2, dove sono stati crioconservati prima lisi e l&#39;elettroforesi su gel ss- DNA leucociti pause erano significativamente più alti, rispetto al gruppo 1 dove lisi e gel -Elettroforesi è stato fatto su cellule preparate al momento. Il dosaggio può anche essere utilizzato per valutare indirettamente stress ossidativo sistemico. La tabella 1 mostra le statistiche descrittive per fanalino posteriore momento e Olive- momento in fumatori e soggetti sani. I dati rivelano che il fumo mezzo pacchetto di sigarette al giorno raddoppia pause ssDNA nei leucociti circolanti 9. <img alt="Figura 1A" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="Figura 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> Figura 1. (A) raffigura il microscopio utilizzato durante l&#39;analisi del test della cometa. (B) Δ raffigura una tipica &quot;cometa&quot; con una testa brillante e la coda (danneggiato frammenti di DNA più piccoli). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> Figura 2. pause ssDNA erano significativamente più alti quando i leucociti sono stati crioconservati (Gruppo 2) rispetto a quando leucociti preparati al momento sono stati utilizzati prima di lisi e gel elettroforesi. <imgalt = &quot;tabella 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; Tabella 1. I fumatori avevano più del doppio del numero di interruzioni ssDNA rispetto a età e sesso abbinato non fumatori sani.

Comet assay misura rotture del DNA, indotte da fattori diversi. Se tutti i fattori (ad eccezione di stress ossidativo) che causano danni al DNA sono mantenute costanti, la quantità di danni al DNA è un buon parametro indiretto dello stress ossidativo. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare comet assay per la misura indiretta di stress ossidativo.

Comet Assay come una misura indiretta della sistemica Stress ossidativo

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare il test del COMETA per la misurazione indiretta dello stress ossidativo. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto i leucociti da campioni di sangue umano. Il secondo passaggio consiste nel mescolare le cellule con agarosio a basso punto di fusione e immobilizzare le cellule su vetrini.Successivamente, le cellule vengono lisate per due ore, seguite da elettroforesi dopo aver colorato i vetrini con bromuro di dietidio. Il DNA viene visualizzato mediante microscopia a fluorescenza. Infine, le rotture del DNA vengono quantificate mediante analisi software dei dati di microscopia a fluorescenza.Oggi sappiamo che lo stress ossidativo svolge un ruolo cruciale nella patogenesi di diverse malattie, comprese ovviamente le malattie oculari. Esistono molti modi diversi per misurare lo stress ossidativo. Un metodo indiretto per misurarlo è rappresentato dal test cometa.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che si tratta di un approccio semplice, economico e affidabile per misurare indirettamente lo stress ossidativo. I leucociti Lucas per questo esperimento saranno isolati da campioni di sangue umano ottenuti con un anticoagulante mediante puntura venosa per separare i linfociti: innanzitutto, diluire il sangue in rapporto uno a uno con PBS. Successivamente, sovrapporre 600 microlitri di un liquido separatore cellulare a gradiente di densità, come l'Histo-Paque, e centrifugare a 1.800 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius.Aspirare il buffy coat in tre-cinque millilitri di PBS e centrifugare a 300 G per 10 minuti. Per prelevare i linfociti utilizzando una pipetta, recuperare i linfociti appena al di sopra del confine tra il PBS e il liquido separatore cellulare. Rimuovere le bande di leucociti dall'interfaccia tra il plasma e i livelli di liquido separatore cellulare di ogni provetta e raccoglierle in un unico tubo da 50 millilitri.Portare il volume totale a 50 millilitri con PBS freddo. Lavare la sospensione cellulare tre volte con PBS a 300 G per 10 minuti. Dopo il terzo lavaggio, contare il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro.Sospendere le cellule in PBS ed Eloqua in provette per microcentrifuga, utilizzando 10 milioni di cellule per provetta. Pipettare 0,4 millilitri di cellule in una provetta di plastica monouso da 1,5 millilitri. Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare in 500 microlitri di una soluzione al 1% a bassa temperatura di gelificazione.Agarosio a 40 gradi Celsius, preparato in anticipo, mescolare rapidamente e pipettare 50 microlitri della sospensione cellulare sulla superficie ricoperta di agarosio di un vetrino pre-ricoperto. Lasciare solidificare l'agarosio per circa due minuti a quattro gradi Celsius. Mantenere costanti il tempo e la temperatura utilizzati per la solidificazione e assicurarsi che l'agarosio sia completamente indurito prima di procedere con la procedura di lisi.Una volta che l'agarosio si è completamente solidificato, immergere i vetrini in una soluzione lisante a quattro gradi Celsius per almeno due ore. Successivamente, rimuovere delicatamente i vetrini dalla soluzione lisante. Posizionare i vetrini uno accanto all'altro su una vaschetta elettroforetica orizzontale vicino a un'estremità, facendoli scivolare il più vicino possibile tra loro.Riempire i serbatoi del tampone con un tampone elettroforetico appena preparato, con pH superiore a 13. Si noti che la procedura qui dimostrata è destinata all'elettroforesi. In condizioni alcaline con pH superiore a 13, riempire i serbatoi del tampone fino a quando il livello del liquido copre completamente i vetrini.Evitare bolle sopra gli aros. Lasciare il vetrino nel tampone alcalino per 20 minuti per consentire lo svolgimento del DNA e l'espressione dei danni da lesioni alcaline. Dopo 20 minuti, accendere l'alimentatore a 25 volt e regolare la corrente a 300 milliampere aumentando o abbassando il livello del tampone.Eseguire l'elettroforesi per 30 minuti. Dopo 30 minuti, spegnere l'alimentazione. Sollevare delicatamente i vetrini dal tampone e posizionarli su un vassoio di drenaggio, applicando in modo goccia a goccia un tampone di neutralizzazione sui vetrini.Lasciare levetine a riposo per almeno cinque minuti. Svuotare le vetrine e ripetere il trattamento con tampone di neutralizzazione altre due volte. Successivamente, colorare le vetrine con un millilitro di bromuro di etidio 1x per cinque minuti.Indossare guanti protettivi poiché il bromuro di etidio è un noto carcinogeno. Dopo cinque minuti, immergere i vetrini in acqua distillata fredda per rimuovere qualsiasi eccedenza di colorante. Quindi posizionare un coprioggetto su ciascun vetrino.Conservare immediatamente i vetrini. I vetrini colorati possono essere conservati per un mese a quattro gradi Celsius in condizioni asciutte. Per visualizzare e valutare il danno al DNA, osservare il vetrino di DNA colorato con bromuro di ateridio al microscopio fluorescente con obiettivo 40x.Impostare lo strumento automatico che esamina al microscopio, scansiona il vetrino e fotografa le cellule nel saggio della cometa. Il danno al DNA è stato valutato quantitativamente nelle cellule misurando la lunghezza della migrazione del DNA e la percentuale di DNA migrato. La freccia nera indica una cometa tipica con una testa luminosa e una coda.La testa è composta da DNA integro e non danneggiato, mentre la coda è composta da frammenti di DNA più piccoli e danneggiati. Sebbene il saggio COMET produca risultati riproducibili, può essere influenzato da diversi fattori, come ad esempio se il saggio viene eseguito su leucociti appena preparati. In questo grafico, il momento della coda è definito come il prodotto tra la lunghezza della coda e la coda stessa.La percentuale di DNA del gruppo due di leucociti, che erano stati crioconservati prima della lisi e dell'elettroforesi, presenta un numero significativamente maggiore di rotture del DNA a singolo filamento rispetto ai leucociti del gruppo uno appena preparati. Questo saggio può essere utilizzato anche per valutare indirettamente lo stress ossidativo sistemico. In questo caso, il momento oliva rappresenta il prodotto tra la percentuale di DNA totale presente nella coda e la distanza tra i centri di massa delle regioni della testa e della coda.I risultati ottenuti da fumatori e soggetti sani appaiati per età e sesso rivelano che fumare mezzo pacchetto di sigarette al giorno più che raddoppia il numero di rotture del DNA a singolo filamento nei leucociti circolanti. Una volta padroneggiata, questa tecnica presenta diversi vantaggi, tra cui il costo relativamente basso, il ridotto numero di cellule e quindi la piccola quantità di campione di sangue richiesta per paziente, nonché il periodo di tempo relativamente breve necessario per quantificare i danni al DNA nelle cellule.

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Il video mostra il test della cometa per rilevare danni al DNA in seguito all'esposizione ad agenti nocivi. In condizioni alcaline, il DNA si srotola e si denatura, e dopo l'elettroforesi, il DNA integro e danneggiato migra in modo diverso nel gel di agarosio, formando una struttura a forma di cometa. Il DNA intatto che migra lentamente forma la testa circolare della cometa, mentre i frammenti di DNA danneggiati che migrano rapidamente formano la coda allungata della cometa.

Saggio della cometa per il rilevamento del danno al DNA nelle cellule

Questo video mostra il test delle sostanze reattive all'acido tiobarbiturico (TBARS) per valutare lo stress ossidativo in campioni biologici.

Dosaggio delle sostanze reattive all'acido tiobarbiturico per valutare lo stress ossidativo nel siero umano

Il test della cometa è un modo efficiente di rilevare rotture a singolo e doppio filamento, compresi alcali-labili siti e DNA-DNA/DNA-protein legami incrociati sul DNA in tutte le cellule, compresi i neuroni dell'ippocampo. Il metodo sfrutta la migrazione differenziale di DNA in un campo elettrico dovuto a differenze nelle quantità di danno al DNA.

Il saggio danneggiare il DNA in neuroni ippocampali Utilizzo del Comet Assay

Descriviamo qui una piattaforma che consente di rilevare test della cometa di danno al DNA con velocità senza precedenti. Il dispositivo modelli di cellule di mammifero in un microarray e consente l'elaborazione parallela di 96 campioni. L'approccio facilita l'analisi del danno al DNA livello di base, danno al DNA indotto da esposizione e di riparazione del DNA cinetica.

CometChip: A High-throughput di 96-Well Piattaforma per la misurazione dei danni cagionati DNA in cellule umane Microarrayed

Il test della cometa alcalina misura le rotture del filamento di DNA nelle cellule eucariotiche. Aggiungendo una fase di digestione dell'endonucleasi III o dell'8-ossoguanina-DNA-N-glicosilasi umana, il test è in grado di rilevare in modo efficiente il danno ossidativo al DNA. Descriviamo i metodi per utilizzare questi saggi per rilevare il danno al DNA nel fegato di ratto.

In Vivo alcalina Comet Assay e l&#39;enzima modificato alcalina Comet Assay per la misurazione rotture del DNA Strand e danno ossidativo del DNA in fegato di ratto

Il test della cometa è un metodo efficace per rilevare danni al DNA compreso singolo e doppio filamento di DNA si rompe. Descriviamo la cometa alcalino e neutro saggi per misurare il danno del DNA in cellule di cancro per valutare l'effetto terapeutico della chemioterapia.

Valutazione In Vitro del DNA danni utilizzando test della cometa

Questo protocollo descrive diverse procedure per la preparazione di campioni di tessuto congelato di alta qualità al momento della necroscopia per l'uso nel saggio della cometa per valutare il danno al DNA: 1) tessuto macinato, 2) cellule epiteliali raschiate dal tratto gastrointestinale e 3) tessuto immatolato campioni, richiedendo l'omogeneizzazione utilizzando un dispositivo di mincing dei tessuti.

Uso di tessuto congelato nel saggio Cometa per la valutazione del danno del DNA

Il saggio della cometa è un mezzo popolare per rilevare danni al DNA. Questo studio descrive un approccio per eseguire diapositive in varianti rappresentative del saggio della cometa. Questo approccio ha aumentato significativamente il numero di campioni diminuendo il tempo di esecuzione del test, il numero di manipolazioni dei vetrini e il rischio di danni ai gel.

Un approccio di analisi delle comete ad alto rendimento per la valutazione del danno al DNA cellulare

Questo protocollo descrive un metodo efficace per quantificare la differenza nel danno al DNA indotto da inibitori di tipo I e di tipo II nelle cellule mutanti FLT3 attraverso l'applicazione del saggio della cometa.

Saggio della cometa per quantificare il danno al DNA nelle cellule 32D che esprimono mutanti FLT3 dopo l'esposizione a inibitori FLT3 di tipo I e II

Abbiamo sviluppato il Visual-Motor risposta per quantificare la potenza del motore di zebrafish larvale in risposta alla luce incrementi e decrementi. Abbiamo anche esaminato visione zebrafish mutanti, tra cui la non optocinetico risposta (NRC) mutanti, che si pensava essere completamente cieco quando testato da un altro saggio di visione, il riflesso optocinetica.

Un test per misurare capacità di risposta comportamentale di Zebrafish a variazioni di intensità di luce

Impara l'assay COMET per misurare indirettamente lo stress ossidativo sistemico usando leucociti isolati da sangue umano. Questo metodo semplice e affidabile quantifica i danni al DNA mediante microscopia a fluorescenza.

Comet Assay come una misura indiretta della sistemica Stress ossidativo

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